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Caracterização do gene que codifica a enzima tirosina aminotransferase (TcTAT) em populações do Trypanosoma cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol / Characterization of the gene that codifies the enzyme tyrosine aminotransferase (TAT) in sensible and resistant populations of the Trypanosoma cruzi to benzonidazole

Rego, Juciane Vaz January 2007 (has links)
Made available in DSpace on 2012-05-07T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000017.pdf: 2555842 bytes, checksum: e2553875bf177a729d0c62a579e89fee (MD5) Previous issue date: 2007 / A Tirosina aminotransferase (TAT) é uma enzima importante no metabolismo deaminoácidos aromáticos. Existem várias diferenças bioquímicas entre a TAT demamíferos e a de Trypanosoma cruzi (TcTAT). Além disso, o gene TcTAT estásuperexpresso em cepas do parasito que são resistentes ao benzonidazol (BZ),droga atualmente usada na quimioterapia da doença de Chagas. Dessa forma a TATé indicada como um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentesquimioterapêuticos. No presente estudo, caracterizamos o gene da TcTAT em 14cepas e clones do T cruzi resistentes e sensíveis ao BZ. Observamos um únicotranscrito de mRNA de 2,0 Kb em todas as amostras do parasito. Os níveis demRNA de TcTAT foram similares em todas as amostras com exceção das cepasresistentes 17LER e BZR, que apresentaram níveis de mRNA duas vezes maiorcomparado com seus pares sensíveis 17WTS e BZS. O gene TcTAT estáorganizado em arranjos multicópias em tandem e está localizado em 8 bandascromossômicas que variam de 785 a 2500Kb. Não observamos amplificação doTcTAT no genoma do parasito. Uma proteína expressa de 42KDa pelo TcTAT estápresente em todas amostras do T. cruzi. Não observamos nenhuma correlação forteentre o gene TcTAT e resistência a drogas no T. cruzi, entretanto os resultados nãoexcluem que TcTAT possa atuar via mecanismo secundário, juntamente com genesde outras enzimas
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Caracterização do gene que codifica a enzima álcool desidrogenase (TcADH) e associação da sua baixa expressão com o fenótipo de resistência in vitro do Trypanosoma cruzi ao benzonidazol / Characterization of the gene that codifies the enzyme alcohol dehydrogenases (TcADH) and association of its low expression with phenotype of resistance in vitro of the Trypanosoma cruzi to benzonidazole

Campos, Fernanda Magalhães Freire January 2007 (has links)
Made available in DSpace on 2012-05-07T15:26:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000016.pdf: 2256189 bytes, checksum: 744edbfd2d44afa74c1dcafa9ab7bc9e (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. / Álcool desidrogenases (ADH) pertencem a um grupo de enzimas que catalizam aoxidação reversível de etanol a acetaldeído, com conseqüente redução de NAD. O gene TcADHque codifica a ADH do T. cruzi, foi selecionado pela metodologia microarray por apresentarum nivel de transcrição 4 vezes menor na população do parasito com resistência induzida invitro ao BZ (17LER) quando comparado com seu par sensível (17WTS). A TcADH codificauma proteína de 393 aminoácidos que apresenta um domínio conservado iron-containingalcohol desidrogenase . A análise da estrutura primária mostrou que a TcADH é mais parecidacom as ADHs de organismos procariotos do que com seus ortólogos identificados emLeishmania. A atividade enzimática da TcADH foi menor nas cepas de T. cruzi com resistênciainduzida in vitro ao BZ (17 LER). Análises de Western blot mostraram que o anticorpopoliclonal anti-TcADH reconheceu um polipeptídeo de 41,7 kDa em todas as cepas do T. cruzianalisadas. O nível de expressão desse polipeptídeo foi 2 x menor na cepa do T. cruzi 17LERquando comparado com seu par 17WTS, confirmando os dados da atividade enzimática.Ensaios de imunolocalização por microscopia confocal revelaram que a enzima TcADH estápresente no cinetoplasto do parasito. Análise de Northern blot mostrou que a sonda do geneTcADH reconheceu um transcrito de 1,9 Kb com a mesma intensidade para todas amostras doT. cruzi analisadas com exceção da população 17LER que foi 2 vezes menor. Análisequantitativa por PCR em tempo real (qPCR) também mostrou um nível de mRNA 2,5 vezesmenor na população 17LER. Quantificação do número de cópias desse gene por qPCR, mostrouser o mesmo para todas as cepas do T. cruzi analisadas. Neste trabalho, o gene TcADH foicaracterizado pela primeira vez em T. cruzi e foi observado uma menor expressão da