Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Os estudos das alterações de componentes da matriz extracelular (MEC) auxiliam na compreensão da fisiopatologia do desenvolvimento dos tumores. A investigação e identificação de novos marcadores moleculares em amostras de tecidos, sangue ou urina para o estadiamento da doença e melhor informação do prognóstico também ajuda na descoberta de moléculas alvo para novas alternativas de tratamento com menor toxicidade e maior eficiência. Objetivos: Identificar e quantificar glicosaminoglicanos e isoformas de heparanases nos tecidos tumorais e não neoplásicos de pacientes com carcinoma de células renais e glicosaminoglicanos sulfatos e ácido hialurônico na urina de pacientes com carcinoma de células renais comparando-se com indivíduos saudáveis. Métodos: Este estudo foi constituído da análise de 24 pacientes submetidos à nefrectomia radical ou parcial apresentando diagnóstico anatomopatológico de carcinoma de células renais, sendo quantificada a expressão da heparanase-1 (HPA1) por RT-PCR semi-quantitativo e RT-PCR em tempo real em amostras de tecido de carcinoma de células renais (tecido tumoral e não neoplásico). A expressão das isoformas de heparanases (HPA1 e HPA2) foi analisada utilizando imunohistoquímica. O perfil de glicosaminoglicanos sulfatados foi identificado e quantificado em 11 fragmentos de tecidos tumorais e tecidos não neoplásicos de carcinoma de células renais, utilizando eletroforese em gel de agarose. Os glicosaminoglicanos sulfatados e ácido hialurônico também foram analisados em amostras de urina dos pacientes com carcinoma de células renais, comparando-se com amostras de indivíduos saudáveis. Resultados: Os tecidos tumorais apresentaram aumento significativo da expressão da heparanase-1 (HPA1) comparativamente com os tecidos não neoplásicos, respectivamente, (3,99 ± 0,25) e (2,09 ± 0,20), (P < 0,05). A análise imunohistoquímica demonstrou que ambas isoformas HPA1 e HPA2, encontram-se expressas em tecido tumoral e não neoplásico de carcinoma de células renais. Entretanto, HPA1 apresenta aumento significativo de imunomarcação em tecido tumoral quando comparado com tecido não neoplásico (P < 0,002). Tal resultado não foi observado para a isoforma HPA2. Os resultados sugerem que a isoforma enzimaticamente ativa de 50 kDa da HPA1, identificada com o anticorpo HPA1 C20 parece ser a isoforma diferencialmente expressa nos tumores de células renais. Os tecidos tumorais apresentaram significativa diminuição na quantidade de heparam sulfato e dermatam sulfato e aumento do condroitim sulfato comparativamente com os tecidos não neoplásicos de carcinoma de células renais, respectivamente, HS (3,6 ± 3,5) e (17,6 ± 20,5), (P < 0,007); DS (16,9 ± 21,7) e (44,2 ± 28,5), (P < 0,04); CS (50,6 ± 37,2) e (10,0 ± 9,4), (P < 0,001). As análises de glicosaminoglicanos sulfatados urinários e ácido hialurônico entre os pacientes com carcinoma de células renais e indivíduos saudáveis não apresentaram diferenças estatísticas significantes. Conclusão: HPA1 e o condroitim sulfato que essencialmente encontram-se aumentados nos tecidos tumorais sugerem que tais moléculas possam estar envolvidas com modificações e remodelação da matriz extracelular podendo participar do processo de desenvolvimento dos tumores de células renais, portanto, servir como marcadores e/ou alvo de terapias anti-tumorais em estudos futuros / Introduction: The studies of extracellular matrix (ECM) alterations can be useful to understand the physiopathology of tumor development. The research and identification of new molecular markers in the tissues, blood and urine samples to perform a better diagnostic and prognostics can also help to discover new target molecules for alternative treatment with less toxicity and more efficiency. Objectives: Identify and quantify glycosaminoglycans and heparanases isoforms in the tumor tissues and non neoplasic tissues from renal cell carcinoma patients and sulfated glycosaminoglycans and hyaluronic acid in the urine samples from renal cell carcinoma patients compared to healthy individuals. Methods: This study evaluated 24 patients subjected to radical or partial nephrectomy with