Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T19:14:45Z : No. of bitstreams: 1 beraldo_lg_me_jabo.pdf: 244325 bytes, checksum: 15240886360c5cf0af075b2ef7715ab7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli shigatoxigênica (STEC) estão implicadas em causar sérias doenças no homem. Devido o crescimento da produção de búfalos leiteiros e a pequena quantidade de estudos sobre a prevalência de STEC e EPEC em bubalinos esse trabalho foi proposto. Os objetivos foram: determinar a prevalência de STEC e EPEC de amostras de origem bubalina através da pesquisa dos genes stx1, stx2, eae, iha, efa1, toxB, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, lpfAO113, saa, ehxA e bfp; caracterização bioquímica e sorogrupagem dos isolados e o perfil de resistência das estirpes de STEC e EPEC isoladas frente a diferentes drogas antimicrobianas. Foram isoladas 33 estirpes de E. coli, das quais 21 (63,6%) STEC e 12 (36,4%) EPEC, que apresentaram 23 perfis genéticos diferentes. Todos os isolados apresentaram mais de um gene de virulência. De todos os genes estudados apenas o bfp não foi encontrado nas amostras analisadas. As estirpes isoladas apresentaram sensibilidade a maioria dos antimicrobianos testados. O sorogrupo mais freqüente foi o O26, seguido do O157. As estirpes estudadas apresentaram genes de virulência que estão relacionados à graves doenças no homem. Pelos resultados pode-se dizer que búfalos são importantes reservatórios de STEC e EPEC e a presença desses isolados com determinados perfis genéticos devem ser melhor estudados / Escherichia coli (EPEC) and Shiga toxin Escherichia coli (STEC) are implicated in causing serious disease in humans. Due to the increased production of buffalo milk and small amount of studies on the prevalence of STEC and EPEC in buffalo this work was proposed. The objectives were to determine the prevalence of STEC and EPEC isolates from buffalo by investigating the genes stx1, stx2, eae, iha, efa1, toxB, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, lpfAO113, saa, ehxA and bfp; sorogrupagem and biochemical characterization of isolates and resistance profile of strains of EPEC and STEC isolates to different antimicrobial drugs. We isolated 33 strains of E. coli, of which 21 (63.6%) STEC and 12 (36.4%) EPEC, showed that 23 different genetic profiles. All isolates had more than one virulence gene. All of the genes studied only the bfp was not found in the samples. The strains isolated were sensitive to most antimicrobials tested. The serogroup O26 was the most common, followed by O157. The strains were virulence genes that are related to severe disease in humans. From the results we can say that buffaloes are major reservoirs of STEC and EPEC and the presence of strains with certain genetic profiles should be better studied

Salmonella do grupo paratifóide é responsável por toxi-infecção alimentar no homem, veiculada por alimentos contaminados. Este estudo determinou o perfil genotípico de nove amostras de S. Typhimurium, a sua patogenicidade, assim como sua capacidade de colonização e invasão em aves SPF. Verificou-se pela análise dos genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP ou spvC em amostras de Salmonella Typhimurium que todas foram negativas para os genes sopE1 ou spvC. O gene cdtB estava presente em apenas uma amostra (11,11%) e o gene pefA em duas amostras (22,22%). O gene sefC foi encontrado em três amostras (33,33%). Em oito amostras (88,88%) os genes agfA, fimA, lpfC ou sptP estiveram presentes. Os genes avrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC ou slyA ou sopB estiveram presentes em 100% das amostras analisadas. Determinou-se quatro perfis genotípicos. No ensaio de patogenicidade observou-se que as amostras inoculadas por via oral, não causaram mortalidade de pintinhos SPF de um dia de idade, com a exceção da amostra SA 633 e SA 006 que apresentaram 30 e 10%, respectivamente. No entanto, observou-se que a infecção por via subcutânea provocou uma maior mortalidade de pintinhos, sendo que as amostras SA 003, SA 004, SA 005 e a amostra vacinal mostraram somente 10% de mortalidade, a amostra SA 002 30%, as amostras SA 632 e SA 634 70% e a amostra SA 633 100%. A amostra SA 006 não provocou nenhuma mortalidade. A amostra mais patogênica pela via subcutânea foi a SA 633. O ensaio de colonização foi realizado em pintinhos SPF, com as amostras SA 002, SA 003, SA 004, SA 005, SA 006, SA 632, SA 633, SA 634 e amostra vacinal. Verificou-se ausência de