ABREU, L. R. Identificação e caracterização do potencial probiótico de bactérias isoladas do leite e queijo caprino. 2015. 103 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2015. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-18T12:26:46Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_lrabreu.pdf: 2097758 bytes, checksum: 4ce82f5a4a2eb4d27f7291c9ce61a20e (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-10-18T12:38:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_lrabreu.pdf: 2097758 bytes, checksum: 4ce82f5a4a2eb4d27f7291c9ce61a20e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-18T12:38:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_lrabreu.pdf: 2097758 bytes, checksum: 4ce82f5a4a2eb4d27f7291c9ce61a20e (MD5) Previous issue date: 2015 / The search for new bacteria with functional properties has been the focus of intense research in recent decades. Several species of Lactobacillus gender are known as probiotic and are added in foods. To be selected as a probiotic bacteria, it need to present certain characteristics, as capacity to survive the gastrointestinal conditions and be free of pathogenic. The aim of this study was to isolate, identify and select strains of Lactobacillus from goat milk and cheese, and evaluate its potential probiotic and its safety through the identification of related genes with beneficial characteristics and risks for human consumption, checking its in vitro expression. Were identified twenty-three different strains of Lactobacillus plantarum and added to study other four strains of L. plantarum and three Lactobacillus mucosae. The thirty strains were evaluated for the presence of genes related to probiotic properties as bsh gene, coding for the enzyme bile salt hydrolase, the msa, related to capacity of adhesion to intestinal epithelium induced by mannose, three other genes map, mub and ef-tu associated the mucus adhesion properties. The bsh and msa gene had their expression evaluated in vitro, by means of biochemical tests deconjugation of bile salts and addition of yeast, respectively. The results show that 80% of the strains were able to survive in the presence of bile salts and 76% were able to deconjugate at least one of the four salts tested. As for the adhesion capacity, four strains show a positive result, and three of them confirmed interactinon via mannose. Still evaluating adhesion properties, only two strains have a high hydrophobicity value in the cell suface, property that has been linked indirectly to the ability to adhere to the intestinal mucosa, and 90% from these strains have a genetic profile favorable for binding to the intestinal mucosa, with three of the four genes adherence evaluated. The safety of the microorganisms was also evaluated for the presence and expression of the thirteen genes related to virulence factors, including resistance to antibiotics and production of biogenic amines. The expression of genes associated with the production of gelatinase (gelE), and tyrosine amines (TDC) and histamine (hdc1 and hdc2) and resistance to vancomycin (vanA and vanB) was investigated by means of biochemical tests. Although some strains amplify the gelE gene it did not show in vitro expression. Was verified in vitro resistance to vancomycin, very common among lactobacilli, also observed in strains that did not amplify the genes vanA and vanB. With respect to production of biogenic amines, only the tdc gene for tyrosine was detected in strains, one of the genes with the greatest percentage of amplification. However, only one strain that presented the gene had its expression confirmed in vitro test using descarboxilação medium, while some strains that do not amplify the gene had positive results in vitro. Fourteen isolated did not amplified genes related to virulence. Of these, only the Lactobacillus plantarum Q24 strain showed no expression in vitro related to virulence factor, in addition to amplify three of the genes related to adherence to mucus, and have survived and disconjugate two of bile salts evaluated, showing be the most promising to pursue studies potential of probiotic research. / A busca por novas bactérias com propriedades funcionais tem sido foco de intensa pesquisa nas últimas décadas. Diversas espécies do gênero Lactobacillus já são conhecidas como probióticas e são adicionadas em alimentos. Para uma cultura bactériana ser selecionada como probiótica é preciso apresentar determinadas características, como a capacidade de sobreviver às condições gastrointestinais e ser livre de patogenicidade. O objetivo desse estudo foi isolar, selecionar e identificar