Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Introdução: A Síndrome de Morquio A (MPS IVA) é um Erro Inato do Metabolismo do grupo das Doenças Lisossômicas. Esta patologia é caracterizada pelo acúmulo e excreção de queratan e condroitin sulfato devido à deficiência da enzima lisossomal Galactose–6 sulfatase (GALNS; E.C.3.1.6.4). É uma doença rara cuja incidência varia entre 1:45.000 e 1:640.000. Os aspectos clínicos predominantes estão relacionados com o sistema osteo-articular com efeitos secundários sobre o sistema nervoso central, embora não haja déficit cognitivo. Os achados clínicos, evidentes a partir dos 2 anos, direcionam as análises bioquímicas para confirmação do diagnóstico através de avaliação dos glicosaminoglicanos urinários e de ensaios enzimáticos específicos. A doença é herdada de forma autossômica recessiva. O cDNA revela uma região codificante com 1566 nucleotídeos, que determina uma proteína com 522 aminoácidos. O gene contém 14 exons e foi mapeado em 16q24.3. Já foram descritas 148 mutações e 16 polimorfismos. O gene apresenta grande heterogeneidade molecular, sendo que 46,1% das mutações ocorreram menos de três vezes. Objetivo Identificar as mutações presentes no gene da GALNS em pacientes brasileiros com diagnóstico bioquímico para a MPS IVA; verificar se as mutações novas encontradas são causadoras do fenótipo patológico; e padronizar as técnicas de PCR e SSCP para análise do gene da GALNS. Materiais e Métodos: Seis casos-índice tiveram todo o gene da GALNS amplificados por PCR, seguido de seqüenciamento. Para as mutações novas, primers foram confeccionados para os respectivos exons e a patogenicidade testada por análise de freqüência em 100 controles normais. Condições de PCR e SSCP foram determinadas para cada um dos 4 exons com mutações novas. Sete pacientes novos com diagnóstico bioquímico foram analisados para os exons com as condições pré-estabelecidas. Os controles e pacientes com padrão alterado no gel de SSCP foram seqüenciados. Resultados: Em relação aos seis casos-índice 11 dos 12 alelos tiveram a alteração identificada, revelando seis mutações diferentes. Destas, quatro eram novas (p.G116S, p.N164T, p.L307P e p.S341R) e duas já descritas (p.R386C e p.G139S).Dos 100 controles analisados para cada exon nenhum apresentou o mesmo padrão de migração da amostra mutada, mas foram encontradas novas alterações (p.A107A, p.Y108Y e p.P357P). Entre os pacientes novos, sete dos 14 alelos foram identificados (p.N164T, p.G301C e uma mudança do quadro de leitura). Discussão: As quatro mutações novas identificadas foram consideradas patogênicas uma vez que não estavam presentes nos controles, indicando uma freqüência menor que 1% nesse grupo. As mutações p.G116S, p.N164T e p.G301C (freqüências de 14,3%, 14,3% e 19,0% dos alelos, respectivamente) foram consideradas recorrentes, além das já descritas e também recorrentes p.G139S e p.R386C. Nos quatro exons padronizados encontramos 40% das mutações descritas. Entre as diferentes mutações encontradas em nossos casos-índice uma nova (p.G116S) e duas já descritas (p.G139S e p.R386C) se localizam em regiões CpG. Conclusões: Foram identificadas alterações moleculares em 11 dos 12 alelos de seis pacientes brasileiros com MPS IVA, sendo que as quatro mutações novas encontradas puderam ser classificados como patogênicas; as técnicas de PCR e SSCP para os 4 exons do gene da GALNS foram padronizadas.

A Doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossomal ligada ao X causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidase A, que provoca acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3). O gene que codifica essa enzima está localizado no braço longo do cromossomo X, na região Xq21.33-Xq22, chama-se gene GLA e é composto por 12Kb divididos em sete exons. As manifestações clínicas incluem hipohidrose, angioqueratomas, acroparestesias e opacidade corneana. A progressão da doença leva a doenças vasculares secundárias envolvendo rins, coração e sistema nervoso central. A detecção de mulheres portadoras baseada somente na análise enzimática muitas vezes é inconclusiva. Portanto, a análise de mutações é uma ferramenta fundamental para diagnóstico e aconselhamento genético. A heterogeneidade da DF é alta e a maioria das mutações são privadas. Neste estudo nós descrevemos a análise molecular de seis pacientes homens pertencentes a quatro famílias diferentes e suas mães. O seqüenciamento automatizado dos sete exons do gene GLA revelou a presença de três mutações não conhecidas e uma descrita anteriormente em outra família brasileira. Aparentemente, ambas as famílias não são relacionadas, mas estudos futuros utilizando análise de haplótipos esclarecerão esta situação. Uma mãe era portadora, a outra não. Este estudo confirma a heterogeneidade de mutações que causam DF. Isto também destaca a importância da análise molecular para detecção de portadoras e aconselhamento genético. / Fabry disease is a an X-linked lysosomal disorder due to the deficiency of α- galactosidase A that causes storage of globotriaosylceramide (Gb3). The gene coding for this lysosomal enzyme is located at the long arm of X chromosome, on region Xq21.33 – Xq22, called GLA gene and spans 12kb and is divided in seven exons. Clinical manifestations include hypohidrosis, angiokeratomas, acroparesthesias and corneal opacities. Disease progression leads to vascular disease secondary to involvement of kidney, heart and the central nervous system. Detection of female carriers based solely on enzyme assays is often inconclusive. Therefore, mutation analysis is a valuable tool for diagnosis and genetic counseling. However there is high genetic heterogeneity and most mutations are private. In this study we describe the molecular analysis of six male Fabry patients belonging to four different families and their mothers. Automated sequencing of the seven exons of GLA gene revealed the presence of three unknown mutations and one previously described in another Brazilian family. Apparently, both families are not related but further studies using haplotype analysis shall clarify this question. All but one of the studied mothers were carriers. This study confirms the heterogeneity of mutations in Fabry disease. It also highlights the importance of molecular analysis for carrier detection and genetic counseling.

Introdução: Mucopolissacaridose IVA é uma doença lisossômica, autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. É uma doença rara e a incidência varia de 1:76.000 a 1:640.000 recém-nascidos vivos. Até o momento 319 diferentes mutações causadoras da doença já foram identificadas, o que demonstra a ampla variabilidade genética. Objetivo: Caracterizar o genótipo de pacientes com MPS IVA, analisar 6 polimorfismos intragênicos e identificar os haplótipos presentes em nossos pacientes, através do estudo molecular do gene GALNS. Métodos: O estudo foi realizado em 45 pacientes provenientes das regiões Nordeste, Sudeste, e Sul do