enzimaTcADH na população do T. cruzi com resistência induzida in-vitro ao BZ / Alcohol dehydrogenases (ADH) belongs to a group of enzymes that catalyze the reversible oxidation of ethanol to acetaldehyde, with consequent reduction of NAD. The TcADH gene that codes for the T. cruzi ADH of, was selected by microarray methodology as presenting a transcription level 4 four-fold lower in the T. cruzi population with in vitro- induced resistance to BZ (17 LER) than in the wild-type (17 WTS). The TcADH codes a protein of 393 aminoacids that presents a conserved “iron-containing alcohol desidrogenase” domain. Analysis of the primary structure showed that the TcADH is more similar to the of ADHs of procariotes than ADHs of other organisms as Leishmania. Assays of enzymatic activity showed that TcADH activity was lower in 17LER than in 17WTS. Western blot analysis of T.cruzi protein extracts probed with anti- TcADH rabbit polyclonal serum revealed a 41.7 kDa polypeptide present in all samples. The level of this polypeptide was similar for all samples except to 17LER that was nearly two-fold lower than the wild-type 17 WTS. Assays imunolocalization by confocal microscopy showed that the TcADH enzyme is present in parasite. Northern blot analyses showed that TcADH levels were 2.0 times lower in 17LER than in 17WTS. Real- time PCR confirmed our finding that TcADH transcription levels were lower in 17 LER than in 17 WTS. In contrast, we detected no differences in TcADH trancription level among other T. cruzi samples. Using real- time PCR, we found that the number of TcADH gene copies was similar in all samples. This difference of expression was confirmed by the. Our data show that a decreased expression of the TcADH enzyme was found only in a T. cruzi population with induced in vitro resistance to BZ. In this work, the TcADH gene was characterized for the first time in T. cruzi and was observed a smaller expression of the TcADH enzyme in a T. cruzi population with in vitro-induced resistance to BZ.
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Gene Regulation and Epigenetic Mechanisms in the Parasite Trypanosoma cruzi /

Respuela, Patricia, January 2009 (has links)
Diss. (sammanfattning) Uppsala : Univ., 2009. / Härtill 4 uppsatser.
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Trypanosoma cruzi calreticulin expression in parasites infecting murine macrophages

González Zúñiga, Andrea Elizabeth 03 1900 (has links)
Doctor en Bioquímica / La calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), una chaperona pleiotrópica de 47 kDa, se transloca desde el retículo endoplásmico (RE) a la zona de emergencia flagelar, donde actúa como un factor de virulencia principal, además de sus roles funcionales intracelulares. La TcCRT extracelular media la infectividad del parásito en virtud de su capacidad para interactuar con los componentes del complemento C1 y MBL. La inhibición de las vías del complemento clásica y de las lectinas también son consecuencias de estas interacciones. No se ha reportado respecto a la localización y funciones de TcCRT una vez que el parásito se encuentra en el interior de la célula hospedera. Aquí proponemos que, durante la infección por T. cruzi, y mediante el uso de anticuerpos específicos, es posible detectar TcCRT, una vez que el parásito se encuentra el interior de la célula hospedera de mamífero. También proponemos que la expresión de TcCRT en la célula hospedera se correlaciona inversamente con la expresión de antígenos MHC-I. Al abordar experimentalmente estos temas queremos contribuir al conocimiento de los términos moleculares que regulan la interacción células hospederas-T.cruzi, centrándose en el papel de TcCRT en particular, dentro de la célula hospedera infectada. Para alcanzar este objetivo apuntamos a la validación de la especificidad de los anticuerpos para ser utilizados como sondas detectoras de TcCRT, con ello identificar TcCRT interior de los macrófagos murinos infectados y, por último, evaluar las variaciones en la superficie de las moléculas de MHC- I en los macrófagos murinos infectados. Por lo tanto, específica y topográficamente se monitoreó la presencia de TcCRT en los parásitos que infectan a una línea celular de macrófagos murinos, en comparación con tripomastigotes libres y epimastigotes no infecciosos. Para ello, se probaron tres anticuerpos diferentes como sondas detectoras para procedimientos inmunocitoquímicos. Anticuerpos anti-TcCRT policlonales y monoclonales se validaron como sondas detectoras, ya