Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-19T21:38:54Z No. of bitstreams: 1 CláudioFigueira Caracterização de mutantes de Leptospira spp.....pdf: 700655 bytes, checksum: 75bf81169cbe8bb9b8be3dc83344b26e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-19T21:38:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CláudioFigueira Caracterização de mutantes de Leptospira spp.....pdf: 700655 bytes, checksum: 75bf81169cbe8bb9b8be3dc83344b26e (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O gênero Leptospira inclui espécies não patogênicas, que vivem exclusivamente no ambiente, assim como espécies patogênicas capazes de infectar o homem e animais. Há poucos anos, os genomas de três espécies patogênicas e de uma não patogênica foram sequenciados. Leptospira interrogans é a principal espécie causadora da leptospirose humana, especialmente nas áreas urbanas do Brasil, e cerca de 1200 genes podem estar associados à virulência na L. interrogans. Ferramentas moleculares, capazes de modificar geneticamente espécies de leptospiras, são essenciais para a compreensão do papel funcional destes genes. Neste trabalho, foram caracterizados mutantes obtidos por diferentes abordagens moleculares para avaliação de potenciais fatores de virulência em L. interrogans. Utilizando-se a técnica de mutagênese randômica, por meio da inserção do transposon Himar1, foi obtido um mutante com o gene interrompido da lipoproteína Loa22, a qual possui um segmento idêntico ao domínio OmpA. Verificou-se que a ausência de Loa22 levou a perda de virulência desta bactéria em modelos animais, enquanto que o mutante com o gene loa22 reconstituído voltou a apresentar virulência semelhante à cepa selvagem original, sendo a primeira descrição de um fator de virulência em leptospiras. Para avaliar especificamente o papel da LigA e da LigB, proteínas com várias evidências de associação com virulência, duas estratégias foram utilizadas: a recombinação homóloga por mutação dirigida para obter a deleção do gene ligB em L. interrogans cepa L1130; e um plasmídeo replicativo para a inserção do gene ligA e ligB em L. biflexa. Como resultado, verificou-se que a ausência de LigB não é suficiente para provocar a perda de virulência da L. interrogans; e por fim, foi demonstrado que a expressão heteróloga de LigA e LigB em L. biflexa conferiu aumento na adesão em cultura de célula e em fibronectina. Este último estudo mostra que a expressão heteróloga em L. biflexa pode servir para caracterizar fatores de virulência do agente causador da leptospirose. O conjunto destes achados contribui para a compreensão da patogênese da leptospirose e poderá cooperar no desenvolvimento uma vacina eficaz para o controle da transmissão desta doença e para obtenção de novos métodos de diagnóstico para leptospirose. / The genus Leptospira includes non-pathogenic free-living and pathogenic species that can infect humans and animals. Recently the genome of four species, including a non-pathogenic one, was published. Leptospira interrogans is the main species that causes human leptospirosis, especially in the urban areas of Brazil, and about 1200 genes may be associated with virulence in this specie. For that reason, molecular tools used to genetically modify this agent are essential to understanding the biology of the agent and the role of these genes. In this work, mutants obtained by different molecular approaches were characterized to identify potential virulence factors in L. interrogans. The random mutagenesis with Himar1 transposon was used to obtain a mutant with interruption of the gene loa22, which product is a described protein with a predicted OmpA domain. The mutant showed loss of virulence in animal models, and the virulence was restored with the complementation with the homologous gene, becoming the first description of a virulence factor in leptospires. To evaluate the role of LigA and LigB, described putative virulence factors in leptospires, two different approaches were used: allelic exchange using targeted mutagenesis to disrupt the ligB gene in L. interrogans strain Fiocruz L1 130; and the use of replicative plasmid to insert the heterologous genes of ligA and ligB in the L. biflexa. As result, we showed that the absence of LigB is not sufficient to cause the loss in the virulence of L. interrogans; and it was also shown that heterologous expression of LigA and LigB in L. biflexa confers enhanced adhesion to cell culture and fibronectin. This study indicates that L. biflexa can serve as a surrogate host to characterize the role of virulence factors in Leptospira sp. .These results contribute to a better understanding of the pathogenesis of leptospirosis and may be important in studies for the development of an effective vaccine and new diagnostic methods.