cepas de lactobacilos a partir de leite e queijo de cabra, e avaliar seu potencial probiótico e sua inocuidade através da identificação de genes relacionados às características benéficas e de riscos para o consumo humano, verificando sua expressão in vitro. Foram identificados vinte e três cepas diferentes de Lactobacillus plantarum e adicionadas ao estudo outras quatro cepas de L. plantarum e três Lactobacillus mucosae previamente isoladas. As vinte e nove cepas foram avaliadas quanto à presença de genes relacionados a propriedades probióticas como o gene bsh, codificante para a enzima hidrolase de sais biliares, msa, relacionado à capacidade de adesão ao epitélio intestinal induzido por manose e outros três genes, map, mub e ef-tu associados às propriedades de adesão ao muco. Os genes bsh e msa tiveram sua expressão avaliada in vitro, por meio de testes bioquímicos de desconjugação de sais biliares e agregação de leveduras, respectivamente. Os resultados mostraram que 80% das cepas testadas foram capazes de sobreviver em presença dos sais biliares e 76% foram capazes de desconjugar pelo menos um dos quatro sais testados. Quanto à capacidade de adesão, quatro cepas apresentaram resultado positivo, sendo para três delas confirmada interação via manose. Ainda com relação às propriedades de adesão, apenas duas cepas apresentaram um alto valor de hidrofobicidade da superfície celular, propriedade que tem sido associada indiretamente a essa capacidade, e 90% das cepas estudadas mostraram um perfil genético favorável à ligação à mucosa intestinal, apresentando três dos quatro genes de adesão avaliados. A inocuidade desses microrganismos também foi avaliada quanto à presença e expressão de doze genes relacionados a fatores de virulência, incluindo a resistência a antimicrobianos e produção de aminas biogênicas. A expressão de genes associados à produção de gelatinase (gelE), e das aminas tirosina (tdc) e histamina (hdc1 e hdc2), bem como à resistência à vancomicina (vanA e vanB) foi investigada por meio de testes bioquímicos. Apesar de algumas cepas amplificarem o gene gelE, este não apresentou expressão in vitro. Foi constatada in vitro resistência à vancomicina, muito comum entre lactobacilos, sendo observado também em cepas que não amplificaram os genes vanA e vanB. Com relação à produção de aminas biogênicas, apenas o gene tdc para tirosina foi detectado nas cepas, sendo um dos genes com maior frequência de amplificação entre as cepas. No entanto, apenas uma cepa que apresentou o gene teve sua expressão confirmada no teste in vitro utilizando meio de descarboxilação, enquanto que algumas cepas que não amplificaram o gene obtiveram resultado positivo in vitro. Quatorze isolados não amplificaram genes relacionados à virulência. Destas, apenas a cepa Lactobacillus plantarum Q24 não apresentou expressão in vitro relacionada a fator de virulência, além de amplificar três dos genes relacionados à adesão ao muco, e de ter sobrevivido e desconjugado dois dos sais biliares avaliados, mostrando ser a mais promissora para se prosseguir com os estudos de investigação do potencial probiótico.

RODRIGUES, Terezinha de Jesus Santos. Cepas do complexo Candida parapsilosis de origem animal : classificação taxonômica, sensibilidade antifúngica e atributos de virulência in vitro. 2013 .41 f. Dissertação (Mestrado em Microbiliologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-03-07T15:19:20Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_tjsrodrigues.pdf: 627956 bytes, checksum: 19ceecd82882c4a35b1f917867db26b3 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-03-07T15:27:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_tjsrodrigues.pdf: 627956 bytes, checksum: 19ceecd82882c4a35b1f917867db26b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-07T15:27:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_tjsrodrigues.pdf: 627956 bytes, checksum: 19ceecd82882c4a35b1f917867db26b3 (MD5) Previous issue date: 2013 / In the past decades, important changes in the epidemiology of fungal infections have resulted in the frequent isolation of yeasts of the genus Candida. Yeasts of the Candida parapsilosis species complex, for example, have been pointed out as infectious agents and components of the microbiota of animals. Thus, the work aimed at identifying molecularly the strains of the C. parapsilosis species complex recovered from veterinary sources and maintained at the Specialized Medical Mycology Center, as well as evaluating their in vitro antifungal susceptibility profile and attributes of virulence. For such, 28 strains of the C. parapsilosis species