que mostraron poca o nula reactividad cruzada. En inmunocitoquímica, el anticuerpo policlonal de conejo, y los anticuerpos monoclonales murinos anti-TcCRT, detectan TcCRT con diferentes sensibilidades y especificidades, cuando son revelados con inmunosondas conjugadas con oro coloidal, seguido por microscopía electrónica de transmisión. Con los anticuerpos policlonales de conejo, se observaron partículas de CRT, tanto en parásitos libres como en aquellos que se encuentran dentro del interior de células hospederas infectadas, principalmente en el núcleo y kinetoplasto del parásito. Con un anticuerpo monoclonal murino anti-TcCRT, y el uso de partículas de oro de tamaño más grande, se obtuvo una mejora drástica en la sensibilidad y especificidad para la detección TcCRT. Se detectaron moléculas de TcCRT principalmente en el kinetoplasto del tripomastigote. Proponemos que este organelo puede representar una escala para TcCRT, generada en el RE, previo a su translocación a la zona de emergencia flagelar. Esta movilización puede estar influenciada por las nuevas condiciones ambientales con las que el parásito se encuentra en el interior de la célula hospedera. Queda por determinar las consecuencias funcionales de la presencia acumulada de TcCRT en el kinetoplasto. La posibilidad de que TcCRT regule la transcripción en el ADN del kinetoplasto, según lo propuesto anteriormente para la CRT de mamífero en el núcleo, podría ser considerada, aunque la organización de ADN en el kinetoplasto es diferente. Además, TcCRT podría regular vías de transducción de señales dependientes de Ca+2. Finalmente, por mecanismos desconocidos, la infección por T. cruzi disminuye el número de células positivas MHC de clase I, tan temprano como 2 horas después de la infección. Queda por determinar si TcCRT accede al RE de la célula huésped e interfiere en el proceso de plegamiento de moléculas MHC clase I / Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT), a 47 kDa pleiotropic chaperone, besides its intracellular functional roles, is translocated from the endoplasmic reticulum (ER) to the area of flagellum emergence where it acts as a main virulence factor. Extracellular TcCRT mediates parasite infectivity by virtue of its capacity to interact with complement components C1 and MBL. Both inhibitions of the classical and lectin complement pathways are also consequences of these interactions. The localization and functions of TcCRT once the parasite is inside the host cell has not been reported. Herein we hypothesize that, during T. cruzi infection, and using specific antibodies, it is possible to detect TcCRT, once the parasite is inside the mammalian host cell. We also propose that TcCRT expression in the host cell inversely correlates with the MHC-I antigen expression. By experimentally addressing these issues we expect to contribute to the knowledge of the molecular terms governing the T. cruzi-host cell interplay, focusing on the role of TcCRT in particular inside the infected host cell. To reach this goal we will aim at validating the specificity of the antibodies to be used as TcCRT detector probes to identify TcCRT inside infected murine macrophages and, finally, to evaluate variations in surface MHC-I molecules on infected murine macrophages. Thus, we specifically and topographically monitor the TcCRT presence in parasites infecting a murine macrophage cell line, as compared to free trypomastigotes and non-infective epimastigotes. For that purpose, three different antibodies were tested as detector probes for immunocytochemical procedures. Polyclonal and monoclonal anti-TcCRT antibodies were validated as detector probes, as they showed minimal or null cross reactivity. In immunocytochemistry, polyclonal rabbit, and monoclonal murine anti- TcCRT antibodies, detected TcCRT with different sensitivities and specificities, when revealed with immune probes conjugated to colloidal gold, followed by transmission electron microscopy. With the rabbit polyclonal antibodies, CRT particles were observed, both in free parasites and infected host cells, mainly in the parasite nucleus and kinetoplast. With a murine monoclonal anti-TcCRT antibody, and using larger size gold particles, a drastic improvement in sensitivity and specificity for TcCRT detection, was obtained. TcCRT molecules were detected mainly in the trypomastigotes kinetoplast. We propose that t his organelle may represent a stopover for TcCRT, generated in the ER, previous its translocation to the area of flagellum