CARVALHO, F. C. T. de. Influências exôgenas na qualidade bacteriológica da água, solo e camarão (Litopenaeus vannamei), em quatro fazendas de camarão do Estado do Ceará. 2006. 87 f.: Dissertação (mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. / Submitted by Nadsa Cid (nadsa@ufc.br) on 2015-04-08T18:16:06Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_fctdecarvalho.pdf: 1519340 bytes, checksum: a87e88da8c7a3c5c3ab337f3a4eebbb4 (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2015-04-08T18:16:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_fctdecarvalho.pdf: 1519340 bytes, checksum: a87e88da8c7a3c5c3ab337f3a4eebbb4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T18:16:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_fctdecarvalho.pdf: 1519340 bytes, checksum: a87e88da8c7a3c5c3ab337f3a4eebbb4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Bacteria of fecal origin, such as Escherichia coli and Salmonella, are frequently isolated from freshwater or marine waters, originating economic problems to the cultivation of aquatic organisms for human consumption. Another concerning factor is the growing resistance to antibiotics in the aquatic environment, due to its indiscriminate use for both human and animal prophylaxis. This considered, the following research aims at monitoring the presence of enteric bacteria (E. coli and Salmonella spp.) in areas of two freshwater acclimated shrimp (Litopenaeus vannamei) cultivation farms in Jaguaruana-CE, establishing antimicrobials resistance patterns. Sediment and water samples were gathered from ponds and nearby water streams from each farm. The estimated number of E. coli from both the pond and the main river samples were similar in all sources. Two hundred sixty-five (265) strains suspected of E. coli were isolated, 50 (18.87%) of those suspicions were confirmed by biochemical tests. Among the 186 strains suspected of Salmonella, 30 (16.13%) belong to the genus, with five different serovars: S. ser. Saintpaul, S. ser. Infantis, S. ser. Panama, S. ser. Madelia, S. ser. Braenderup, S. enterica subsp. Houtenae and S. enterica subsp. enterica. Physicochemical parameters (temperature, pH and salinity) did not have any influence on the isolation of E. coli or Salmonella strains. There was no relation between the E. coli MPN and Salmonella isolation among the analyzed samples. Resistance to TET, AMP and OTC was observed in 32% of the E. coli strains, where half of this percentage presented a plasmid-related phenotype. Resistance to TET, OTC, AMP and NIT was observed in 16.67% of the Salmonella strains. Only NIT resistance was considered of plasmid origin. Concerning TET and OTC, the E. coli isolates presented a MIC of 32 µg mL-1 and MBC of >128 µg mL-1; whereas the MIC and MBC for TET, OTC and NIT in the Salmonella strains were 64 µg mL-1 and >12,800 µg mL-1, respectively. According to the analysis of the genotypic profiles from the Salmonella isolates, it was not possible to determine the dispersion pattern of its serovars in the environment. The presence of pefA and invA genes was independent from both the serovar and environmental origin of the isolates. / Bactérias de origem fecal como Escherichia coli e Salmonella são frequentemente isoladas de corpos aquáticos dulcícolas e ou marinhos o que acarreta problemas econômicos para cultivos de organismos aquáticos destinados a alimentação humana, pois estão diretamente relacionados à qualidade dos produtos e à saúde dos consumidores. Outra preocupação é com a crescente resistência destas bactérias a antibióticos no ambiente aquático resultante, principalmente, do uso indiscriminado dessas drogas na profilaxia humana e animal. Considerando o exposto, o objetivo da pesquisa foi monitorar a presença de bactérias entéricas (E. coli e Salmonella spp.) em áreas de cultivo de camarão (Litopenaeus vannamei) aclimatado a água doce em duas fazendas situadas em Jaguaruana-CE, analizando os padrões de resistência a antimicrobianos. De cada fazenda foram coletadas amostras de sedimento e água dos viveiros além do afluente próximo. A estimativa do número de E. coli nas amostras de água e sedimentos dos viveiros