Made available in DSpace on 2012-05-07T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000017.pdf: 2555842 bytes, checksum: e2553875bf177a729d0c62a579e89fee (MD5) Previous issue date: 2007 / A Tirosina aminotransferase (TAT) é uma enzima importante no metabolismo deaminoácidos aromáticos. Existem várias diferenças bioquímicas entre a TAT demamíferos e a de Trypanosoma cruzi (TcTAT). Além disso, o gene TcTAT estásuperexpresso em cepas do parasito que são resistentes ao benzonidazol (BZ),droga atualmente usada na quimioterapia da doença de Chagas. Dessa forma a TATé indicada como um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentesquimioterapêuticos. No presente estudo, caracterizamos o gene da TcTAT em 14cepas e clones do T cruzi resistentes e sensíveis ao BZ. Observamos um únicotranscrito de mRNA de 2,0 Kb em todas as amostras do parasito. Os níveis demRNA de TcTAT foram similares em todas as amostras com exceção das cepasresistentes 17LER e BZR, que apresentaram níveis de mRNA duas vezes maiorcomparado com seus pares sensíveis 17WTS e BZS. O gene TcTAT estáorganizado em arranjos multicópias em tandem e está localizado em 8 bandascromossômicas que variam de 785 a 2500Kb. Não observamos amplificação doTcTAT no genoma do parasito. Uma proteína expressa de 42KDa pelo TcTAT estápresente em todas amostras do T. cruzi. Não observamos nenhuma correlação forteentre o gene TcTAT e resistência a drogas no T. cruzi, entretanto os resultados nãoexcluem que TcTAT possa atuar via mecanismo secundário, juntamente com genesde outras enzimas

Made available in DSpace on 2012-05-07T15:26:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000016.pdf: 2256189 bytes, checksum: 744edbfd2d44afa74c1dcafa9ab7bc9e (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil. / Álcool desidrogenases (ADH) pertencem a um grupo de enzimas que catalizam aoxidação reversível de etanol a acetaldeído, com conseqüente redução de NAD. O gene TcADHque codifica a ADH do T. cruzi, foi selecionado pela metodologia microarray por apresentarum nivel de transcrição 4 vezes menor na população do parasito com resistência induzida invitro ao BZ (17LER) quando comparado com seu par sensível (17WTS). A TcADH codificauma proteína de 393 aminoácidos que apresenta um domínio conservado iron-containingalcohol desidrogenase . A análise da estrutura primária mostrou que a TcADH é mais parecidacom as ADHs de organismos procariotos do que com seus ortólogos identificados emLeishmania. A atividade enzimática da TcADH foi menor nas cepas de T. cruzi com resistênciainduzida in vitro ao BZ (17 LER). Análises de Western blot mostraram que o anticorpopoliclonal anti-TcADH reconheceu um polipeptídeo de 41,7 kDa em todas as cepas do T. cruzianalisadas. O nível de expressão desse polipeptídeo foi 2 x menor na cepa do T. cruzi 17LERquando comparado com seu par 17WTS, confirmando os dados da atividade enzimática.Ensaios de imunolocalização por microscopia confocal revelaram que a enzima TcADH estápresente no cinetoplasto do parasito. Análise de Northern blot mostrou que a sonda do geneTcADH reconheceu um transcrito de 1,9 Kb com a mesma intensidade para todas amostras doT. cruzi analisadas com exceção da população 17LER que foi 2 vezes menor. Análisequantitativa por PCR em tempo real (qPCR) também mostrou um nível de mRNA 2,5 vezesmenor na população 17LER. Quantificação do número de cópias desse gene por qPCR, mostrouser o mesmo para todas as cepas do T. cruzi analisadas. Neste trabalho, o gene TcADH foicaracterizado pela primeira vez em T. cruzi e foi observado uma menor expressão da enzimaTcADH na população do T. cruzi com resistência induzida in-vitro ao BZ / Alcohol dehydrogenases (ADH) belongs to a group of enzymes that catalyze the reversible oxidation of ethanol to acetaldehyde, with consequent reduction of NAD. The TcADH gene that codes for the T. cruzi ADH of, was selected by microarray methodology as presenting a transcription level 4 four-fold lower in the T. cruzi population with in vitro- induced resistance to BZ (17 LER) than in the wild-type (17 WTS). The TcADH codes a protein of 393 aminoacids that presents a conserved “iron-containing alcohol desidrogenase” domain. Analysis of the primary structure showed that the TcADH is more similar to the of ADHs of procariotes than ADHs of other organisms as Leishmania. Assays of enzymatic activity showed that TcADH activity was lower in 17LER than in 17WTS. Western blot analysis of T.cruzi protein extracts probed with anti- TcADH rabbit polyclonal serum revealed a 41.7 kDa polypeptide present in all samples. The level of this polypeptide was similar for all samples except to 17LER that was nearly two-fold lower than the wild-type 17 WTS. Assays imunolocalization by confocal microscopy showed that the TcADH enzyme is present in parasite. Northern blot analyses showed that TcADH levels were 2.0 times lower in 17LER than in 17WTS. Real- time PCR confirmed our finding that TcADH transcription levels were lower in 17 LER than in 17 WTS. In contrast, we detected no differences in TcADH trancription level among other T. cruzi samples. Using real- time PCR, we found that the number of TcADH gene copies was similar in all samples. This difference of expression was confirmed by the. Our data show that a decreased expression of the TcADH enzyme was found only in a T. cruzi population with induced in vitro resistance to BZ. In this work, the TcADH gene was characterized for the first time in T. cruzi and was observed a smaller expression of the TcADH enzyme in a T. cruzi population with in vitro-induced resistance to BZ.