previous renal cell carcinoma diagnostic from anatomophatology. Heparanase-1 (HPA1) expression was quantified by semi-quantitative RT-PCR and real time RT-PCR, using renal cell carcinoma samples (tumor and non neoplasic tissues). Heparanases isoforms (HPA1 and HPA2), were also analyzed by imunohistochemistry. Sulfated glycosaminoglycans profile had been identified and quantified in 11 tumor and non neoplasic samples from renal cell carcinoma patients using agarose gel electrophoresis. Sulfated glycosaminoglycans and hyaluronic acid were also analyzed in urine samples from renal cell carcinoma patients compared to the healthy individuals’ samples. Results: There was a significant higher heparanase-1 (HPA1) expression in the tumor tissues compared with the non neoplasic tissues, respectively, (3.99 ± 0.25) and (2.09 ± 0.20), (P < 0.05). Imunohistochemistry analysis had shown that both HPA1 and HPA2 isoforms were expressed in the tumor and non neoplasic tissues from renal cell carcinoma patients. However, HPA1 presents a significant higher immunolabeling in the tumor tissue compared to the non neoplasic tissue (P < 0.002). The same result was not observed for HPA2 isoform. Taken together the results suggest that the enzymatically active 50 kDa isoform of HPA1, identified using HPA1 C20 antibody, seems to be the isoform diferentially expressed in renal cell tumors. Tumor tissues presented significant decrease of heparan sulfate (HS) and dermatan sulfate (DS) and higher chondroitin sulfate(CS), compared to the non neoplasic renal cell carcinoma tissues, respectivelly, for HS (3.6 ± 3.5) and (17.6 ± 20.5), (P < 0.007); DS (16.9 ± 21.7) and (44.2 ± 28.5), (P < 0.04); CS (50.6 ± 37.2) and (10.0 ± 9.4), (P < 0.001). The analysis showed that sulfated glycosaminoglycans and hyaluronic acid in the renal cell patients and healthy individual urinary samples did not present any significant statistic difference. Conclusions: HPA1 and chondroitin sulfate are essentially higher in tumor tissues suggesting that these molecules could be involved with extracellular matrix modifications and remodelling that participates into renal cell tumor development, and consequently be used as markers and/or target for antitumor therapy in future studies. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

NUNES, Rodolfo de Melo. Avaliação qualitativa e quantitativa de glicosaminoglicanos em pacientes com osteoartrite. 2013. 52 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T16:21:39Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmnunes.pdf: 710852 bytes, checksum: a84d4bba0dde9f9afb47a0f5b570f489 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T16:23:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmnunes.pdf: 710852 bytes, checksum: a84d4bba0dde9f9afb47a0f5b570f489 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T16:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rmnunes.pdf: 710852 bytes, checksum: a84d4bba0dde9f9afb47a0f5b570f489 (MD5) Previous issue date: 2013 / Articular cartilage is na avascular tissue composed of chondrocytes scattered in an abundant extracellular matrix (ECM) that lines the joint surfaces and protects the bone ends. In addition to the intersticial fluid, the ECM is composed of proteoglycans, glycosaminoglycans (GAGs) and glycoproteins. Joint diseases such as osteoarthritis (OA), promote the degradation of articular cartilage and subchondral bone sclerosis, leading to chronic pain and functional impairment of the joints. In this context, the quantification of GAGs is used as a means to study the physiological or pathological changes of articular cartilage. The objective this study was to evaluate the biochemical changes of the articular cartilage of human and rat normal or affected by OA. The human cartilage were obtained from patients submitted to arthroplasty for OA or fracture. Male Wistar rats (150-180g) were submitted to the anterior cruciate ligament transection (ACLT). Sham group was submitted to only to surgery without transection. Initialy, the cartilage samples were submitted to the action of the enzymatic complex PROLAV 750R, getting to the end of the process, the GAGs. These were identified