e do rio abastecedor foram semelhantes para as duas fazendas. Foram isoladas 265 cepas suspeitas de E. coli sendo confirmadas 50 (18,87%) através de testes bioquímicos. Entre 186 cepas suspeitas de Salmonella, 30 (16,13%) foram confirmadas como pertencentes ao gênero, sendo cinco diferentes sorovares: S. sor. Saintpaul, S. sor. Infantis, S. sor. Panama, S. sor. Madelia, S. sor. Braenderup, S. enterica subsp. houtenae e S. enterica subsp. enterica. Os parâmetros físico-químicos (temperatura, pH e salinidade) não influenciaram no isolamento das cepas de E. coli ou Salmonella. Não houve relação entre o NMP de E. coli e o isolamento de Salmonella entre as amostras analisadas. Foi observada resistência à TET, AMP e OTC em 32% das cepas de E. coli com 50% desses apresentando fenótipo relacionado a plasmídeo. Entre as estirpes de Salmonella, 16,67% se mostraram resistentes à TET, OTC, AMP e NIT. Apenas a resistência à NIT foi estabelecida como de origem plasmidial. Para TET e OTC, os isolados de E. coli apresentaram CIM de 32 µg mL-1 e CBM de >128 µg mL-1. Por outro lado, a CIM e CBM para TET, OTC e NIT nas Salmonella foram de 64 µg mL-1 e >12.800 µg mL-1, respectivamente. Através da análise dos perfis genotípicos dos isolados de Salmonella não foi possível estabelecer padrões de dispersão dos sorovares no ambiente. A presença dos genes pefA e invA que codificam fatores de virulência nas culturas de Salmonella foi independente do sorovar e da origem ambiental dos isolados.

QUETZ, Josiane da Silva. Diagnóstico microbiológico, imunoenzimático e molecular e perfil de genes associados à virulência de Campylobacter. 2013. 166 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-23T13:04:24Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_jsquetz.pdf: 3530958 bytes, checksum: e95cebb86634d9fd6d6bd11bdbfcb145 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-23T13:17:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_jsquetz.pdf: 3530958 bytes, checksum: e95cebb86634d9fd6d6bd11bdbfcb145 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-23T13:17:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_jsquetz.pdf: 3530958 bytes, checksum: e95cebb86634d9fd6d6bd11bdbfcb145 (MD5) Previous issue date: 2013 / Campylobacter sp. is an important cause of food-borne gastroenteritis with high incidence in children living in developing countries. However, the specific diagnosis of its etiology remains as a challenge, since conventional diagnosis by culture is now challenged by molecular and immunoenzymatic methods, which have greater sensitivity. We postulate that the knowledge of its virulence and specific diagnosis may assist in identifying and potentially controling campylobacteriosis in childhood. We determined the etiology of Campylobacter sp. associated diarrhea, in a cross-sectional study of diarrhea in children aged 0-36 months from the urban area of Fortaleza, Ceará, Brazil, who required emergency medical care because of diarrheal disease. After ethical approval of the study, a questionnaire was applied to describe the clinical conditions presented by each child at the time of admission. DNA was extracted directly from fecal samples collected from 226 children. For the determination of the etiologic agent we used molecular diagnostics (PCR and RT-PCR) and diagnostic immunoassay (ELISA), besides the detection of virulence associated genes of C. jejuni (PCR). Campylobacter sp. was found in 8.9% (20/225) of the samples by conventional microbiological diagnosis. C. jejuni and C. coli were detected in 19.5% (44/226) and 1.3% (3/226) of the diarrheic samples, respectively. The diagnostic RT-PCR and ELISA reached 26.7% (60/225) and 37.9% (58/153) of positivity, respectively. When considering the combination of diagnostic (positive in microbiological diagnosis or immunoassay and at least one of the molecular tests) the prevalence was 16.4% (37/226). The agreement between the tests used for diagnosis was moderate to regular, according to Kappa index. The presence of C. jejuni´s virulence-associated genes that encode proteins related to the pathogenesis of micro-organism were detected in the following proportions of