Memoria para la obtención del Título de Químico Farmacéutico / La enfermedad de Chagas es una patología endémica en América Latina y sin un tratamiento eficaz, causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Es un problema mayor de salud identificándose actualmente entre 8 a 9 millones de infectados, de los cuales aproximadamente un 30% desarrolla sintomatología. Sin embargo, la infección se ha globalizado durante los últimos años, confirmándose sobre 300.000 sero-positivos en Estados Unidos y varias decenas de miles en Europa, Asia y Oceanía. Esto se debe a que, aunque T. cruzi es normalmente transmitido por insectos triatominios infectados, se ha descrito la transmisión por transfusión sanguínea, trasplante de órganos, infección congénita y consumo de alimentos contaminados con el parásito. En el ciclo de vida de T. cruzi se pueden identificar 3 etapas principales: amastigote y epimastigote, que cumplen funciones replicativas en el hospedero mamífero y en el insecto vector respectivamente, y la forma tripomastigote, encargada de infectar células eucariontes. Calreticulina de T. cruzi (TcCRT), es una proteína de 45 kDa, aislada, clonada y caracterizada en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), de la Facultad de Medicina de nuestra Universidad. Se ha demostrado que TcCRT es translocada a la zona de emergencia flagelar de los tripomastigotes, donde captura C1, primer componente de la vía clásica del sistema del complemento. En el humano, esta señal es característica de células apoptóticas. Es por esto que al capturar C1, se reclutan macrófagos para fagocitar a los tripomastigotes. Una vez dentro de estas células, el parásito escapa de la vacuola parasitófora, y comienza a diferenciarse, iniciando el proceso de infección del huésped. Junto a esto, la interacción entre TcCRT y C1 impide la activación del sistema del complemento del hospedero, disminuyendo la lisis del parásito por este medio. Resultados obtenidos previamente en LIAM muestran que TcCRT se expresa marginalmente en la membrana plasmática de la forma epimastigote del clon Dm28c. En base a esto, se propuso como Hipótesis de Trabajo de esta Memoria de Título, que, al incubar epimastigotes con rTcCRT, se promueve su penetración a las células hospederas mamíferas. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) epimastigotes unen rTcCRT en su membrana, posiblemente mediante alguna proteína que sirva de anclaje, ii) el tratamiento con rTcCRT en presencia o ausencia de C1q conlleva a un aumento en la penetración del parásito en fibroblastos que expresan CRT, iii) la ausencia de CRT en la membrana de la célula hospedera lleva a una disminución en la penetración de los parásitos. En el contexto del epimastigote, puede que la falta de translocación de TcCRT sea el factor principal para que esta forma presente menor resistencia a lisis por el complemento y falle en desarrollar el ciclo infectivo en el mamífero / Chagas’ disease is an endemic pathology in Latin America, caused by the hemoflagelated protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), and still with no available effective treatment. It has become a major health problem, with 8 - 9 million seropositive people, with 30% of them developing symptoms. In the last few years, the infection has globalized, with 300.000 people infected just in the USA, and tens of thousands in Europe, Asia and Oceania. Although T. cruzi is usually transmitted through the bite of Triatominae insects, blood transfusion, organ transplants or congenital infection have also been described. In the parasites life cycle, 3 principal different stages are identified: Replicative amastigotes and epimastigotes, present in the mammal host and Triatominae vector respectively, and trypomastigotes, which infect eukaryotic cells. T. cruzi Calreticulin (TcCRT) is a 45 kDa protein, isolated, cloned and characterized in the Immunology of Microbial Aggression Laboratory (LIAM), Faculty of Medicine, University of Chile. Later, it was demonstrated that TcCRT is translocated from the ER to the flagella emergence zone where it captures C1, the first component of the classical pathway of the complement system. In humans, this interaction is characteristic of apoptotic cells. Once C1 is captured, macrophages are recruited and phagocytose the trypomastigotes. Once inside the