invasão no fígado e baço 24 horas pós- infecção, exceto para as amostras SA 632 (30%) e amostra vacinal (20%). Após sete dias da infecção houve invasão em dois pintinhos com a amostra SA 002 e um pintinho com as amostras SA 004 e SA 005. Apenas na amostra SA 632 constatou-se colonização em ceco após 24 horas em 10% das amostras e após 7 dias em 70% pós-infecção. Concluiu-se que entre as amostras de Salmonella Typhimurium analisadas existiam diferentes perfis genotípicos baseando-se na presença ou ausência de genes de virulência, e que a amostra vacinal assemelha-se a amostras de S. Typhimurium estudadas quanto a presença dos genes. Os resultados do teste de patogenicidade das amostras de ST indicaram que a via de inoculação modifica a patogenicidade de uma mesma amostra e que a mortalidade após a inoculação pela via subcutânea é sempre superior que pela via oral. / Parathyphoid Salmonella are major food-borne pathogens spread by contaminated food products. This study determined the genotypic profile of nine samples of S. Typhimurium, pathogenicity, colonization and invasion in SPF chicks. It was found by analysis of genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP or spvC samples of S. Typhimurium all were negative to sopE1 or spvC. The cdtB gene was identified in one sample and pefA gene in two samples (22,22%). Sef C gene was detected in three samples (33,33%). In eight samples (88,88%) agfA, fimA, lpf or sptP were detected. AvrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA and sopB were detected in all samples evaluated. Four genotypic profiles were established. Pathogenicity tests showed that samplesinoculated by oral gavage did not present mortality in one day old SPF chicks, except samples SA 633 and SA006 with 30 and 10%, respectively. However, it was observed that subcutaneous inoculation showed high mortality in SPF chicks than oral inoculation, and samples SA 003, SA004, SA005 and vaccinal strain showed 10% of mortality, 30% for sample SA002, 70% in the samples SA632 and SA 634 and 100% when the sample SA 633 was inoculated. No mortality was observed in sample SA006. Colonization test was performed in SPF chicks using the samples: SA002, SA 003, SA 004, SA005, SA006, SA 632, SA 633, SA 634 and vaccinal strain. The more pathogenic strain subcutaneously was the SA 633. There was not invasion in liver and spleen 24 hours p.i., except for sample SA 632 (30%) and vaccinal strain (20%). Seven days p.i. invasion was detected in two chicks inoculated with samples identified as SA 004 and SA 005. Sample SA 632 showed 10% of cecal colonization 24 hours p.i. and 70% after one week p.i. It was concluded that Salmonella Typhimurium strains including the vaccinal strain, showed different genotypical profiles, based on the presence or absence of genes of virulence genes. The results of the pathogenicity test indicated that inoculation route modify the pathogenicity of the same strain, and the mortality post-inoculation was always higher in chicks inoculated by subcutaneous route when compared to the oral route.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T18:31:28Z : No. of bitstreams: 1 borges_ca_me_jabo.pdf: 259288 bytes, checksum: aee47e190d42e2e6677cc13511880fb0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Escherichia coli destaca-se entre os principais patógenos de importância na suinocultura e saúde pública e apresenta diversos patótipos, caracterizados pela presença de diferentes fatores de virulência. Os objetivos deste trabalho foram detectar genes de virulência e determinar a sua freqüência, bem como caracterizar o perfil de resistência às drogas antimicrobianas de estirpes de E. coli shigatoxigênica (STEC) e enteropatogênica (EPEC) isoladas de fezes e carcaças de suínos abatidos na região de Ribeirão Preto - SP. Esse estudo foi conduzido com 226 amostras de fezes e 215 amostras de carcaça de suínos colhidas de três diferentes abatedouros. As estirpes isoladas foram submetidas ao teste bioquímico para confirmação da espécie, teste de suscetibilidade a antimicrobianos, teste para determinação dos sorogrupos e PCR para detecção dos genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, toxB, iha e bfp, foram isolados 3,4% de EPEC e 0,2% de STEC. Os fatores de virulência foram encontrados em quatro diferentes combinações: eae + lpfAO113 (1,6%); eae (1,4%); eae + toxB + lpfAO157/OI-141 + ehxA (0,4%) e stx2 (0,2%). Não houve isolados positivos para os genes lpfAO157/OI-154, saa, efa1, iha e