C. jejuni-positive DNA samples: flaA, 79.5% (35/44); racR, 97.7% (43/44) and dnaJ, 88.6% (39/44) – related to bacterial adhesion and colonization; ciaB, 97.7 % (43/44); pldA, 45.4% (20/44) and pVir 0% (0/44) – related to invasion, and cdtABC in 95.4% (42/44) of samples related to citoletal distending toxin (CDT). Specific signs and symptoms such as blood in the stool, vomiting, fever and/or abdominal pain, although quite frequent, were not associated with the detection of C. jejuni. The distribution profile of C. jejuni´s virulence genes was not correlated with the clinical presentation of the disease, even when this profile was categorized according to the function of the proteins encoded by the genes, which leads us to believe that other factors, perhaps related to host susceptibility, may be more important than genetic variability of the microorganism. We conclude that Campylobacter sp. was detected in a significant percentage of the children 0-36 months with diarrhea, especially when the diagnostic methods were used in combination. In general, the virulence genes were detected in a high proportion of C. jejuni-positive samples, although the invasion-related genes have been found less frequently. Our data corroborates findings from other groups on the need to revise the diagnostic for Campylobacter sp. towards the inclusion of more sensitive and species-specific methods, as well as search for extra markers for intestinal inflammation and predictors of negative culture. / Campylobacter sp. é uma importante causa de enterite de origem alimentar com alta incidência na população infantil de países em desenvolvimento. No entanto, o diagnóstico específico de sua etiologia segue como um desafio, visto que métodos moleculares e imunoenzimáticos têm se mostrado mais sensíveis. Postulamos que o conhecimento de sua virulência e o diagnóstico específico possam ajudar na identificação e potencial controle da campilobacteriose na infância. Foi determinada a etiologia de diarreia por Campylobacter sp., em um estudo transversal sobre diarreia em crianças de 0-36 meses residentes da área urbana de Fortaleza, Ceará, Brasil, que necessitaram de atendimento médico de urgência por causa de doença diarreica. Após a aprovação ética do estudo, um questionário foi aplicado para qualificar as condições clínicas apresentadas por cada criança no momento da admissão. O DNA foi extraído diretamente de amostras fecais coletadas de 226 crianças. Para a detecção do agente etiológico, utilizamos diagnóstico molecular (PCR e RT-PCR) e diagnóstico imunoenzimático (ELISA), além da detecção de genes associados à virulência de C. jejuni (PCR). Campylobacter sp. foi encontrado em 8,9% (20/225) das amostras, por diagnóstico microbiológico convencional. C. jejuni e C. coli foram detectados em 19,5% (44/226) e 1,3% (3/226) das amostras diarreicas, respectivamente, por PCR. Os diagnósticos por RT-PCR e ELISA alcançaram 26,7% (60/225) e 37,9% (58/153), respectivamente. Quando considerada a combinação de diagnósticos (positividade no diagnóstico microbiológico ou no imunoenzimático e ao menos em um dos testes moleculares) a prevalência encontrada foi de 16,4% (37/226). A concordância entre os testes para diagnóstico utilizados foi de moderada a regular, de acordo com o índice de Kappa. Genes associados à virulência foram detectados nas seguintes proporções de amostras positivas para C. jejuni: flaA, 79,5% (35/44); racR, 97,7% (43/44) e dnaJ, 88,6% (39/44) – relacionados à adesão bacteriana e colonização; ciaB, 97,7% (43/44); pldA, 45,4% (20/44) e pVir 0% (0/44) – relacionados à invasão; e cdtABC em 95,4% (42/44) das amostras, operon relacionado à produção da toxina citoletal distensora (CDT). Sinais e sintomas específicos, tais como sangue nas fezes, vômito, febre e/ou dor abdominal, apesar de bastante frequentes, não foram associados com a detecção de C. jejuni. O perfil de distribuição dos genes de virulência de C. jejuni não apresentou correlação com a apresentação clínica da doença, mesmo quando tal perfil foi categorizado de acordo com a função das proteínas codificadas pelos genes, o que nos leva a crer que outros fatores, talvez relacionados à