cell, the parasites escape the parasitophorous vacuole and start dedifferentiation, leading to the amastigote stages, which will finally differentiate into infective trypomastigotes. Upon TcCRT binding to C1, inhibition of the complement system activation occurs, with a decrease in parasite lysis. According to previous observations in our laboratory, TcCRT is expressed marginally on the plasmatic membrane of the studied epimastigote form. Taken all together, these facts allow us to propose the following Working Hypothesis: Incorporation of exogenously added rTcCRT onto epimastigotes will promote their penetration into mammal hosts cells. The main results obtained show that: i) epimastigotes bind rTcCRT to their cellular membrane, by a still unidentified membrane protein that works as an anchor, ii) rTcCRT-treated epimastigotes, in the presence or absence of C1q, promote an increase in parasite penetration into CRT expressing fibroblasts and iii) the absence of CRT in the host cell correlates with a decrease in parasite penetration. In the epimastigote context, it could be proposed that the lack of TcCRT translocation is an important reason why this form is more easily destroyed by the complement system, and for their incapacity to infect host cells / Fondecyt

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina es una proteína con múltiples funciones presente en todas las células de organismos superiores, salvo eritrocitos. En protozoos parásitos, hemos demostrado que calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe el sistema del complemento humano y la angiogénesis y promueve la infectividad parasitaria. Esta proteína se expresa en la superficie del parásito y en organelos citoplásmicos. Su gen posee una localización cromosómica variable, sugiriendo que TcCRT estaría codificada por múltiples copias génicas organizadas en “tandem” con posibles implicancias funcionales. Obtuvimos ADN cromosomal de cultivos in vitro de epimastigotes. Mediante Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE), seguido por hibridación con sonda radiactiva (correspondiente al dominio C-terminal de TcCRT) localizamos el gen TcCRT en las cepas Y, MF y Tulahuén y los clones DM28c y Cl Brener. Para evaluar el número de copias del gen TcCRT se realizó una cinética de digestiones parciales con la enzima BamH1 para generar fragmentos de ADN que contengan desde una a múltiples copias del gen. Los productos de digestión fueron separados por PFGE y el gen fue detectado con la sonda anterior. Nuestros resultados corroboran que TcCRT se encuentra en varios cromosomas de diferente tamaño, probablemente correspondan a pares homólogos donde TcCRT está presente en una sola copia. Estos datos concuerdan con la secuencia publicada del genoma de T. cruzi, Cl Brener, y sugieren que las múltiples funciones de TcCRT estarían controladas a nivel postranscripcional.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las poblaciones naturales de Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, presentan propiedades biológicas diferentes y es posible diferenciar dentro del taxón dos sublinajes, TcI y TcII, así como subgrupos de parásitos dentro de cada uno. El objetivo del presente estudio fue describir la diversidad molecular de las poblaciones de T. cruzi circulando en territorio chileno a partir de vectores silvestres de Mepraia spinolai y Mepraia gajardoi obtenidos de diferentes áreas de Chile. Para dicho objetivo se utilizaron dos partidores, p18 y p20, diseñados en base a la secuencia de la cepa Tulahuén de T. cruzi. 516 pb del gen mitocondrial para citocromo b fueron secuenciados de 17 muestras biológicas, y comparadas filogenéticamente con otras 50 secuencias Sudamericanas. La caracterización molecular de estas 67 secuencias en un filograma de máxima verosimilitud permitió la identificación de tres clados previamente conocidos (TcI, TcII, y TcV junto con TcVI). TcI y TcII son genotípicamente heterogéneos. Por su parte TcV y TcVI son genotípicamente homogéneos y no diferenciados por secuenciación del gen para citocromo b

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El agente causal de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es de carácter endémico en América Latina; se estima un promedio de 10-15 millones de personas infectadas y 75-90 millones en riesgo de contraer la enfermedad. T. cruzi posee un ciclo de vida indirecto y se presenta en cuatro formas celulares; epimastigote, forma extracelular replicativa y no infectiva, tripomastigote metacíclico y tripomastigote sanguíneo, formas no replicativas e infectivas y amastigote, forma intracelular replicativa. T. cruzi es capaz de sobrevivir al daño oxidativo del DNA generado por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) producidas por su propio metabolismo, así como aquellas producidas en el intestino del insecto vector y en células del hospedero mamífero. Este daño sería reparado mediante la actividad