Brasil, com diagnóstico bioquímico confirmado para MPS IVA. A análise molecular foi realizada através de PCR seguida de sequenciamento, pelo método de Sanger, a fim de identificar as mutações causadoras da doença. Para o estudo de haplótipos foram analisados 6 polimorfismos intragênicos através de PCR em Tempo Real, pelo método Taqman, em pacientes e controles. Resultados: A análise do gene GALNS, nos 45 pacientes, permitiu a identificação de 18 diferentes mutações, e a caracterização de 6 haplótipos distintos. Das 18 mutações encontradas, 5 apresentaram uma alta frequência (p.Ser341Arg, p.Arg386Cys, p.Gly301Cys, p.Arg94Leu e p.Gly116Ser), além disso, foram encontradas 4 novas mutações em outros três pacientes (p.Gly115Arg, p.Asn45Gly, p.Thr394Ala e c.759-2A>G). Dentre as mutações encontradas com maior frequência, a mutação p.Ser341Arg foi identificada em um maior número de pacientes, sendo a maioria proveniente da região Nordeste. Além disso, todos os pacientes com esta mutação apresentaram um único haplótipo. Conclusão: Os resultados obtidos permitiram a identificação de 18 mutações dentre elas 4 novas mutações. A alta frequência da mutação p.Ser341Arg no Nordeste do Brasil, principalmente no estado da Paraíba nos leva a inferir um possível efeito fundador da doença. Esta mutação foi observada somente na população brasileira e todos os pacientes com mutação em homozigose apresentaramum único haplótipo. Estas análises são importantes para identificar portadores nas famílias, para diagnóstico pré-natal, e também como forma de identificar uma origem comum em mutações frequentes em determinadas populações. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA is an autosomal recessive lysosomal disease, caused by deficiency of N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. It is a rare disease and the incidence ranges from 1: 76,000 to 1:640,000 live births. To date 319 mutations have been identified in this gene, demonstrating the wide variability of disease causing mutations. Objective: Analyze and characterize the genotype of patients with MPS IVA, through molecular analysis of GALNS. Methods: Molecular analysis of 45 patients with confirmed biochemical diagnosis for MPS IVA was performed. Mutation analysis was performed by PCR followed by Sanger sequencing. Haplotype analysis was performed using 6 intragenic polymorphisms by Real-Time PCR. Results: In this study we found 18 different mutations among 45 Brazilian patients and identified 5 common mutations (p.Ser341Arg, p.Arg386Cys, p.Gly301Cys, p.Arg94Leu e p.Gly116Ser). Four novel mutations were also identified through molecular analysis, including: p.Gly115Arg, p.Asn45Gly, p.Thr394Ala e c.759-2A>G. Patients are distributed in Northeast, Southeast and South regions of Brazil. Six different haplotypes were identified among patients. The p.Ser341Arg mutation showed the highest frequency, and most patients are located in the Northeast, additionally, all patients with this mutation show the same haplotype.Conclusion: These analyzes are important to identify carriers in families, for prenatal diagnosis, and in order to identify the mutation origin when certain recurrent mutation is associated with the same haplotype. In this study, we observed a high frequency of p.Ser341Arg mutation in Northeast, mainly in the state of Paraíba. This mutation was detected with higher frequency among patients, and showed only a haplotype. This mutation is unique for the Brazilian population and thus, we could suggest that a possible founder effect for this mutation could exist.