susceptibilidade do hospedeiro, possam ser mais importantes do que a variabilidade genética do micro-organismo. Concluímos que Campylobacter sp. foi detectado em percentual relevante da população estudada, principalmente quando os métodos diagnósticos foram utilizados de forma combinada. Em geral, os genes de virulência foram detectados em uma alta proporção das amostras positivas para C. jejuni, embora os genes relacionados à invasão tenham sido menos frequentemente encontrados. Corroboramos dados de outros grupos sobre a necessidade de revisão do diagnóstico para Campylobacter sp. em prol da inclusão de metodologias mais sensíveis e espécie-específicas, além da busca por marcadores para inflamação intestinal e fatores preditivos de cultura negativa.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria pertencente à classe Mollicutes, sendo o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e o agente primário do complexo de doenças respiratórias de suínos (CDRS). A sinal-peptidase I (SPase I) é uma endopeptidase de membrana que cliva os peptídeos-sinal (PS) de proteínas transportadas pelo sistema geral de secreção. A SPase I do M. hyopneumoniae (MhSPase I) é codificada pela sequência de DNA codificadora (CDS) sipS, presente nas 3 linhagens da espécie com genomas já sequenciados. Este trabalho tem como objetivo caracterizar funcional e imunologicamente a MhSPase I, assim como investigar a sua relação com a virulência da bactéria. Foi demonstrado que sipS é parte de um operon, sendo cotranscrita com outras 4 CDSs. A CDS sipS foi clonada e a MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi expressa em Escherichia coli. A rMhSPase I mostrou-se altamente imunogênica para camundongos e seu caráter antigênico foi confirmado para suínos. A MhSPase I apresentou expressão diferencial em linhagens patogênicas e não patogênicas de M. hyopneumoniae corroborando a ideia de que essa enzima é um fator de virulência da bactéria. Análises de sequências de aminoácidos evidenciaram que a MhSPase I tem baixa identidade com enzimas ortólogas de outras espécies de micoplasmas e de bactérias relacionadas ao CDRS. O potencial sorodiagnóstico da rMhSPase I foi demonstrado em um ELISA. Predições in silico de possíveis PSs clivados pela MhSPase I indicaram que proteínas hipotéticas e proteínas de membrana, incluindo adesinas, seriam substratos da enzima. Ensaios de atividade in vitro com PSs sintéticos derivados de predições in silico, contudo, não foram conclusivos. Estudos futuros deverão elucidar o papel da SPase I na exportação de proteínas em M. hyopneumoniae e explorar o potencial da enzima como antígeno vacinal ou diagnóstico. / Mycoplasma hyopneumoniae is a bacterium that belongs to the Mollicutes class, being the etiological agent of porcine enzootic pneumoniae and one of the primary agents of the porcine respiratory disease complex (PRDC). Signal peptidase I (SPase I) is a membrane-bound endopeptidase that cleaves the signal peptide (SP) of proteins exported by the general secretory pathway. The M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I) is coded by the sipS gene in all of the three M. hyopneumoniae genomes sequenced. The aims of this work are to functional and immunologically characterize the MhSPase I and to investigate its relation with the virulence of the bacterium. The sipS coding DNA sequence (CDS) was demonstrated to be part of an operon, being co-transcribed along with 4 other CDSs. The sipS CDS was cloned and the recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was expressed in Escherichia coli. The rMhSPase I was highly immunogenic for mice and the antigenicity for pigs was demonstrated. The observed differential expression of MhSPase I between pathogenic strains and one non pathogenic strain of M. hyopneumoniae corroborates the notion of MhSPase I as a virulence factor. Amino acid sequence analyses of MhSPase I and SPases I from other Mycoplasma and PRDC bacteria evidenced low conservation between these enzymes. The potential serodiagnosis application of rMhSPase I was demonstrated by an ELISA. In silico predictions of putative SPs cleaved by MhSPase I were performed, indicating that hypothetical and membrane proteins, including adhesins, have cleavable SPs. In vitro cleavage assays of rMhSPase I were developed with synthetic SPs, but the results were not conclusive. Further studies should elucidate the role of SPase I in the exportation of proteins in M. hyopneumoniae and the putative application of MhSPase I as an antigen for vaccination and diagnosis.