emergence. This mobilization may be influenced by the new environmental conditions that the parasite meets inside the host cell. It remains to be determined the functional consequences of TcCRT cumulative presence in the kinetoplast. The possibility that TcCRT regulates transcription in kinetoplast DNA, as previously proposed for mammalian CRT in the nucleus, could be considered, although the DNA organization in the kinetoplast is different. Also, TcCRT may regulate Ca+2-dependent transduction signalling pathways. Finally, by unknown mechanisms, T. cruzi infection seems to decrease the number of MHC class I positive cells, as early as 2h post-infection. It remains to be determined whether TcCRT accesses to the host cell ER and interferes in the MHC class I molecule-folding process / Conicyt Fondecyt
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Tripanossomatídeos em cães de pacientes chagásicos crônicos, habitantes de Botucatu (SP) e região, avaliados pelos métodos de xenodiagnóstico artificial, hemocultura e reação em cadeia da polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi e/ou Trypanosoma rangeli

Lucheis, Simone Baldini [UNESP] January 2003 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T19:19:46Z : No. of bitstreams: 1 lucheis_sb_dr_botfm.pdf: 1576086 bytes, checksum: ce79bc7cd55bca911560d23aa2f274fc (MD5) / Not available.
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Calreticulina de trypanosoma cruzi : un factor de virulencia que unido exógenamente a epimastigotes, promueve su penetración a células hospederas

Sosoniuk Roche, Eduardo Rodrigo January 2013 (has links)
Memoria para la obtención del Título de Químico Farmacéutico / La enfermedad de Chagas es una patología endémica en América Latina y sin un tratamiento eficaz, causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Es un problema mayor de salud identificándose actualmente entre 8 a 9 millones de infectados, de los cuales aproximadamente un 30% desarrolla sintomatología. Sin embargo, la infección se ha globalizado durante los últimos años, confirmándose sobre 300.000 sero-positivos en Estados Unidos y varias decenas de miles en Europa, Asia y Oceanía. Esto se debe a que, aunque T. cruzi es normalmente transmitido por insectos triatominios infectados, se ha descrito la transmisión por transfusión sanguínea, trasplante de órganos, infección congénita y consumo de alimentos contaminados con el parásito. En el ciclo de vida de T. cruzi se pueden identificar 3 etapas principales: amastigote y epimastigote, que cumplen funciones replicativas en el hospedero mamífero y en el insecto vector respectivamente, y la forma tripomastigote, encargada de infectar células eucariontes. Calreticulina de T. cruzi (TcCRT), es una proteína de 45 kDa, aislada, clonada y caracterizada en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), de la Facultad de Medicina de nuestra Universidad. Se ha demostrado que TcCRT es translocada a la zona de emergencia flagelar de los tripomastigotes, donde captura C1, primer componente de la vía clásica del sistema del complemento. En el humano, esta señal es característica de células apoptóticas. Es por esto que al capturar C1, se reclutan macrófagos para fagocitar a los tripomastigotes. Una vez dentro de estas células, el parásito escapa de la vacuola parasitófora, y comienza a diferenciarse, iniciando el proceso de infección del huésped. Junto a esto, la interacción entre TcCRT y C1 impide la activación del sistema del complemento del hospedero, disminuyendo la lisis del parásito por este medio. Resultados obtenidos previamente en LIAM muestran que TcCRT se expresa marginalmente en la membrana plasmática de la forma epimastigote del clon Dm28c. En base a esto, se propuso como Hipótesis de Trabajo de esta Memoria de Título, que, al incubar epimastigotes con rTcCRT, se promueve su penetración a las células hospederas mamíferas. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) epimastigotes unen rTcCRT en su membrana, posiblemente mediante alguna proteína que sirva de anclaje, ii) el tratamiento con rTcCRT en presencia o ausencia de C1q conlleva a un aumento en la penetración del parásito en fibroblastos que expresan CRT, iii) la ausencia de CRT en la membrana de la célula hospedera lleva a una disminución en la penetración de los parásitos. En el contexto del epimastigote, puede que la falta de translocación de TcCRT sea el factor principal para que esta forma presente menor resistencia a lisis por el complemento y falle en desarrollar el ciclo infectivo en el mamífero / Chagas’ disease is an endemic pathology in Latin America, caused by the hemoflagelated protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and still with no available effective treatment. It has become a major health problem, with 8 - 9 million seropositive people, with 30% of them developing symptoms. In the last few years, the infection has globalized, with 300.000 people infected just in the USA, and tens of thousands in Europe, Asia and Oceania. Although T. cruzi is usually transmitted through the bite of Triatominae insects, blood transfusion, organ transplants or congenital infection have also been described. In the parasites life cycle, 3 principal different stages are identified: Replicative amastigotes and epimastigotes, present in the mammal host and Triatominae vector respectively, and trypomastigotes, which infect eukaryotic cells. T. cruzi Calreticulin (TcCRT) is a 45 kDa protein, isolated, cloned and characterized in the Immunology of Microbial Aggression Laboratory (LIAM), Faculty of Medicine, University of Chile. Later, it was demonstrated that TcCRT is translocated from the ER to the flagella emergence zone where it captures C1, the first component of the classical pathway of the complement system. In humans, this interaction is characteristic of apoptotic cells. Once C1 is captured, macrophages are recruited and phagocytose the trypomastigotes. Once inside the cell, the parasites escape the parasitophorous vacuole and start dedifferentiation, leading to the amastigote stages, which will finally differentiate into infective trypomastigotes. Upon TcCRT binding to C1, inhibition of the complement system activation occurs, with a decrease in parasite lysis. According to previous observations in our laboratory, TcCRT is expressed marginally on the plasmatic membrane of the studied epimastigote form. Taken all together, these facts allow us to propose the following Working Hypothesis: Incorporation of exogenously added rTcCRT onto epimastigotes will promote their penetration into mammal hosts cells. The main results obtained show that: i) epimastigotes bind rTcCRT to their cellular membrane, by a still unidentified membrane protein that works as an anchor, ii) rTcCRT-treated epimastigotes, in the presence or absence of C1q, promote an increase in parasite penetration into CRT expressing fibroblasts and iii) the absence of CRT in the host cell correlates with a decrease in parasite penetration. In the epimastigote context, it could be proposed that the lack of TcCRT translocation is an important reason why this form is more easily destroyed by the complement system, and for their incapacity to infect host cells / Fondecyt
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Estimación del número de copias del gen calreticulina, en el genoma de Trypanosoma cruzi

Maldonado Fuentes, Ismael January 2009 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina es una proteína con múltiples funciones presente en todas las células de organismos superiores, salvo eritrocitos. En protozoos parásitos, hemos demostrado que calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe el sistema del complemento humano y la angiogénesis y promueve la infectividad parasitaria. Esta proteína se expresa en la superficie del parásito y en organelos citoplásmicos. Su gen posee una localización cromosómica variable, sugiriendo que TcCRT estaría codificada por múltiples copias génicas organizadas en “tandem” con posibles implicancias funcionales. Obtuvimos ADN cromosomal de cultivos in vitro de epimastigotes. Mediante Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE), seguido por hibridación con sonda radiactiva (correspondiente al dominio C-terminal de TcCRT) localizamos el gen TcCRT en las cepas Y, MF y Tulahuén y los clones DM28c y Cl Brener. Para evaluar el número de copias del gen TcCRT se realizó una cinética de digestiones parciales con la enzima BamH1 para generar fragmentos de ADN que contengan desde una a múltiples copias del gen. Los productos de digestión fueron separados por PFGE y el gen fue detectado con la sonda anterior. Nuestros resultados corroboran que TcCRT se encuentra en varios cromosomas de diferente tamaño, probablemente correspondan a pares homólogos donde TcCRT está presente en una sola copia. Estos datos concuerdan con la secuencia publicada del genoma de T. cruzi, Cl Brener, y sugieren que las múltiples funciones de TcCRT estarían controladas a nivel postranscripcional.