complex, recovered from dogs, psittacines, raptors and prawn were assessed. Initially, the strains were phenotypically identified, based on their morphological and biochemical characteristics, which confirmed their identification as C. parapsilosis lato sensu. The molecular identification of the strains was then carried out through PCR-REA. In order to analyze the in vitro antifungal susceptibility, the broth microdilution assay was performed, according to the document M27-A3 of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008, using amphotericin B, itraconazole, voriconazole, fluconazole and caspofungin. Concerning the virulence attributes, the ability of producing phospholipase was evaluated on egg yolk agar, while protease production was assessed on bovine serum albumin agar, and biofilm formation was tested in 96-well polystyrene microplates. The genotypical analysis identified 13 C. parapsilosis stricto sensu, ten C. orthopsilosis and five C. metapsilosis. The minimum inhibitory concentrations varied from 0.125 to 1 μg/mL foramphotericin B, from 0.03125 to 0.5 μg/mL, for itraconazole, from 0.03125 to 0,25 μg/mL for voriconazole, from 0.5 to 16 μg/mL for fluconazol and from 0.0625 to 2 μg/mL for caspofungin. Fluconazole resistance was observed in three strains of C. parapsilosis stricto sensu and two of C. metapsilosis, while one strain of C. parapsilosis stricto sensu and five C. orthopsilosis presented high MIC values for caspofungin (2 μg/mL). As for the virulence attributes, none of the tested strains produced phospholipases, while 23/28 presented proteolytic activity, and all of the strains produced biofilm, with one weak producer, 20 moderate producers and seven strong producers. These data show that the in vitro antifungal susceptibility and production of virulence attributes vary among species of the C. parapsilosis species complex, which can lead to differences in pathogenicity and therapeutic response. / Mudanças importantes na epidemiologia das infecções fúngicas nas últimas décadas têm resultado no isolamento frequente de leveduras do gênero Candida. As leveduras do complexo Candida parapsilosis, por exemplo, têm sido apontadas tanto como agentes de infecções como componentes da microbiota de animais. Diante disso, os objetivos deste trabalho foram realizar a identificação molecular de cepas do complexo C. parapsilosis, isoladas de fontes veterinárias e mantidas no Centro Especializado em Micologia Médica; assim como avaliar seus atributos de virulência e perfil de sensibilidade a antifúngicos, in vitro. Para tanto, foram utilizados 28 cepas do complexo C. parapsilosis obtidos de cães, psitacídeos, rapinantes e camarão. Inicialmente foi realizada a fenotipagem das cepas, com base na análise de suas características morfológicas e bioquímicas, que as ratificou como C. parapsilosis (lato sensu). A identificação molecular das espécies foi realizada por PCR-REA. A fim de analisar o perfil de sensibilidade das cepas, empregou-se o teste de microdiluição em caldo com anfotericina B, itraconazol, fluconazol, voriconazol e caspofungina, segundo metodologia padronizada pelo M27-A3. CLSI (2008). No tocante aos atributos de virulência, a capacidade da produção de fosfolipases foi avaliada pelo método de cultivo em ágar gema de ovo, a produção de proteases foi analisada através de cultivo em ágar albumina bovina e a formação de biofilme foi em microplaca de poliestireno com 96 poços. A análise genotípica evidenciou 13 C. parapsilosis (stricto sensu), 10 C. orthopsilosis e 05 C. metapsilosis. As concentrações inibitórias mínimas (MICs) variaram de 0,125 a 1 μg/mL para anfotericina B, de 0,5 a 16 μg/mL para fluconazol, de 0,03125 a 0,5 μg/mL para itraconazol, de 0,03125 a 0,25 μg/mL para voriconazol e de 0,0625 a 2 μg/mL para caspofungina. Foi observada resistência em 03 cepas de C. parapsilosis (stricto sensu) ao fluconazol e 01 cepa apresentou MIC elevado (2 μg/mL) para caspofungina. No que tange aos isolados de C. orthopsilosis, notou-se que 05 isolados apresentaram MICs elevados (2 μg/mL) para a caspofungina. Enquanto que, 02 isolados de C. metapsilosis revelaram-se resistentes ao fluconazol. Quanto à virulência, todas as cepas foram capazes de formar biofilmes, sendo, 20, 7 e 01, classificadas como produtoras moderadas, fortes e fracas respectivamente. Observou-se, ainda que 23/28 isolados apresentaram atividade proteolítica. Por outro lado, nenhuma foi capaz de produzir fosfolipases. Estes dados sinalizam que padrões de virulência, patogenicidade sensibilidade antifúngica, in vitro, podem variar entre as espécies do complexo C. parapsilosis.