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Apêndices. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-20T15:30:33Z No. of bitstreams: 1 2016_HugoCostaPaes_Parcial.pdf: 3794325 bytes, checksum: 3d01a16ba44758f90caa9750abbd4e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-14T21:27:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_HugoCostaPaes_Parcial.pdf: 3794325 bytes, checksum: 3d01a16ba44758f90caa9750abbd4e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T21:27:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_HugoCostaPaes_Parcial.pdf: 3794325 bytes, checksum: 3d01a16ba44758f90caa9750abbd4e47 (MD5) / Fatores de transcrição da família Gti1/Pac2 ocorrem exclusivamente em fungos e foram cooptados pela evolução para desempenhar papéis reguladores distintos de acordo com a espécie, papéis esses que vão do controle da transição micélio-levedura e virulência em fungos termodimórficos, à regulação do acasalamento em Candida e do metabolismo secundário em patógenos de plantas. Como essas são funções-chaves para patogênese, levantamos a hipótese de que o homólogo em Cryptococcusneoformans poderia também controlar a virulência, no caso em questão de um importante patógeno fúngico de humanos, que causa uma doença que vitima centenas de milhares de pessoas todo ano. O mutante para o gene que caracterizamos retém a capacidade de secretar diversas substâncias associadas à virulência – melanina, urease e fosfolipase – mas é hipocapsular e tem um defeito de citocinese e de crescimento a 37 °C. É avirulento em camundongos e hipovirulento em Galleria a 30 °C, o que indica que a temperatura do hospedeiro não é a única razão para o fenótipo observado. Além disso, a análise de RNA-Seq mostra que na ausência da proteína correspondente, a expressão da maioria das ORFscodantes do locus MAT é parcial ou completamente reprimida a 37 °C num meio de cultura de células. Entretanto, o mutante não apresenta um defeito na iniciação do acasalamento. Estes resultados dão suporte à idéia de que acasalamento e a resposta a estresses ambientais são mecanismos que evoluíram paralelamente, e é o primeiro relato de um fator de transcrição que controla o locus MAT de um patógeno fúngico num contexto independente do acasalamento. A proteína foi, portanto, nomeada MAT locuscontroller 1 (“controladora do locus MAT 1”, Mlc1). / Gti1/Pac2 transcription factors occur exclusively in fungi and have been co-opted during evolution to perform distinct regulatory roles according to species, ranging from yeast-to-mycelium transition and virulence in dimorphic fungi, to mating in Candida and secondary metabolism in plant pathogens. As these roles are important in causing disease, we hypothesized that the Cryptococcus neoformans homologue could also control virulence in this important fungal pathogen, which causes a disease that kills hundreds of thousands of people each year. The mutant for this gene retains the ability to secrete several substances associated with virulence – melanin, urease and phospholipase – but is hypocapsular and has a cytokinesis and a growth defect at 37 °C. It is avirulent in mice and hypovirulent in Galleria at 30 °C, which indicates that host temperature is not the only reason. Furthermore, RNA-Seq analysis shows that in the absence of the protein, the expression of most protein-coding ORFs of the MAT locus is partial or completely repressed at 37 °C in a cell culture medium. However, the mutant does not have a defect in mating initiation. These results support the idea that mating and the response to environmental stress are co-evolved mechanisms, and is the first report of a transcription factor that controls the MAT locus of a fungal pathogen in a mating-unrelated context. The protein has thus been named MAT locus controller 1 (Mlc1).