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Caracterización molecular mediante secuenciación del gen para citocromo b en muestras de Trypanosoma cruzi circulantes en insectos del género Mepraia (Hemiptera: Reduviidae)

Arenas Doren, Marco January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las poblaciones naturales de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, presentan propiedades biológicas diferentes y es posible diferenciar dentro del taxón dos sublinajes, TcI y TcII, así como subgrupos de parásitos dentro de cada uno. El objetivo del presente estudio fue describir la diversidad molecular de las poblaciones de T. cruzi circulando en territorio chileno a partir de vectores silvestres de Mepraia spinolai y Mepraia gajardoi obtenidos de diferentes áreas de Chile. Para dicho objetivo se utilizaron dos partidores, p18 y p20, diseñados en base a la secuencia de la cepa Tulahuén de T. cruzi. 516 pb del gen mitocondrial para citocromo b fueron secuenciados de 17 muestras biológicas, y comparadas filogenéticamente con otras 50 secuencias Sudamericanas. La caracterización molecular de estas 67 secuencias en un filograma de máxima verosimilitud permitió la identificación de tres clados previamente conocidos (TcI, TcII, y TcV junto con TcVI). TcI y TcII son genotípicamente heterogéneos. Por su parte TcV y TcVI son genotípicamente homogéneos y no diferenciados por secuenciación del gen para citocromo b
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Clonamiento, expresión y purificación de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas TcAP1 y TcAP2 de Trypanosoma cruzi en condiciones nativas

Delgadillo Liberona, José Sebastián January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El agente causal de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es de carácter endémico en América Latina; se estima un promedio de 10-15 millones de personas infectadas y 75-90 millones en riesgo de contraer la enfermedad. T. cruzi posee un ciclo de vida indirecto y se presenta en cuatro formas celulares; epimastigote, forma extracelular replicativa y no infectiva, tripomastigote metacíclico y tripomastigote sanguíneo, formas no replicativas e infectivas y amastigote, forma intracelular replicativa. T. cruzi es capaz de sobrevivir al daño oxidativo del DNA generado por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) producidas por su propio metabolismo, así como aquellas producidas en el intestino del insecto vector y en células del hospedero mamífero. Este daño sería reparado mediante la actividad de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP) de la vía de escisión de bases (BER). T. cruzi presenta en su genoma secuencias que codificarían para endonucleasas AP, entre ellas TcAP1, homóloga de APE1 humana y TcAP2, homóloga de APE2 humana y de Apn2 de Schizosaccaromyces pombe. La expresión de estas proteínas podría ser fundamental para la sobrevida del parásito, tanto en el vector triatomino como en el hospedero mamífero. Para un estudio sistemático de las características de estas enzimas, se requiere obtenerlas en el más alto grado de pureza desde el parásito o por técnicas de ingeniería genética. En esta Memoria de Título se clonaron las secuencias génicas que codifican para TcAP1 y TcAP2 en vectores de expresión para células eucariontes, lo que se confirmó mediante secuenciación automática de DNA. Con estos constructos se transfectaron células S2 de Drosophila melanogaster, levaduras Pichia pastoris y epimastigotes de T. cruzi cepa Dm28c. Sorprendentemente, sólo fue posible expresar ambas endonucleasas en este último modelo. La imposibilidad de expresar ambas endonucleasas AP en los modelos P. pastoris y D. melanogaster podría relacionarse a una variedad insuficiente o limitada de ciertos tRNAs, necesarios para la expresión de TcAP1 y TcAP2, con la consecuente disminución de la traducción de los mRNAs codificantes para ambos genes. Probablemente, los tRNAs que presentan anticodones específicos para la traducción de las endonucleasas AP de T. cruzi sólo se encuentran en concentraciones adecuadas en modelos celulares de expresión filogenéticamente cercanos a este protozoario. Mediante cromatografía de afinidad se intentó purificar TcAP1-GFP a partir de homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes transfectados que expresaban esta proteína recombinante. Sin embargo no se logró obtener la proteína recombinante en condiciones nativas de forma pura. Se concluye que la utilización de GFP asociado como proteína de fusión a TcAP1 sólo permite la identificación de la proteína recombinante y no una purificación adecuada de la misma / Proyecto Bicentenario Anillo ACT 112, CONICYT, Chile. Proyecto FONDECYT 1090124.