and quantified in agarose gel (0.6%) and molar mass was assessed in polyacrylamide gel (6% w/v). The results were expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M.) were submitted to ANOVA and Tukey’s test (P<0.05) or “t” test of Student (P<0.05).In rats, the effective proteolysis was significantly decreased after 70 days of ACLT (P<0.05). In the quantification of GAGs, there was a significant increase in GAG content after 70 days of ACLT. In humans, the percentage of mass degraded by PROLAV was altered by presence of OA. The OA patients under 80 years of age showed a significant increase in the amount of GAGs compared to the control group. In the electrophoretic mobility, GAGs of patients with OA showed abnormalities of the molar mass. These findings show that both cartilage from patients affected by OA as experimental animals subjected to OA have lower effective proteolysis, increasing the amount of CS and alteration of the molar mass. / A cartilagem articular é um tecido avascular constituído por condrócitos dispersos em uma matriz extracelular abundante (MEC) que reveste as superfícies articulares e protege as extremidades ósseas. Além do fluido intersticial, a MEC é composta por proteoglicanos, glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas. Doenças articulares, como a osteoartrite (OA), promovem a degradação da cartilagem articular e esclerose do osso subcondral, levando à dor crônica e comprometimento funcional das articulações. Neste contexto, a quantificação de GAGs é utilizada para estudar o papel das alterações fisiológicas ou patológicas da cartilagem articular. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar as alterações bioquímicas da cartilagem articular humana e de rato com ou sem a OA. As cartilagens humanas foram obtidas de pacientes submetidos à artroplastia por OA ou por fratura. Ratos Wistar machos (150-180g) foram submetidos à osteoartrite experimental que consiste na transecção do ligamento cruzado anterior (TLCA). Grupo sham foi submetido apenas ao procedimento cirúrgico, sem transecção. Inicialmente, as amostras de cartilagem foram submetidas à ação do complex enzimático PROLAV 750R, obtendo-se ao final do processo, os GAGs. Esses foram identificados e quantificados em gel de agarose (0,6%) e a massa molar foi avaliada em gel de poliacrilamida (6% w/v). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m.), submetidos à ANOVA e teste de Tukey (P<0,05) ou teste “t” de Student (P<0,05). Em ratos, o rendimento da degradação da cartilagem pela PROLAV 750R foi significativamente diminuída após 70 dias de TLCA (P<0,05). Quanto à quantificação de GAGs, houve um aumento significativo do conteúdo de GAGs após 70 dias de TLCA. Em humanos, o percentual de massa degradada pela PROLAV foi reduzida na presença de OA. Os pacientes com OA com idade inferior a 80 anos apresentaram aumento significativo da quantidade de GAGs, quando comparado ao grupo controle. Quanto à mobilidade eletroforética, GAGs de pacientes com OA apresentaram alteração da massa molar. Esses achados mostram que tanto a cartilagem proveniente de pacientes acometidos por OA quanto animais submetidos à OA experimental apresentam menor rendimento à degradação enzimática, aumento da quantidade de CS e alteração da massa molar.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:57:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Proposição: Analisar o perfil dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) na uretra de ratas nuligestas ou prenhas submetidas a cesárea, parto normal ou trauma simulado de parto com balão intravaginal, comparando os resultados obtidos após quatro dias e doze semanas dos procedimentos. Métodos: 110 ratas foram distribuidas em onze grupos: Grupos A1 e A2 - ratas nuligestas; Grupos B1 e B2 - ratas nuligestas submetidas a insuflação vaginal; Grupos C1 e C2 - ratas submetidas a cesárea; Grupos D1 e D2 - ratas submetidas a cesárea seguida de insuflação vaginal; Grupos E1 e E2 - ratas prenhas que evoluíram espontaneamente para parto vaginal; Grupo F - ratas sacrificadas no 20° dia de prenhez. Os animais dos grupos A1, B1, C1, D1 e E1 foram sacrificados após quatro dias e, os dos grupos