A expressão de determinantes de virulência por um patógeno é amplamente controlada pelo ambiente encontrado no hospedeiro. Neste contexto, a descrição de genes essenciais para o processo de interação patógeno-hospedeiro é fundamental para o melhor entendimento dos mecanismos de virulência utilizados durante a infecção. Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada que causa meningite em pacientes imunocomprometidos. A pandemia de AIDS contribuiu significativamente para o aumento das pesquisas científicas relacionadas à biologia de C. neoformans. Estudos funcionais de três genes deste patógeno, VCX1, GAT1, e GRASP, envolvidos, respectivamente, no transporte de cálcio (Ca2+), no metabolismo de nitrogênio e no processo de secreção não convencional são apresentados e discutidos na presente Tese. A habilidade de desevolvimento a 37°C é um fator de virulência essencial de C. neoformans, o qual é controlado por uma via de sinalização regulada por Ca2+ e calcineurina. O gene VCX1 de C. neoformans codifica um transportador de cálcio vacuolar, requerido para o desenvolvimento intracelular em macrófagos e para a virulência em camundongos. O fator de transcrição Gat1 de C. neoformans regula a expressão de genes sensíveis ao processo de repressão catabólica por nitrogênio (NCR). Genes envolvidos na biossíntese de ergosterol, metabolismo de ferro, integridade da parede celular e síntese da cápsula também são regulados por Gat1. Entretanto, este fator de transcrição não é necessário para a sobrevivência durante a interação com macrófagos e para a virulência em modelo de infecção experimental. Uma estratégia de virulência essencial de C. neoformans é a secreção de glicuronoxilomanana (GXM), um polissacarídeo capsular com propriedades imuno-modulatórias. Nossos resultados demonstram que GRASP (golgi reassembly and stacking protein) está envolvida na secreção de GXM, formação da cápsula e virulência em C. neoformans. É importante ressaltar que o transportador de cálcio Vcx1 e o fator de transcrição Gat1 também participam do processo de secreção deste polissacarídeo, o que representa a sua complexidade em C. neoformans. / The expression of pathogen virulence determinants is highly controlled by the host milieu. In this context, the description of crucial genes for hostpathogen interaction is fundamental to better understand the virulence mechanisms utilized during infection. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast, that causes a life-threatening meningoencephalitis in immunocompromised individuals. The AIDS pandemic has contributed significantly to the increase of scientific research concerning the C. neoformans biology. Functional analyses of three genes, VCX1, GAT1, and GRASP, related to calcium (Ca2+) transport, nitrogen metabolism and unconventional secretion in C. neoformans, respectively, are presented and discussed in this thesis. The ability to survive and proliferate at the human body temperature is an essential virulence attribute of this pathogen. This trait is controlled in part by the Ca2+- calcineurin pathway, which senses and utilizes cytosolic calcium for signaling. C. neoformans VCX1 gene encodes a vacuolar calcium exchanger, which is required for intracellular growth in macrophages and for full virulence in mice. The C. neoformans transcription factor Gat1 regulates the expression of Nitrogen Catabolite Repression (NCR) sensitive genes. Genes involved in ergosterol biosynthesis, iron uptake, cell wall organization and capsule biosynthesis are also Gat1-regulated in C. neoformans. However, Gat1 is not required for survival during macrophage infection and for virulence in a mice model of cryptococcosis. One essential virulence strategy of C. neoformans is the release of glucuronoxylomannan (GXM), a capsular immune-modulatory polysaccharide. Our results demonstrate that GRASP, a golgi reassembly and stacking protein, is involved in GXM secretion, capsule formation and virulence in C. neoformans. Interestingly, the vacuolar calcium exchanger Vcx1 and the transcription factor Gat1 are also involved in GXM secretion, which represents the complexity of this important process in C. neoformans.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.