de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP) de la vía de escisión de bases (BER). T. cruzi presenta en su genoma secuencias que codificarían para endonucleasas AP, entre ellas TcAP1, homóloga de APE1 humana y TcAP2, homóloga de APE2 humana y de Apn2 de Schizosaccaromyces pombe. La expresión de estas proteínas podría ser fundamental para la sobrevida del parásito, tanto en el vector triatomino como en el hospedero mamífero. Para un estudio sistemático de las características de estas enzimas, se requiere obtenerlas en el más alto grado de pureza desde el parásito o por técnicas de ingeniería genética. En esta Memoria de Título se clonaron las secuencias génicas que codifican para TcAP1 y TcAP2 en vectores de expresión para células eucariontes, lo que se confirmó mediante secuenciación automática de DNA. Con estos constructos se transfectaron células S2 de Drosophila melanogaster, levaduras Pichia pastoris y epimastigotes de T. cruzi cepa Dm28c. Sorprendentemente, sólo fue posible expresar ambas endonucleasas en este último modelo. La imposibilidad de expresar ambas endonucleasas AP en los modelos P. pastoris y D. melanogaster podría relacionarse a una variedad insuficiente o limitada de ciertos tRNAs, necesarios para la expresión de TcAP1 y TcAP2, con la consecuente disminución de la traducción de los mRNAs codificantes para ambos genes. Probablemente, los tRNAs que presentan anticodones específicos para la traducción de las endonucleasas AP de T. cruzi sólo se encuentran en concentraciones adecuadas en modelos celulares de expresión filogenéticamente cercanos a este protozoario. Mediante cromatografía de afinidad se intentó purificar TcAP1-GFP a partir de homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes transfectados que expresaban esta proteína recombinante. Sin embargo no se logró obtener la proteína recombinante en condiciones nativas de forma pura. Se concluye que la utilización de GFP asociado como proteína de fusión a TcAP1 sólo permite la identificación de la proteína recombinante y no una purificación adecuada de la misma / Proyecto Bicentenario Anillo ACT 112, CONICYT, Chile. Proyecto FONDECYT 1090124.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T19:19:46Z : No. of bitstreams: 1 lucheis_sb_dr_botfm.pdf: 1576086 bytes, checksum: ce79bc7cd55bca911560d23aa2f274fc (MD5) / Not available.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Bioquímica / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es un protozoo parásito, agente causal de la enfermedad de Chagas, endémica en el continente americano. Presenta un ciclo de vida complejo, infectando tanto hospederos mamíferos como insectos triatominos (hematófagos) y presentando cuatro formas celulares: tripomastigotes sanguíneos, epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes metacíclicos. En humanos, la infección por T. cruzi en etapas avanzadas puede provocar serios trastornos cardíacos y digestivos, con un alto costo médico, y que pueden ser mortales de no ser tratados adecuadamente. Hasta el momento, no existe una cura definitiva para la infección crónica por T. cruzi. Este parásito sobrevive al efecto de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) generadas tanto por células del hospedero mamífero como por la digestión de la sangre en el insecto hematófago. Se ha propuesto que estas especies reactivas dañan el DNA del parásito y que éste sobrevive activando el mecanismo de reparación del DNA por escisión de bases (vía BER). Este es un proceso muy conservado, que presenta dos sub-vías: la vía corta, en la que se reemplaza un nucleótido, o la vía larga, donde se insertan dos o más nucleótidos. En esta vía de reparación del DNA participan distintas enzimas, como DNA glicosilasas, AP endonucleasas (APE), DNA polimerasas, flap endonucleasas (FEN1) y DNA ligasas. Hasta el momento, se ha demostrado que: 1) el DNA del parásito es dañado por ROS/RNS; 2) T. cruzi tiene la capacidad de reparar el daño producido por estas especies reactivas; 3) metoxiamina, un inhibidor de AP endonucleasas, aumenta la muerte celular provocada por ROS/RNS; 4) el parásito tiene dos DNA glicosilasas y dos AP endonucleasas activas. A la fecha de realización de esta Tesis no se había definido la presencia de flap endonucleasas así como de las diferentes vías (corta y/o larga) de reparación del DNA por escisión de bases en T. cruzi. Las enzimas flap endonucleasas (FEN1) se caracterizan por reconocer sustratos de DNA con estructuras específicas, que se generan en diversos procesos celulares, como la replicación del DNA o su reparación mediante la vía larga del mecanismo BER. Estudios en diversos eucariontes han demostrado su importancia en la reparación del daño oxidativo al DNA, así como en la mantención de la integridad genómica. En esta Tesis se investigó la presencia y actividad de una enzima flap endonucleasa de T. cruzi (TcFEN1), su expresión, su localización celular y su rol en la proliferación y en la sobrevida del parásito frente a