A2, B2, C2, D2 e E2, após doze semanas dos procedimentos. Os GAGs condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS) foram extraídos por proteólise e determinados por densitometria após migração eletroforética em gel de agarose. Resultados: Observou-se maior expressão de DS em relação ao HS em todos os grupos. Detectou-se CS apenas no grupo de ratas prenhas (Grupo F). Na avaliação quatro dias após o trauma, observou-se que, nas ratas prenhas (Grupo F), houve quantidade maior de GAGs totais em relação às ratas dos grupos B1, C1, D1 e E1; maior quantidade de HS em comparação às ratas dos grupos A1, B1, C1, D1 e E1 e de DS em relação às do grupo E1. Na avaliação após doze semanas, observou-se quantidade maior de GAGs totais, DS e HS nas ratas do grupo cesárea com trauma (D2) em relação às dos grupos A2, B2, C2 e E2. Conclusões: Houve aumento da quantidade de GAGs totais, DS e HS na uretra de ratas submetidas a trauma com insuflação vaginal após cesárea em relação às ratas nuligestas com ou sem insuflação, ratas pós-cesárea sem insuflação e pós-parto natural, avaliadas doze semanas após o procedimento. Na análise quatro dias após os procedimentos não houve diferença na quantidade de GAGs entre todos os grupos, exceto pelo grupo de ratas prenhas, que apresentou quantidade significativamente maior de GAGs. / Objective: This study was undertaken to evaluate the sulfated glycosaminoglycan (GAGs) profile in the urethra of adult female rats that had a cesarean section, vaginal delivery or intravaginal ballooning by comparing the results 4 days and 12 weeks after the procedures. Methods: 110 rats were divided into 11 groups. Groups A1 and A2: nuliparous rats; Groups B1 and B2: nuliparous rats that had vaginal ballooning; Group C1 and C2: primiparous rats that had cesarean section without vaginal ballooning; Groups D1 and D2: primiparous rats that had cesarean section followed by vaginal ballooning; Groups E1 and E2: primiparous rats that had vaginal delivery and Group F: pregnant rats sacrificed on the 20thday. Groups A1, B1, C1, D1 and E1 were sacrificed four days after the procedures and groups A2, B2, C2, D2 e E2 were sacrificed 12 weeks after the procedures. Thereafter, the urethras of the animals were removed and processed to yield a dry powder from which the GAGs content was determined by densitometry following agarose gel electrophoresis. Results: Dermatan sulfate (DS) was the predominant glycosaminoglycan in all groups. Condroitin sulfate (CS) was found only in group F (pregnant rats). In the evaluation four days after the procedures, results showed a significant increase in total GAGs in group F when compared to groups B1, C1, D1 and E1; a significant increase in HS in group F when compared to groups A1, B1, C1, D1 and E1; and a significant increase in DS in group F when compared to group E1. The evaluation 12 weeks after the procedures indicated a significant increase in total GAGs, DS and HS in group D2 when compared to groups A2, B2, C2 and E2. Conclusions: There was a significant increase in total GAGs, DS and HS in the urethra of rats that had cesarian section plus intravaginal balooning in the evaluation 12 weeks after the prcodures, in comparison with nuliparous rats with or without balooning, primiparous rats that had vaginal delivery and rats that had cesarian section without balooning. The evaluation 4 days after the procedures showed no difference in the level of GAGs between all the groups, except for the group of pregnant rats, which showed a significant increase of GAGs. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: a cistite intersticial é doença crônica do trato urinário inferior cujos sintomas são: aumento da freqüência urinária, nictúria, dor pélvica ou perineal que piora com a repleção vesical e melhora com a micção. A etiopatogenia não é totalmente conhecida, mas há indícios de que os glicosaminoglicanos e proteoglicanos que revestem o urotélio vesical possam participar da sua gênese. A perda destes componentes protetores facilitaria o contato de íons e solutos presentes na urina com as porções mais profundas do urotélio desencadeando e perpetuando um processo inflamatório local. Para tentar