INTRODUÇÃO: As mucopolissacaridoses (MPS) são doenças de depósito lisossômico, caracterizadas pela deficiência de enzimas lisossômicas envolvidas na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs). O acúmulo anormal dessas macromoléculas no interior dos lisossomos provoca alterações estruturais e funcionais, de caráter multissistêmico e progressivo. Os GAGs acumulados também são excretados na urina, onde podem ser identificados através de diversos métodos bioquímicos. Estas doenças estão presentes em todos os grupos étnicos e a incidência conjunta das MPS, é estimada entre 1:10.000 a 1:25.000 nascidos vivos. (Baehner, 2005). A causa das MPS é a deficiência de uma enzima específica na rota de degradação dos GAGs. As MPS são classificadas segundo o tipo de substrato (GAGs) acumulado e a enzima específica deficiente. Na síndrome de Morquio A, ou mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), o substrato acumulado é o queratan sulfato e a enzima deficiente é a N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. (GALNS). Os pacientes afetados por MPS IVA apresentam baixa estatura, disostose múltipla, opacidade de córnea, entre outros sinais e sintomas. O desenvolvimento psicomotor e mental é normal. O método de detecção inicial das MPS baseia-se na identificação dos GAGs, que são excretados em excesso na urina destes pacientes. A presença de queratan sulfato na eletroforese ou a detecção de níveis aumentados na dosagem quantitativa, direciona a investigação laboratorial para a MPS IV. O diagnóstico definitivo se estabelece através da medida da atividade enzimática em leucócitos ou fibroblastos, onde se constata a deficiência enzimática. OBJETIVOS: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um novo método, mais simples, rápido e acessível, para o diagnóstico bioquímico de mucopolissacaridose tipo IVA, utilizando amostras de sangue impregnadas em papel filtro (SIPF). MATERIAIS E MÉTODOS: Amostras de SIPF e leucócitos de 35 pacientes de ambos os sexos, com idade entre 3 e 47 anos, com diagnóstico previamente estabelecido de MPS IVA, pelo método convencional, em leucócitos e /ou fibroblastos, foram analisadas. Para o estabelecimento dos valores de referência, foram estudadas amostras de leucócitos e de SIPF de 54 indivíduos saudáveis (18-50 anos), de ambos os sexos. Após assinatura do termo de consentimento, amostras de sangue periférico de pacientes e controles, foram coletadas, para a obtenção de leucócitos e sangue impregnado em papel filtro.(SIPF). Os ensaios enzimáticos foram realizados nas amostras de leucócitos e SIPF, simultaneamente, para comparar os resultados. RESULTADOS: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de todos os pacientes apresentando MPS IVA, confirmaram a deficiência da atividade enzimática em ambos materiais (leucócitos e SIPF) com uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (Mann-Witney U test, p< 0,001). Neste estudo, a medida de GALNS em amostras de SIPF permitiu a identificação dos pacientes com MPS IVA, com sensibilidade de 100 %. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de SIPF indicaram que amostras coletadas para a medida da atividade de GALNS devem ser mantidas a 4ºC sempre que possível, sendo estáveis nesta temperatura por mais de 30 dias. CONCLUSÕES: Nas condições utilizadas, amostras de SIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA. O método que utiliza amostras de SIPF é mais acessível e rápido, simplificando a etapa de coleta e transporte, podendo ser utilizado para detectar pacientes afetados, especialmente em áreas de difícil acesso para a coleta e transporte de amostras líquidas. / INTRODUCTION: Mucopolysaccharidosis (MPS) are lysosomal deposit diseases characterized by lysosomal enzymes deficiency involved in the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). The abnormal accumulation of these macromolecules inside the lysosomes provokes structural and functional alterations multi-systemically and progressively. The accumulated GAGs are also excreted in the urine, where they may be identified through many different biochemical methods. These diseases occur among all ethnical groups and the combined incidence of MPS is estimated at 1:10.000 to 1:25.000 live births. (Baehner, 2005). The MPS’ cause is the deficiency of a specific enzyme in the GAGs degradation route. The MPS are classified according to a type of substrate accumulated (GAGs) and the deficiency of a specific enzyme. In Morquio syndrome A or Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA), the accumulated substrate is the keratan sulfate and the deficient enzyme is the N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS). The patients affected by MPS IVA present short stature, dysostosis multiplex, corneal opacity, among others signs and symptoms. The cognitive and mental developments are normal. The MPS initial detection method is based on the identification of the GAGs which are excreted in the patients’ urine. The presence of the keratan sulphate in the electrophoresis or the detection of the increased levels in the quantitative dosage directs the laboratory investigation to MPS IV. The definitive diagnosis is established through measuring the enzymatic activity in leukocytes or fibroblasts, in which the enzymatic deficiency is proved. OBJECTIVE: This study’s main purpose is to offer an original, simpler, faster and more accessible method for biochemical diagnosis of Mucopolysaccharidosis type IVA using dried blood samples (DBS). MATERIALS AND METHODS: DBS and leukocytes from 35 patients from both sexes between 3 and 47 years of age with previously established diagnosis of MPS IVA through the conventional method in leukocytes and/or fibroblasts were analyzed. In order to establish reference values DBS and leukocytes samples from 54 healthy people (18-50 years of age) from both sexes were studied. After signing a paper consent form, peripheral blood samples from patients and controls were collected for obtaining leukocytes and dried blood samples (DBS). To validate the method, we made a simultaneous GALNS assay in leukocytes and DBS. RESULTS: The results obtained in the enzymatic assays from all patients presenting MPS IVA confirmed the deficiency of enzymatic activity in both materials (leukocytes and DBS) with a significant statistical difference in relation to the control group. (Mann-Witney U tes, p< 0,001). In this study, the quantity of GALNS in DBS allowed the identification of patients with MPS IVA with sensibility of 100%. The stability tests indicate that DBS samples collected for measuring the activity of GALNS must be kept at 4ºC whenever possible, being stable in this temperature for more than 30 days. CONCLUSION: In the used conditions, DBS were adequate for a safe identification of patients with MPS type IVA. The method which utilizes DBS is cheaper and faster, what simplifies the collection and transportation stage and can be used to detect affected patients especially in difficult access areas for the collection and transportation of liquid samples.