condiciones de estrés oxidativo. Se demostró la presencia de actividad flap endonucleasa en distintas formas celulares de T. cruzi y se describieron algunas de sus propiedades. Paralelamente se encontró una secuencia correspondiente a una flap endonucleasa en el genoma publicado de T. cruzi, a partir de la cual se crearon plásmidos que permitieron la expresión en epimastigotes de T. cruzi de proteínas de fusión TcFEN1-GFP que también presentaron actividad flap endonucleasa y que se localizaron en el núcleo de epimastigotes del parásito, según estudios de microscopia de fluorescencia. Por otro lado, se observó un incremento en la proliferación de los epimastigotes que expresaban TcFEN1-GFP, así como una mayor sobrevida frente a la exposición sostenida a H2O2 respecto a lo observado en parásitos control. En base a los resultados obtenidos, TcFEN1 se presenta como protagonista en procesos claves para la infección por T. cruzi como son la proliferación y resistencia frente a daño oxidativo, por lo que desarrollar inhibidores específicos de TcFEN1 podría potenciar el efecto citotóxico del daño oxidativo al DNA generado por las células del hospedero, así como potenciar el tratamiento de la infección por T. cruzi por drogas convencionales, actualmente muy poco eficientes en el tratamiento de la enfermedad de Chagas crónica / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) is a protozoan parasite, the etiological agent of Chagas´s disease, endemic in the American continent. It presents a complex life cycle, infecting both mammalian and triatomine insects and presenting four cellular forms: blood trypomastigote, epimastigote, amastigote and metacyclic trypomastigote. In humans, T. cruzi infection in advanced stages can cause serious cardiac and digestive disorders, with a high medical cost, and can be fatal if not treated properly. To date, there is no definitive cure for chronic T. cruzi infection. This parasite survives the effect of reactive oxygen and nitrogen species (ROS / RNS) generated by both mammalian host cells and by the digestion of blood in the hematophagous insect. It has been proposed that those reactive species damage the DNA of the parasite but it survives by activating the mechanism of DNA repair by base excision (BER pathway). This is a highly conserved process, which has two sub-pathways: the short one, where a single nucleotide is replaced, or the long one, where two or more nucleotides are inserted. Different enzymes, such as DNA glycosylases, AP endonucleases (APE), DNA polymerases, flap endonucleases (FEN1) and ligases are involved in that DNA repair pathway. To date, it has been shown that: 1) the DNA of the parasite is damaged by ROS / RNS; 2) T. cruzi repairs the damage produced by these reactive species; 3) methoxyamine, an inhibitor of AP endonucleases, increases ROS/RNS-induced parasite cell death and 4) T. cruzi presents two DNA glycosylases and two active AP endonucleases. At the date of this thesis, the presence of the different pathways (short and / or long) of DNA repair by base cleavage in T. cruzi had not been defined. Flap endonuclease enzymes (FEN1) are characterized by recognizing DNA substrates with specific structures, which are generated in various cellular processes, such as DNA replication or repair by the long path of the BER mechanism. Studies in various eukaryotes have demonstrated their importance in the repair of oxidative damage to DNA, as well as in the maintenance of genomic integrity. In this thesis the presence and activity of a T. cruzi flap endonuclease enzyme (TcFEN1), its expression, its cellular localization and its role in the proliferation and survival of the parasite against oxidative stress conditions were investigated. The presence of TcFEN1 was demonstrated in different cellular forms of T. cruzi and some of its properties were described. In parallel, a sequence corresponding to a flap endonuclease was found in the published T. cruzi genome, from which plasmids were created that allowed expression in T. cruzi epimastigotes of TcFEN1-GFP fusion proteins that also had flap endonuclease activity and were located in the epimastigotes nucleus, according to fluorescence microscopy. On the other hand, there was an increase in the proliferation of epimastigotes expressing TcFEN1-GFP, as well as a higher survival to H2O2 sustained exposure than observed in control parasites. Based on the results obtained, TcFEN1 is presented as a protagonist in key processes for infection by T. cruzi, such as proliferation and resistance to oxidative damage. Therefore, the development of specific inhibitors of TcFEN1 may enhance the cytotoxic effect of oxidative DNA damage generated by the host cells, as well as potentiate the treatment of T. cruzi infection by conventional drugs, currently very ineffective in the treatment of chronic Chagas´disease / Conicyt; Fondecyt

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Univ., 2009. / Härtill 4 uppsatser.