entender seu metabolismo, investigamos o comportamento dos glicosaminoglicanos na urina e no tecido (biópsia do urotélio vesical) de pacientes portadoras de cistite intersticial e de incontinência urinária de esforço genuína. Casuística e métodos: o perfil e expressão gênica de glicosaminoglicanos no tecido, e o perfil dos glicosaminoglicanos da urina de 11 pacientes com cistite intersticial foram comparados aos de 11 pacientes com incontinência urinária de esforço. A análise estatística foi feita através de teste T e Anova, considerando significativos valores p<0,05. Resultados: verificamos que pacientes com cistite intersticial excretam menor concentração de glicosaminoglicanos na urina do que as portadoras de incontinência urinária de esforço (0,45 ± 0,11 x 0,62 ± 0,13 g/mg creatinina, p<0,05), porém sem redução do conteúdo de glicosaminoglicanos no urotélio. Na imunofluorescência o urotélio de pacientes com cistite intersticial mostrou maior marcação de TGF-beta, decorim (um proteoglicano de condroitim/dermatam sulfato), fibronectina e de ácido hialurônico. Foi identificada menor expressão gênica (PCR em tempo real) das sintases e uma hialuronidase do ácido hialurônico no urotélio das cistites intersticiais. Conclusão: a combinação desses resultados sugere que os glicosaminoglicanos podem estar relacionados ao processo contínuo de inflamação e remodelamento do urotélio disfuncional presente na cistite intersticial. O estudo da expressão gênica pode representar uma altenativa para o entendimento da doença. / Introduction: interstitial cystitis is a chronic disease of the lower urinary tract whose symptoms are: increased urinary frequency, nocturia, perineal or pelvic pain that worses with bladder filling and improves with urination. The pathogenesis is not fully known, but there is evidence that proteoglycans and glycosaminoglycans lining the bladder urothelium can participate in its genesis. The loss of these protective compounds facilitate the contact of ions and solutes in the urine with deeper portions of bladder wall triggering and perpetuating a local inflammatory process. We investigated GAG behavior in urine and tissue (biopsy of bladder urothelium) of patients with IC/PBS and genuine stress urinary incontinence (SUI) in an attempt to better understand its metabolism. Patients and Methods: gene expression and glycosaminoglycans profile in tissue, and glycosaminoglycans profile in urine of 11 patients with interstitial cystitis were compared to 11 patients with pure urinary stress incontinence. Statistical analysis were performed using t Student test and Anova, considering significant when p<0,05. Results: patients with interstitial cystitis excreted lower concentration of glycosaminoglycans in urine when compared to those with pure urinary stress incontinence (respectively 0.45 + 0.11 x 0.62 + 0.13 mg/mg creatinine, p< 0.05). However, there was no reduction of the content of glycosaminoglycans in the urothelium of both patients. The immunofluorescence study showed that patients with interstitial cystitis had a stronger staining of TGF-beta, decorin (a proteoglycan of chondroitin/dermatan sulfate), fibronectin and hyaluronic acid. We were able to indentify by real-time PCR lower gene expression of hyaluronic acid synthases and hyaluronidase in the urothelium of patients with interstitial cystitis. Conclusion: the results suggest that glycosaminoglycans may be related to the ongoing process of inflammation and remodeling of the dysfunctional urothelium that is present in the interstitial cystitis. The study of the gene expression may represent an alternative to understand the disease

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5) 69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5) 69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi. During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus. The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate (KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes. In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the recognition of sulfated glycosaminoglycans