No presente trabalho estudou-se a performance da linhagem E9 durante um processo de armazenamento, no qual conídios foram mantidos à -20°C com glicerol e sem glicerol. Esta linhagem foi alvo desse estudo por ser amplamente utilizada em nosso laboratório e por diversos laboratórios brasileiros, servindo como referência em estudos sobre entomopatógenos. Nestas condições os objetivos foram estimar as características do fungo quanto à evolução de O2, a variação na viabilidade determinada pela capacidade germinativa dos conídios, e a expressão de virulência, durante o processo. Na avaliação da evolução de O2, testes de respirometria foram realizados, utilizando-se a glicose como única fonte de carbono em um meio de cultivo simplificado. A virulência foi testada em bioensaios realizados com ninfas de 3 e 4 estágios do vetor da doença de Chagas Panstrongylus megistus; e a viabilidade foi obtida comparando-se conídios germinados e não germinados. Os resultados obtidos mostraram a necessidade de uma melhor compreensão, para que estes testes realizados se interajam mais efetivamente, pois foi observado que os dados relativos a viabilidade e o quociente de oxigênio (Q O2) do fungo isoladamente, não fornecem subsídios suficientes para se avaliar a capacidade entomopatogênica de uma dada linhagem. A ação do glicerol como crioprotetor, não foi eficiente no sentido de se representar diferenças significativas com relação à performance do entomopatógeno, uma vez que os valores de LT50 não foram muito divergentes. / not available

No presente trabalho estudou-se a performance da linhagem E9 durante um processo de armazenamento, no qual conídios foram mantidos à -20°C com glicerol e sem glicerol. Esta linhagem foi alvo desse estudo por ser amplamente utilizada em nosso laboratório e por diversos laboratórios brasileiros, servindo como referência em estudos sobre entomopatógenos. Nestas condições os objetivos foram estimar as características do fungo quanto à evolução de O2, a variação na viabilidade determinada pela capacidade germinativa dos conídios, e a expressão de virulência, durante o processo. Na avaliação da evolução de O2, testes de respirometria foram realizados, utilizando-se a glicose como única fonte de carbono em um meio de cultivo simplificado. A virulência foi testada em bioensaios realizados com ninfas de 3 e 4 estágios do vetor da doença de Chagas Panstrongylus megistus; e a viabilidade foi obtida comparando-se conídios germinados e não germinados. Os resultados obtidos mostraram a necessidade de uma melhor compreensão, para que estes testes realizados se interajam mais efetivamente, pois foi observado que os dados relativos a viabilidade e o quociente de oxigênio (Q O2) do fungo isoladamente, não fornecem subsídios suficientes para se avaliar a capacidade entomopatogênica de uma dada linhagem. A ação do glicerol como crioprotetor, não foi eficiente no sentido de se representar diferenças significativas com relação à performance do entomopatógeno, uma vez que os valores de LT50 não foram muito divergentes. / not available

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

VERAS, H. N. Diagnóstico molecular e detecção de genes de virulência de Campylobacter jejuni em crianças com diarreia moderada a severa na cidade de Fortaleza – CE, Brasil. 2016 .129 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-06-29T13:12:19Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_hnveras.pdf: 3228642 bytes, checksum: f6abd0d718a4279964069ed09e6aeaa8 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-29T13:30:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_hnveras.pdf: 3228642 bytes, checksum: f6abd0d718a4279964069ed09e6aeaa8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T13:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_hnveras.pdf: 3228642 bytes, checksum: f6abd0d718a4279964069ed09e6aeaa8 (MD5) Previous issue date: 2016-07-22 / Campylobacter spp. infections are considered one of the most common causes of bacterial gastroenteritis caused by contamination of water and food. Campylobacter jejuni is the most characterized specie, and the investigation of the epidemiology and virulence genes can elucidate some aspects of the microorganism pathogenicity. The aim of this study was to diagnose and identify the presence of virulence genes related to Campylobacter jejuni in children with moderate to severe diarrhea in the city of Fortaleza – CE, Brazil. This work is part of a project entitled “Diarrhea Enteric Card (DEC)”, which goal is to develop PCR-based multiplex diagnostic assays for bacterial enteric pathogens. That project was approved by the local and national ethical committees in Brazil (HIAS 80/06 and CONEPE 13523/2007, respectively). DNA was extracted directly from fecal samples isolated from 436 childrenwith moderate to severe diarrhea from May 2008 to April 2009, in Fortaleza, Ceará, Brazil. The diagnosis of C. jejuni was performed by conventional PCR using hipO gene. The detection of genes that encode proteins associated with virulence of C.jejuni was performed by uniplex and multiplex PCR techniques. C. jejuni was diagnosed in 14% (61/436) of the samples, presenting significant association among children aged 0-12 months (P = 0.0001) and children aged 12, 1-24 months. 