Realizamos um estudo transversal prospectivo com o objetivo de determinar a prevalência de apnéia obstrutiva do sono em um grupo de pacientes sul-americanos com mucopolissacaridose tipo VI sem tratamento prévio ou atual com terapia de reposição enzimática ou transplante de medula óssea. Os critérios de inclusão foram: ter 4 anos ou mais de idade e confirmação bioquímica da doença (níveis reduzidos da atividade da arilsulfatase B, aumento de glicosaminoglicanos (GAGs) urinários e atividade normal de outra sulfatase). Foram avaliados 28 pacientes através de anamnese, exame físico, ecocardiograma Doppler transtorácico e polissonografia realizada em noite inteira. A amostra estudada tinha 14 (50%) meninos. No momento da avaliação, a média de idade foi de 98,5 meses e a média de idade do diagnóstico de MPS VI foi de 48,4 meses. Em 88% da amostra os sintomas iniciaram com menos de 36 meses e em 27% das famílias houve relato de consangüinidade entre os pais. As manifestações clínicas mais freqüentes durante o sono foram roncos e apnéias observadas. Ao exame físico, 78,6% apresentavam macroglossia e 82,1% deformidade torácica tipo pectus carinatum. Três (10,71%) pacientes já tinham realizado adenotonsilectomia e 6 (21,42%) adenoidectomia isoladamente. Os dados polissonográficos evidenciaram apnéia obstrutiva do sono em 23 (85,1%) pacientes, sendo 4 com transtorno leve, 5 moderado e 14 grave. A média do índice de apnéia hipopnéia (IAH) foi de 19,84 ± 26,25 eventos/hora, da saturação periférica da oxihemoglobina (SpO2) 93,25 ± 5,06%, do nadir da SpO2 80,29 ± 10,01% e do pico do dióxido de carbono final exalado (EtCO2) 44,1 ± 6,01 mmHg. A ocorrência de apnéias centrais foi rara. Quatorze indivíduos da amostra (50%) tiveram evidência de hipertensão pulmonar (HP) documentada através de ecocardiograma. Foi observada associação positiva entre a média e o nadir da SpO2 mais baixos e a presença de HP. No grupo com HP, a média e o nadir da SpO2 foram de 91,2 ± 6,4% e 75,4 ± 10,9% respectivamente, enquanto que nos pacientes sem HP os valores de média e nadir da SpO2 foram 95,3 ± 1,8% e 85,2 ± 6,1% respectivamente (p=0,037 para média; p=0,007 para nadir). A presença de apnéias observadas durante o sono foi a variável mais importante em predizer HP nessa amostra (p=0,016; OR 9,9; IC 1,5 a 63,7). As manifestações clínicas sugestivas de alterações respiratórias durante o sono não apresentaram correlação significativa com o IAH, a média e o nadir de SpO2 e o pico de EtCO2. Também não houve correlação significativa entre a excreção urinária de GAGS e a atividade enzimática com resultado da polissonografia e do ecocardiograma. Concluímos que a prevalência de apnéia obstrutiva do sono nos pacientes com mucopolissacaridose tipo VI é elevada e o nível de dessaturação apresenta correlação positiva com a presença de hipertensão pulmonar. Os sintomas durante o sono não apresentaram associação com o resultado da polissonografia. A presença de apnéias observadas durante o sono foi a variável mais importante para predizer HP. / This prospective cross-sectional study was conducted to determine the prevalence of obstructive sleep apnea in a group of South American patients with mucopolysaccharidosis type VI who had no previous or current treatment with enzyme replacement or bone marrow transplant. Inclusion criteria were: age 4 years or older; and biochemical confirmation of the disease – reduced arylsulfatase B activity, increased glycosaminoglycans (GAGs) in urine, and normal activity of at least one other sulfatase. Twenty-eight patients were examined and data were collected from clinical history, physical examination, transthoracic Doppler echocardiogram and overnight polysomnography. Of the 28 participants, 14 (50%) were boys; mean age at evaluation was 98.5 months, and mean age at MPS diagnosis, 48.4 months. Symptoms started before 38 months of age in 88% of the sample; 27% reported parental consanguinity. The most frequent clinical symptoms during sleep were snoring and witnessed apnea. Physical examination revealed that 78.6% had macroglossia, and 82.1%, pectus carinatum. The most frequent clinical symptoms during sleep were snoring and witnessed apnea. Physical examination revealed that 78.6% had macroglossia, and 82.1%, pectus carinatum. Three (10.71%) patients had already undergone adenotonsillectomy, and 6 (21.42%), isolated adenoidectomy. Polysomnography results showed that 23 (85.1%) patients had obstructive sleep apnea: 4 mild, 5 moderate, and 14 severe. Mean apnea-hypopnea index (AHI) was 19.84 ± 26.25 events/hour, oxygen saturation (SpO2), 93.25 ± 5.06%, SpO2 nadir, 80.29 ± 10.01%, and peak end-tidal carbon dioxide (EtCO2), 44.1 ± 6.01 mmHg. Central apneas were rare. Pulmonary hypertension (PH) was detected by echocardiography in 14 (50%) patients. Lower SpO2 mean and nadir were positively associated with PH. In the group of patients with PH, SpO2 mean and nadir were 91.2 ± 6.4% and 75.4 ± 10.9%, and in the group without PH, 95.3 ± 1.8% and 85.2 ± 6.1% (p=0.037 for mean; p=0.007 for nadir). Witnessed apneas during sleep were the most important variable to predict PH in this sample (p=0.016; OR 9.9; CI, 1.5 to 63.7). Clinical signs suggestive of respiratory abnormalities during sleep were not significantly correlated with AHI, SpO2 mean and nadir, or peak EtCO2. There was no significant correlation between GAGs in urine or enzyme activity and polysomnography or echocardiogram results. The prevalence of obstructive sleep apnea in patients with mucopolysaccharidosis type VI was high, and the level of desaturation was positively correlated with the presence of pulmonary hypertension. Symptoms observed during sleep were not associated with polysomnography results. Witnessed apneas during the sleep were the most important variable to predict PH.