bfp. Todos os isolados foram sensíveis à nitrofurantoína e 93,75% resistentes à tetraciclina. Os resultados mostraram que amostras provenientes de suínos da região de Ribeirão Preto-SP apresentaram E. coli que contêm genes de virulência associados a STEC e EPEC. Esse fato é um alerta para que esses animais sejam monitorados, pois podem ser potenciais reservatórios de STEC e EPEC causadoras de doenças em humanos / Escherichia coli stands out among the main pathogens of importance to the swine industry and public health and presents several pathotypes characterized by the presence of different virulence factors. The aims of this study were to determine the frequency, detect virulence genes and characterize the resistance profile to antimicrobial drugs of Shiga toxigenic Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains isolated from feces and carcasses of pigs slaughtered in the region of Ribeirão Preto – SP. This research was carried out with 226 fecal samples and 215 carcasses samples from swine collected from three different slaughterhouses. The strains isolated were submitted to antimicrobial susceptibility test, biochemical test to confirm the specie, test to determine the serogroups and PCR for detection of genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, toxB, iha and bfp, 0,2% of STEC and 3,4% of EPEC were isolated. The virulence factors were found in four different combinations: eae + lpfAO113 (1,6%); eae (1,4%); eae + toxB + lpfAO157/OI-141 + ehxA (0,4%) and stx2 (0,2%). There were no positive isolate for genes lpfAO157/OI-154, saa, efa1, iha and bfp. All isolates were susceptible to nitrofurantoin and 93.7% resistant to tetracycline. The results showed that samples from swines in the region of Ribeirão Preto have E. coli containing virulence genes associated with EPEC and STEC strains. This fact is a warning that these animals should be monitored because they can be potencial reservoirs of STEC and EPEC that cause disease in human

Resumo: Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli shigatoxigênica (STEC) estão implicadas em causar sérias doenças no homem. Devido o crescimento da produção de búfalos leiteiros e a pequena quantidade de estudos sobre a prevalência de STEC e EPEC em bubalinos esse trabalho foi proposto. Os objetivos foram: determinar a prevalência de STEC e EPEC de amostras de origem bubalina através da pesquisa dos genes stx1, stx2, eae, iha, efa1, toxB, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, lpfAO113, saa, ehxA e bfp; caracterização bioquímica e sorogrupagem dos isolados e o perfil de resistência das estirpes de STEC e EPEC isoladas frente a diferentes drogas antimicrobianas. Foram isoladas 33 estirpes de E. coli, das quais 21 (63,6%) STEC e 12 (36,4%) EPEC, que apresentaram 23 perfis genéticos diferentes. Todos os isolados apresentaram mais de um gene de virulência. De todos os genes estudados apenas o bfp não foi encontrado nas amostras analisadas. As estirpes isoladas apresentaram sensibilidade a maioria dos antimicrobianos testados. O sorogrupo mais freqüente foi o O26, seguido do O157. As estirpes estudadas apresentaram genes de virulência que estão relacionados à graves doenças no homem. Pelos resultados pode-se dizer que búfalos são importantes reservatórios de STEC e EPEC e a presença desses isolados com determinados perfis genéticos devem ser melhor estudados / Abstract: Escherichia coli (EPEC) and Shiga toxin Escherichia coli (STEC) are implicated in causing serious disease in humans. Due to the increased production of buffalo milk and small amount of studies on the prevalence of STEC and EPEC in buffalo this work was proposed. The objectives were to determine the prevalence of STEC and EPEC isolates from buffalo by investigating the genes stx1, stx2, eae, iha, efa1, toxB, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, lpfAO113, saa, ehxA and bfp; sorogrupagem and biochemical characterization of isolates and resistance profile of strains of EPEC and STEC isolates to different antimicrobial drugs. We isolated 33 strains of E. coli, of which 21 (63.6%) STEC and 12 (36.4%) EPEC, showed that 23 different genetic profiles. All isolates had more than one virulence gene. All of the genes studied only the bfp was not found in the samples. The strains isolated were sensitive to most antimicrobials tested. The serogroup O26 was the most common, followed by O157. The strains were virulence genes that are related to severe disease in humans. From the results we can say that buffaloes are major reservoirs of STEC and EPEC and the presence of strains with certain genetic profiles should be better studied / Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Coorientador: Everlon Cid Rigobelo / Banca: José Moacir Marin / Banca: Antonio José Piantino Ferreira / Mestre