51 positive samples for C. jejuniwere used for the detection of the virulence genes. The prevalence of theC. jejuni’s virulence-associated genes were detected in the following proportions of C. jejuni-positive DNA samples: flgE, (92.2%, 47/51) and flaA, (76.5%, 39/51), related to motility;cheW, (90.2%, 46/51); (cheA, 82.4%, 42/51) andcheR, (66.6%, 34/51), related to bacterial chemiotaxis; cadF, (100%, 51/51) andjlpA, (43.1%, 22/51), related to bacterial adhesion; ciaB, (96.1%, 49/51); iamA, (90.2%, 46/51); pldA, (45.1%, 23/51) and pVir(0%, 0/51), related to invasion; cdtABC, (94.1%, 48/51), related to cytolethal distending toxin (CDT); fur, (66.6%, 34/51); cfrA, (31.4%, 16/51) and ceuE, (21.7%, 11/51), related to bacterial iron transport and regulation; racR, (100%, 51/51); sodB, (96.1%, 49/51); dnaJ, (88.2%, 45/51) andkatA, (66.6%, 34/51), related to oxidative stress. The distribution profiles of C. jejuni’s virulence did not correspond to the patient’s clinical presentation of abdominal pain. But the presence of cfrA and dnaJ genes was correlated with fever (P=0,0214)and the presence of jlpA e katA gene were correlated with vomiting (P=0,0211) and pldA and ceuE genes was correlated with the presence of blood in stool (P=0,0013), this data suggests that relationships might be related to the severity of infection by this microorganism. New studies about the expression of proteins associated with the virulence genes must be carried out to better understand the pathobiology mechanisms of Campylobacter jejuni infections. / Infecções porCampylobacter spp. são consideradasuma das causas mais comuns de gastroenterite ocasionada porcontaminação de água e alimentos. Campylobacter jejuni é a espécie mais bem caracterizada, e a investigação da epidemiologia, e dos genes de virulência, podem elucidar algum aspecto da patogenicidade deste micro-organismo. O objetivo desse estudo foi diagnosticar e identificar a presença de genes de virulência relacionados à Campylobacter jejuni em crianças com diarreia moderada a severa na cidade de Fortaleza – CE, Brasil. Este estudo faz parte de um projeto intitulado “Diarrhea Enteric Card (DEC)”, que teve como objetivo desenvolver um ensaio de PCR multiplex para o diagnóstico de bactérias patogênicas. O projeto teve aprovação nos comitês de ética local e nacional no Brasil (HIAS 80/06 e CONEPE 13523/2007, respectivamente). A extração de DNA foi realizada diretamente das amostras fecais oriundas de 436 criançascom diarreia moderada a severa, durantes os meses de maio de 2008 a abril de 2009, na cidade de Fortaleza, Ceará, Brasil. O diagnóstico de C. jejuni foi realizado através de PCR convencional, utilizando o gene hipO. A detecção dos genes de virulência de C. jejuni foi realizada através das técnicas de PCR uniplex e multiplex. C. jejuni foi diagnóstico em 14% (61/436) das amostras, apresentando associação significante da presença do patógeno em crianças com idade entre 0-12 meses (P=0,0001) e com idade entre 12,1-24 meses (P=0,0427). A detecção dos genes de virulência foi realizada em 51 amostras positivas para a C. jejuni.A prevalência dos genes associados à virulência de C. jejuni foram detectados seguindo a proporção de amostras positivas:flgE, (92,2%, 47/51) eflaA, (76.5%, 39/51), relacionados à motilidade;cheW (90,2%, 46/51); cheA, (82,4%, 42/51) echeR,(66,6%, 34/51), relacionados à quimiotaxia bacteriana; cadF, (100%, 51/51) ejlpA, (43,1%, 22/51), relacionados à adesão; ciaB, (96,1%, 49/51); iamA, (90,2%, 46/51); pldA, (45,1, 23/51) epVir (0%, 0/51), relacionados a invasão; cdtABC, (94,1%, 48/51), relacionados à toxina citoletal distensora (CDT); fur, (66,6%, 34/51); cfrA, (31,4%, 16/51) eceuE, (21,7%, 11/51), relacionados ao transporte e regulação de ferro; racR, (100%, 51/51),sodB, (96,1%, 49/51),dnaJ, (88,2%, 45/51) ekatA, (66,6%, 34/51), relacionado à sobrevivência da bactéria e ao estresse oxidativo. A distribuição dos perfis de genes de virulência de C. jejuni não correspondeu com o parâmetro clínico de dor abdominal, mas houve a associação dos genescfrA e dnaJ com a presença de febre (P=0,0214), dos genes jlpA e katA com a presença de vômito (P=0,0211), e dos genespldA e ceuE com a presença de sangue nas fezes(P= 0,0013), sugerindo que essas relações poderiam estar associadas a severidade da infecção causada pelo micro-organismo. Novos estudos sobre a expressão de proteínas relacionadas aos genes de virulência devem ser realizados, para que assim haja uma melhor compreensão sobre os mecanismos da patobiologia das infecções causadas porC. jejuni.