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 francisco_junior_ioc_mest_2007.pdf: 5291215 bytes, checksum: 88ec236330fd3ac74ad110315d9ceb1b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20µg/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou três fragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitas controles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa. Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/N-sulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento N-acetilado ou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com diferentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs)... (...) O declínio da sulfatação resultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mM de clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8 kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35S-Metionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandas majoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressão superior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas na fração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da coluna de afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi... (...) Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi. / The ability of Trypanosoma cruzi to recognize molecules at the surface of both the phagocytic and non-phagocytic cells is essential to its survival in the vertebrate host. The role of the sulfated proteoglycans in the cell reco gnition process has been reported in several human pathogens, including T. cruzi . Data from our group have demonstrated the participation of heparan sulfated proteoglycan (HSP G) of cardiomyocytes in the invasion for forms trypomastigotes. However, the structure of th e HSPG molecule involved in the receptor-ligand interaction and the role of other s ulfated glycosaminoglycans (GAGs) in the invasion process have not been elucidated yet. To evaluate the participation of GAGs in T. cruzi invasion, trypomastigotes, clone Dm28c, were pre-treated with 20μg/ml of heparin, ke ratan sulfate (KS) or three distinct fragments of heparan sulfate (HS) obtained by enzym atic (heparitinase I and II) and nitrous acid treatments. For competition assays, the untrea ted or soluble GAGs pre-treated parasites were incubated for 2h at 37°C with the ca rdiomyocyte cultures and the percentage of infection was determined after Giemsa staining. Our results revealed a significant inhibition of the infection index of 84.8% and 45% after treatment of the parasites with heparin and the N-acetylated/ N-sulfated fragment, respectively, suggesting the important role of the ([IdoUA-GlcNAc]-[GlcUA-GlcNS] 3 -[GlcUA-GlcNAc] 4 [GlcNAc]) domain of the HS chain in the T. cruzi -cardiomyocyte recognition. In contrast, the treatm ent of the parasites with KS, N- acetylated or N-sulfated fragments did not display any effect in the invasion process. The role of sulfation in the recognition and invasion p rocess was evaluated by treating the cardiomyocytes cultures for 16h at 37°C with differ ent concentrations of sodium chlorate, followed by trypomastigotes infection (2h). The dec line of sulfation resulted in the reduction (dose dependent) of the infection index, achieving inhibition levels of 26%, 48.5% and 73.6% after treatment of cardiomyocyte cultures with 25mM , 50mM and 75mM of sodium chlorate, respectively, suggesting the participation of negat ive charge as modulator of the specific recognition with the NA/NS domain of HS chain. Additionately, biochemical assays were performed to characterize the heparin binding protein present at the surface of T. cruzi . Two major protein bands of 65.8 kDa and 59 kDa were identified in the total protein extract of all evolutive forms of T. cruzi by Western blotting , using biotin conjugated-heparin, -chondroitin sulfa te (CS) and -HS. The T. cruzi heparin ligand was isolated by association of Triton X-114 extraction method and heparin-Sepharose affinity chromatography. After metabolic labeling ( 35 S-Methionine), the hydrophobic proteins were isolated by affinity column and separated by S DS-PAGE, revealing a protein profile, similar to total protein extract, with two major ba nds (65.8 kDa and 59 kDa) eluted with 0.5M and 1M NaCl in trypomastigotes and