Salmonella do grupo paratifóide é responsável por toxi-infecção alimentar no homem, veiculada por alimentos contaminados. Este estudo determinou o perfil genotípico de nove amostras de S. Typhimurium, a sua patogenicidade, assim como sua capacidade de colonização e invasão em aves SPF. Verificou-se pela análise dos genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP ou spvC em amostras de Salmonella Typhimurium que todas foram negativas para os genes sopE1 ou spvC. O gene cdtB estava presente em apenas uma amostra (11,11%) e o gene pefA em duas amostras (22,22%). O gene sefC foi encontrado em três amostras (33,33%). Em oito amostras (88,88%) os genes agfA, fimA, lpfC ou sptP estiveram presentes. Os genes avrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC ou slyA ou sopB estiveram presentes em 100% das amostras analisadas. Determinou-se quatro perfis genotípicos. No ensaio de patogenicidade observou-se que as amostras inoculadas por via oral, não causaram mortalidade de pintinhos SPF de um dia de idade, com a exceção da amostra SA 633 e SA 006 que apresentaram 30 e 10%, respectivamente. No entanto, observou-se que a infecção por via subcutânea provocou uma maior mortalidade de pintinhos, sendo que as amostras SA 003, SA 004, SA 005 e a amostra vacinal mostraram somente 10% de mortalidade, a amostra SA 002 30%, as amostras SA 632 e SA 634 70% e a amostra SA 633 100%. A amostra SA 006 não provocou nenhuma mortalidade. A amostra mais patogênica pela via subcutânea foi a SA 633. O ensaio de colonização foi realizado em pintinhos SPF, com as amostras SA 002, SA 003, SA 004, SA 005, SA 006, SA 632, SA 633, SA 634 e amostra vacinal. Verificou-se ausência de invasão no fígado e baço 24 horas pós- infecção, exceto para as amostras SA 632 (30%) e amostra vacinal (20%). Após sete dias da infecção houve invasão em dois pintinhos com a amostra SA 002 e um pintinho com as amostras SA 004 e SA 005. Apenas na amostra SA 632 constatou-se colonização em ceco após 24 horas em 10% das amostras e após 7 dias em 70% pós-infecção. Concluiu-se que entre as amostras de Salmonella Typhimurium analisadas existiam diferentes perfis genotípicos baseando-se na presença ou ausência de genes de virulência, e que a amostra vacinal assemelha-se a amostras de S. Typhimurium estudadas quanto a presença dos genes. Os resultados do teste de patogenicidade das amostras de ST indicaram que a via de inoculação modifica a patogenicidade de uma mesma amostra e que a mortalidade após a inoculação pela via subcutânea é sempre superior que pela via oral. / Parathyphoid Salmonella are major food-borne pathogens spread by contaminated food products. This study determined the genotypic profile of nine samples of S. Typhimurium, pathogenicity, colonization and invasion in SPF chicks. It was found by analysis of genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP or spvC samples of S. Typhimurium all were negative to sopE1 or spvC. The cdtB gene was identified in one sample and pefA gene in two samples (22,22%). Sef C gene was detected in three samples (33,33%). In eight samples (88,88%) agfA, fimA, lpf or sptP were detected. AvrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA and sopB were detected in all samples evaluated. Four genotypic profiles were established. Pathogenicity tests showed that samplesinoculated by oral gavage did not present mortality in one day old SPF chicks, except samples SA 633 and SA006 with 30 and 10%, respectively. However, it was observed that subcutaneous inoculation showed high mortality in SPF chicks than oral inoculation, and samples SA 003, SA004, SA005 and vaccinal strain showed 10% of mortality, 30% for sample SA002, 70% in the samples SA632 and SA 634 and 100% when the sample SA 633 was inoculated. No mortality was observed in sample SA006. Colonization test was performed in SPF chicks using the samples: SA002, SA 003, SA 004, SA005, SA006, SA 632, SA 633, SA 634 and vaccinal strain. The more pathogenic strain subcutaneously was the SA 633. There was not invasion in liver and spleen 24 hours p.i., except for sample SA 632 (30%) and vaccinal strain (20%). Seven days p.i. invasion was detected in two chicks inoculated with samples identified as SA 004 and SA 005. Sample SA 632 showed 10% of cecal colonization 24 hours p.i. and 70% after one week p.i. It was concluded that Salmonella Typhimurium strains including the vaccinal strain, showed different genotypical profiles, based on the presence or absence of genes of virulence genes. The results of the pathogenicity test indicated that inoculation route modify the pathogenicity of the same strain, and the mortality post-inoculation was always higher in chicks inoculated by subcutaneous route when compared to the oral route.