A expressão de determinantes de virulência por um patógeno é amplamente controlada pelo ambiente encontrado no hospedeiro. Neste contexto, a descrição de genes essenciais para o processo de interação patógeno-hospedeiro é fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos de virulência utilizados durante a infecção. Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada que causa meningite em pacientes imunocomprometidos. A pandemia de AIDS contribuiu significativamente para o aumento das pesquisas científicas relacionadas à biologia de C. neoformans. Estudos funcionais de três genes deste patógeno, VCX1, GAT1, e GRASP, envolvidos, respectivamente, no transporte de cálcio (Ca2+), no metabolismo de nitrogênio e no processo de secreção não convencional são apresentados e discutidos na presente Tese. A habilidade de desevolvimento a 37°C é um fator de virulência essencial de C. neoformans, o qual é controlado por uma via de sinalização regulada por Ca2+ e calcineurina. O gene VCX1 de C. neoformans codifica um transportador de cálcio vacuolar, requerido para o desenvolvimento intracelular em macrófagos e para a virulência em camundongos. O fator de transcrição Gat1 de C. neoformans regula a expressão de genes sensíveis ao processo de repressão catabólica por nitrogênio (NCR). Genes envolvidos na biossíntese de ergosterol, metabolismo de ferro, integridade da parede celular e síntese da cápsula também são regulados por Gat1. Entretanto, este fator de transcrição não é necessário para a sobrevivência durante a interação com macrófagos e para a virulência em modelo de infecção experimental. Uma estratégia de virulência essencial de C. neoformans é a secreção de glicuronoxilomanana (GXM), um polissacarídeo capsular com propriedades imuno-modulatórias. Nossos resultados demonstram que GRASP (golgi reassembly and stacking protein) está envolvida na secreção de GXM, formação da cápsula e virulência em C. neoformans. É importante ressaltar que o transportador de cálcio Vcx1 e o fator de transcrição Gat1 também participam do processo de secreção deste polissacarídeo, o que representa a sua complexidade em C. neoformans. / The expression of pathogen virulence determinants is highly controlled by the host milieu. In this context, the description of crucial genes for hostpathogen interaction is fundamental to better understand the virulence mechanisms utilized during infection. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast, that causes a life-threatening meningoencephalitis in immunocompromised individuals. The AIDS pandemic has contributed significantly to the increase of scientific research concerning the C. neoformans biology. Functional analyses of three genes, VCX1, GAT1, and GRASP, related to calcium (Ca2+) transport, nitrogen metabolism and unconventional secretion in C. neoformans, respectively, are presented and discussed in this thesis. The ability to survive and proliferate at the human body temperature is an essential virulence attribute of this pathogen. This trait is controlled in part by the Ca2+- calcineurin pathway, which senses and utilizes cytosolic calcium for signaling. C. neoformans VCX1 gene encodes a vacuolar calcium exchanger, which is required for intracellular growth in macrophages and for full virulence in mice. The C. neoformans transcription factor Gat1 regulates the expression of Nitrogen Catabolite Repression (NCR) sensitive genes. Genes involved in ergosterol biosynthesis, iron uptake, cell wall organization and capsule biosynthesis are also Gat1-regulated in C. neoformans. However, Gat1 is not required for survival during macrophage infection and for virulence in a mice model of cryptococcosis. One essential virulence strategy of C. neoformans is the release of glucuronoxylomannan (GXM), a capsular immune-modulatory polysaccharide. Our results demonstrate that GRASP, a golgi reassembly and stacking protein, is involved in GXM secretion, capsule formation and virulence in C. neoformans. Interestingly, the vacuolar calcium exchanger Vcx1 and the transcription factor Gat1 are also involved in GXM secretion, which represents the complexity of this important process in C. neoformans.