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Estudos in vivo e in vitro sobre mecanismos de infeccao por formas metaciclicas do Trypanosoma cruzi / Studies in vivo and in vitro on mechanisms of infection by Trypanosoma cruzi metacyclic forms

Ferreira, Daniele da Soledade Franca [UNIFESP] January 2007 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este estudo teve como objetivo ampliar a compreensão dos mecanismos de invasão celular por tripomastigotas metacíclicos das cepas G e CL de T. cruzi, que diferem marcadamente em sua infectividade in vitro e in vivo. Os nossos dados indicam que a cepa CL, que utiliza a molécula de superfície gp82 para entrar em células epiteliais in vitro e para invadir o epitélio da mucosa gástrica após inoculação oral em camundongos, aciona durante a invasão vias de sinalização envolvendo proteína quinase C e fosfatidil inositol-3 quinase. Na cepa G, que é pouco infectiva e utiliza gp35/50 para a invasão, são ativadas principalmente adenilato ciclase e a proteína quinase dependente de AMP cíclico. Durante a invasão mediada por gp82, as formas metacíclicas da cepa CL induzem a desorganização do citoesqueleto de actina da célula hospedeira, enquanto a cepa G parece estimular o recrutamento de actina. Consistente com esse achado, a invasão celular de tripomastigotas metacíclicos da cepa CL é inibida na presença de Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), que depende da actina do citoesqueleto para entrar em células, ao contrário da cepa G. As moléculas gp35/50 e a gp82 recombinante, purificadas, mostraram efeito antagônico sobre a entrada de EIEC em células, a primeira induzindo o aumento e a segunda inibindo a invasão bacteriana. Esses dados, em conjunto, sugerem que a invasão celular mediada por gp35/50 está associada com eventos de sinalização que favorecem o recrutamento de actina, em contraste àquela dependente de gp82, que envolve a indução de vias de transdução de sinal que resulta em despolimerização de Factina. Um outro fator que pode contribuir para a capacidade infectante de formas metacíclicas é a cruzipaína, a cisteíno protease majoritária do T. cruzi. Ao contrário da cepa G, cuja atividade de cruzipaína não é detectável, as formas metacíclicas da cepa CL expressam cruzipaína, cuja atividade, se inibida, interfere na invasão celular. Com este trabalho, mais alguns passos importantes foram dados para a melhor compreensão do processo de infecção por tripomastigotas metacíclicos das cepas G e CL / This study aimed at further understanding the mechanisms of cell invasion by metacyclic trypomastigotes from Trypanosoma cruzi strains G and CL, whose infectivities differ markedly in vitro and in vivo. Our data indicate that the CL strain parasites, which engage the surface molecule gp82 to invade epithelial cells in vitro and to enter the gastric mucosal epithelium upon oral inoculation into mice, triggers the activation of protein kinase C and phosphatidyl inositol 3-kinase signaling pathways. Conversely, the less infective G strain, which invades cells through gp35/50 molecules, induces the activation of adenylate cyclase and cAMP-dependent protein kinase. During gp82-mediated cell invasion by CL strain metacyclic forms, host cell actin cytoskeleton is disorganized whereas the gp35/50- dependent internalization of G strain involves target cell actin recruitment to the site of entry. Compatible with this finding, cell invasion by CL strain but not G strain metacyclic forms is inhibited in the presence of enteroinvasive Escherichia coli (EIEC), which requires the actin cytoskeleton for invasion. Treatment of cells with gp35/50 increased EIEC entry whereas the recombinant gp82 inhibited bacterial invasion. These data suggest that gp35/50-mediated cell invasion is associated with signaling events that favor actin recruitment, as opposed to gp82-dependent internalization, which triggers signal transduction pathways that lead to F-actin depolymerization. Another factor contributing to the infective ability of CL strain metacyclic forms is cruzipain, the T. cruzi´s major cysteine proteinase, which is undetectable in G strain. Our work provides further important information towards understanding the mechanisms underlying infection by T. cruzi metacyclic trypomastigotes / BV UNIFESP: Teses e dissertações

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