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes a variety of virulence factors to infect a wide range of hosts. Virulence genes in this organism are many times controlled by two-component regulatory systems consisting of a sensor histidine kinase and a response regulator giving them high importance in research. Orphan response regulators consist of genes that have been proposed to be a response regulator but have not been studied to determine if they do work in a two-component regulatory system or not. Investigating these orphan response regulators could potentially lead to the finding of another regulator of virulence genes. Non-polar deletions were designed using splicing of genomic segments by overlapping extension. A variety of phenotypic assays, liquid-killing assays with the nematode C. elegans, and virulence assays with macrophages were utilized to determine if these orphans were different from the wild-type strain PAO1. If attenuated, these genes can be further studied to find new and novel regulators of virulence in Pseudomonas aeruginosa.

O controle da contaminação de alimentos por Listeria monocytogenes é um desafio para a indústria, pois a bactéria é tolerante a muitas condições adversas que são empregadas para conservação de alimentos. L. monocytogenes é uma bactéria patogênica e pode causar doença de natureza não entérica grave, em pessoas imunocomprometidas, idosas e durante a gestação. No presente estudo foi avaliada a expressão gênica de duas linhagens L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a mais comumente isoladas de alimentos e L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b mais comumente encontradas em surtos hospitalares, utilizando caldos modelos formulados a partir de extratos de carne e peptona de peixe, suplementados ou não com glicose, cloreto de sódio, orégano, pimenta do reino e uma mistura desses ingredientes. Os caldos modelos formulados e suplementados ou não com os ingredientes foram incubados por 1 hora a 25ºC e em seguida, foi realizada extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA). O cDNA foi amplificado e quantificado por PCR em tempo real, com primers para os genes alvos prfA, inlA, actA e hly, que codificam respectivamente o fator regulador positivo, internalina A, actina e hemolisina, relacionados à virulência desta bactéria. L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a cultivada em caldo de carne acrescido de glicose diminuiu a expressão de prfA, actA e hly, enquanto que em caldo de peixe acrescido do mesmo ingrediente, foi observada maior expressão para os genes inlA, actA e hly. Nos caldos de carne acrescidos de cloreto de sódio houve aumento da expressão de hly em L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, mas o mesmo ingrediente causou redução da expressão dos genes inlA, actA e hly em L. monocytogenes IAL 633. Em caldo de peixe adicionado de cloreto de sódio, houve concordância no efeito observado para as duas culturas de L. monocytogenes avaliadas, com menor expressão dos genes inlA e prfA. Com pimenta do reino em caldo carne foi observado aumento da expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115 e redução dos genes prfA, inlA, actA e hly para L. monocytogenes IAL 633. Já em caldo de peixe acrescido de pimenta do reino, a modulação gênica ocorreu somente para L. monocytogenes ATCC 19115, com redução do gene prfA e aumento inlA e actA. O orégano foi o ingrediente que mais afetou a expressão gênica de L. monocytogenes nas condições estudadas, com aumento da expressão de actA em caldo de carne e redução de hly, para L. monocytogenes ATCC 19115. Em contrapartida, para L. monocytogenes IAL 633 ocorreu a repressão dos mesmos genes e também de inlA e prfA, enquanto que em caldo de peixe ocorreu redução somente para o gene prfA. Ainda, em caldo de peixe acrescido de orégano foi observado redução da expressão dos genes prfA e inlA, porém aumento na