Introdução: Mucopolissacaridose IVA é uma doença lisossômica, autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. É uma doença rara e a incidência varia de 1:76.000 a 1:640.000 recém-nascidos vivos. Até o momento 319 diferentes mutações causadoras da doença já foram identificadas, o que demonstra a ampla variabilidade genética. Objetivo: Caracterizar o genótipo de pacientes com MPS IVA, analisar 6 polimorfismos intragênicos e identificar os haplótipos presentes em nossos pacientes, através do estudo molecular do gene GALNS. Métodos: O estudo foi realizado em 45 pacientes provenientes das regiões Nordeste, Sudeste, e Sul do Brasil, com diagnóstico bioquímico confirmado para MPS IVA. A análise molecular foi realizada através de PCR seguida de sequenciamento, pelo método de Sanger, a fim de identificar as mutações causadoras da doença. Para o estudo de haplótipos foram analisados 6 polimorfismos intragênicos através de PCR em Tempo Real, pelo método Taqman, em pacientes e controles. Resultados: A análise do gene GALNS, nos 45 pacientes, permitiu a identificação de 18 diferentes mutações, e a caracterização de 6 haplótipos distintos. Das 18 mutações encontradas, 5 apresentaram uma alta frequência (p.Ser341Arg, p.Arg386Cys, p.Gly301Cys, p.Arg94Leu e p.Gly116Ser), além disso, foram encontradas 4 novas mutações em outros três pacientes (p.Gly115Arg, p.Asn45Gly, p.Thr394Ala e c.759-2A>G). Dentre as mutações encontradas com maior frequência, a mutação p.Ser341Arg foi identificada em um maior número de pacientes, sendo a maioria proveniente da região Nordeste. Além disso, todos os pacientes com esta mutação apresentaram um único haplótipo. Conclusão: Os resultados obtidos permitiram a identificação de 18 mutações dentre elas 4 novas mutações. A alta frequência da mutação p.Ser341Arg no Nordeste do Brasil, principalmente no estado da Paraíba nos leva a inferir um possível efeito fundador da doença. Esta mutação foi observada somente na população brasileira e todos os pacientes com mutação em homozigose apresentaramum único haplótipo. Estas análises são importantes para identificar portadores nas famílias, para diagnóstico pré-natal, e também como forma de identificar uma origem comum em mutações frequentes em determinadas populações. / Background: Mucopolysaccharidosis IVA is an autosomal recessive lysosomal disease, caused by deficiency of N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. It is a rare disease and the incidence ranges from 1: 76,000 to 1:640,000 live births. To date 319 mutations have been identified in this gene, demonstrating the wide variability of disease causing mutations. Objective: Analyze and characterize the genotype of patients with MPS IVA, through molecular analysis of GALNS. Methods: Molecular analysis of 45 patients with confirmed biochemical diagnosis for MPS IVA was performed. Mutation analysis was performed by PCR followed by Sanger sequencing. Haplotype analysis was performed using 6 intragenic polymorphisms by Real-Time PCR. Results: In this study we found 18 different mutations among 45 Brazilian patients and identified 5 common mutations (p.Ser341Arg, p.Arg386Cys, p.Gly301Cys, p.Arg94Leu e p.Gly116Ser). Four novel mutations were also identified through molecular analysis, including: p.Gly115Arg, p.Asn45Gly, p.Thr394Ala e c.759-2A>G. Patients are distributed in Northeast, Southeast and South regions of Brazil. Six different haplotypes were identified among patients. The p.Ser341Arg mutation showed the highest frequency, and most patients are located in the Northeast, additionally, all patients with this mutation show the same haplotype.Conclusion: These analyzes are important to identify carriers in families, for prenatal diagnosis, and in order to identify the mutation origin when certain recurrent mutation is associated with the same haplotype. In this study, we observed a high frequency of p.Ser341Arg mutation in Northeast, mainly in the state of Paraíba. This mutation was detected with higher frequency among patients, and showed only a haplotype. This mutation is unique for the Brazilian population and thus, we could suggest that a possible founder effect for this mutation could exist.