epimastigotes, r espectively. The isotopic analysis also revealed a higher expression of heparin ligand (1.3 -2X) in trypomastigotes when compared to epimastigotes. The heparin binding proteins were detected at membrane fraction of epimastigotes obtained by cell fractionation method ology associated to the affinity column purification. The detection of proteins eluted from heparin affinity column with biotinilated heparin, CS and HS by Western blotting revealed intense labeling mainly at the 59 kDa protein. In addition, the analysis of the proteins by denaturant electrophoresis revealed the presence of two protein band in both trypomastigote s and epimastigotes forms of T. cruzi . Complementary biochemical assays will be carried ou t to get more detailed information about the T. cruzi heparin binding protein.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ErlaneMR_TESE.pdf: 2930753 bytes, checksum: 60680b8d47d48894e89a1b9c7d67c6e6 (MD5) Previous issue date: 2014-06-02 / As mucopolissacaridoses (MPS) s?o doen?as gen?ticas raras decorrente da defici?ncia de enzimas lisossomais envolvidas no catabolismo de glicosaminoglicanos, resultando em um amplo espectro de manifesta??es cl?nicas, progressivas e multissist?micas, exigindo tratamento por uma equipe multidisciplinar. Embora o Nordeste brasileiro seja uma regi?o com grande taxa de consang?inidade e um efeito fundador envolvendo MPS, n?o h? estudos caracterizando os pacientes dessa regi?o. Nosso objetivo foi determinar o perfil epidemiol?gico, cl?nico e gen?tico de casos n?o publicados com MPS provenientes do Cear?, identificando as diferen?as entre outros estudos com MPS e poss?veis problemas a serem enfrentados para a realiza??o do diagn?stico precoce. O estudo foi seccional, descritivo, com amostra de pacientes com MPS em acompanhamento no Hospital Infantil Albert Sabin e Hospital Geral Cesar Cals no per?odo de 2006-2013. Os dados foram obtidos a partir da avalia??o cl?nica, revis?o de prontu?rios m?dicos e entrevista com os pacientes e/ou familiares realizadas pelo investigador principal. Cinquenta e tr?s pacientes foram inclu?dos no estudo (36 do sexo masculino), sendo 6 MPS I, 17 MPS II, 7 MPS III (3 MPSIII-A, 3 MPS III-B, 1 MPS III-C), 7 MPS IV-A, 16 de MPS VI. O ?bito ocorreu em 16 casos (3 MPS I, MPS II 6, 1 MPS IIIA , IIIB 1MPS , 1 MPS IV , 4 MPS VI). A amostra foi composta principalmente por crian?as. Houve elevada taxa de consang?inidade e recorr?ncia familiar. Os tipos mais comuns foram MPS II e MPS VI. Exceto para macrossomia em MPS II, os dados de nascimento indicam que n?o houve risco para desenvolvimento de viii complica??es perinatais. Os sintomas iniciaram em crian?as com menos de 2 anos. As manifesta??es cl?nicas foram heterog?neas exceto para atraso no desenvolvimento neurol?gico em MPS III e manifesta??es esquel?ticas em MPS IV. As principais caracter?sticas cl?nicas foram macrocefalia, baixa estatura, altera??es odontol?gicas, respirat?rias, card?acas, hepatoesplenomegalia, h?rnia umbilical, rigidez articular e anormalidades esquel?ticas. A terapia de reposi??o enzim?tica foi institu?da em 26 casos (4 MPS I, 10 MPS II, 12 MPS VI). Os problemas s?cio-econ?micos das fam?lias, o amplo espectro de sintomas e a gravidade da doen?a foram causas das dificuldades em realizar a avalia??o peri?dica pela equipe multidisciplinar, al?m de exames complementares de maior custo para determinar as complica??es da doen?a. Este foi o maior estudo transversal sobre MPS no Nordeste do Brasil. Em contraste com a maior incid?ncia de MPS I na maioria das popula??es ocidentais, houve maior incid?ncia de MPS II e VI. As altera??es respirat?rias foram um dos principais contribuintes para a mortalidade precoce, exceto nos casos de MPS I, em que a cardiomiopatia foi prevalente. A menor expectativa de vida ocorreu em MPS I. O envolvimento cognitivo foi comum em casos graves e o maior n?mero de ?rg?os envolvidos representou maior risco de morrer. Para o diagn?stico precoce, deve-se buscar indiv?duos afetados em fam?lias em que h? parentes com MPS, al?m do maior reconhecimento de sinais e sintomas de MPS por profissionais de sa?de

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.