expressão de actA e hly para L. monocytogenes ATC 19115. A combinação de todos os condimentos também afetou a expressão gênica, sendo que em caldo de carne houve aumento da expressão dos genes prfA e inlA, porém foi reduzida a expressão de actA para L. monocytogenes ATCC 19115. Para a mesma linhagem (ATCC 19115), em caldo de peixe ocorreu a redução da expressão dos genes prfA, inlA e actA. L. monocytogenes IAL 633 em caldo de carne com a mistura de ingredientes teve reduzida a expressão dos genes inlA e actA, essa redução também foi detectada em caldo de peixe para o gene prfA. No presente estudo foi possível observar uma repressão de todos os genes alvos estudados para L. monocytogenes IAL 633 sorotipo 1/2a quando incubada em caldo de carne suplementado com os diferentes ingredientes, mas o mesmo padrão não foi observado para L. monocytogenes ATCC 19115 sorotipo 4b, indicando a complexidade da expressão gênica em função dos componentes de alimentos. / The control of food contamination by Listeria monocytogenes is a challenge for the industry because the bacterium is tolerant to many adverse conditions applied in food preservation. L. monocytogenes can cause serious non-enteric disease in immunocompromised persons, in the elderly and during pregnancy. In the present study it was evaluated the gene expression of two strains, L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a (most commonly isolated from food) and Listeria monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b (more common in clinical cases). Model broths were prepared with meat extract and fish peptone, supplemented or not with glucose, sodium chloride, oregano, black pepper and a mixture of these ingredients. The formulated model broths supplemented or not with the ingredients were incubated for 1 hour at 25° C and next, RNA extraction was performed and complementary DNA (cDNA) was synthesized. The cDNA was amplified and quantified by Real Time PCR with primers for the target genes: positive regulatory factor (prfA), internalin A (inlA), actin (actA) and hemolysin (hly). L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a grown in meat broth plus glucose decreased expression prfA, actA and hly, while in fish broth, increased expression was observed for inlA, hly, and actA genes. In meat broth added sodium chloride, increased hly expression was observed for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b but the same ingredient caused a decrease of the expression of genes inlA and hly in L. monocytogenes IAL 633. In fish broth added sodium chloride, for the two cultures of L. monocytogenes evaluated there was a lower expression of inlA and prfA gene in comparison with the control. With meat broth containing black pepper, it was observed an increased actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115 and lower expression of prfA, inlA, actA gene; for L. monocytogenes IAL 633 lower expression of hly was observed in this broth formulation. In fish gravy plus black pepper, modulation of gene expression occurred only in L. monocytogenes ATCC 19115 that showed decrease for prfA and increase for inlA and actA. Oregano was the ingredient that affected most the gene expression of L. monocytogenes under the conditions studied, with increased actA expression in broth and hly reduction for L. monocytogenes ATCC 19115. However, for L. monocytogenes IAL 633 there was repression of the inlA and prfA genes, in fish stock was reduced only for prfA gene. Also in fish stock plus oregano was observed reduction of prfA and inlA genes, but increased expression of the actA and hly for L. monocytogenes ATC 19115. The combination of all the condiments also caused different effects on gene expression, and in broth increased the expression of genes prfA and inlA, but reduced the actA expression for L. monocytogenes ATCC 19115, for the same strain (ATCC 19115) broth fish was a reduction of prfA, inlA and actA genes. L. monocytogenes IAL 633 in broth with the mixture of ingredients reduced the expression of inlA and actA genes, this reduction were also seen in fish broth for the prfA gene. L. monocytogenes has complexity of the modulation of the expression of virulence factors in food, but in the present study it was possible to observe a repression in the modulation pattern of all target genes studied L. monocytogenes IAL 633 serotype 1/2a when incubated in broth supplemented with different ingredients, which did not occur for L. monocytogenes ATCC 19115 serotype 4b.