MELLO, C. P. Estudo in vitro da atividade tripanocida da batroxicidina–catelecidina da glândula de veneno da serpente Bothrops atrox. 2017. 114 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by ciências farmacêuticas pgcf (pgcf.ufc@gmail.com) on 2017-08-28T11:42:27Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-28T11:49:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T11:49:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cpmello.pdf: 7153983 bytes, checksum: 31cc5d5186e81d06b8e89171f005aecc (MD5) Previous issue date: 2017-07-12 / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, is a potentially fatal disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi. There are two drugs available for the treatment of the disease, nifurtimox and benzonidazole. Both are toxic and have limited efficacy, requiring the search for new therapeutic alternatives. Antimicrobial peptides (AMPs) may be potential alternatives to conventional treatments already available, as they have a rapid action mode, a low resistance development and can work with existing drugs. The aim of this study was to investigate the effects of Batroxicidin (BatxC), a catalicidine peptide of the venom Bothrops atrox venom gland, on the different forms of of Trypanosoma cruzi Y strains. The treatment with BatxC at 24, 48 and 72 h caused a decrease in the viability of the parasites in almost all the studied concentrations (1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25 and 50 μM) with an IC50 of 11, 3; (0.045, 0.09, 0.18, 0.39, 0.78 and 1.56 μM), respectively, with a selectivity index of 315. Assays with trypomastigote forms at different concentrations demonstrated that BatxC is toxic from concentrations of 0.18 μM, approaching 100% lethality at the concentration of 1.56 μM. Amastigote forms were also performed following cytotoxicity study in LLC-MK2 and RAW264.7 cells, showing that the studied concentrations (0.44 and 0.88 μM) in 24h, was a reduction of 40% and 45% of infected cells, respectively. In 48h, there was no decrease in the percentage of cell infection. The percentage inhibition of amastigote forms treated with BatxC was 33% (IC50) and 43.5% (2xIC50) in 24h, and 23% (IC50) and 33% (2xIC50) in 48h. These results demonstrated a reduction in the survival rate of amastigote forms. Subsequently, flow cytometric assays with Annexin V-PE and 7- aminoactinomycin (7-AAD) demonstrated a higher population of 7ADAD-labeled parasites at IC 50 (11.3μM) and 2x IC 50 (22.6μM ) demonstrating that death induced by BatxC was predominantly by necrosis. Then, the experiments were performed with DCF and Rhodamine 123 to investigate the involvement of reactive oxygen species (EROS) and alteration of the mitochondrial membrane potential in cell death mechanism. The results showed that there was an increase in EROS and alteration of mitochondrial transmembrane potential. The T.cruzi cell death pathway by a necrotic mechanism was finally confirmed by scanning electron microscopy (SEM) that observed loss of cellular membrane integrity. In conclusion, BatxC inhibited all forms of T. cruzi Y strain, with high selectivity index, inducing necrosis. / A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma doença potencialmente fatal causada pelo parasito Trypanosoma cruzi. Existem atualmente, dois medicamentos disponíveis para o tratamento da doença, o nifurtimox e o benzonidazol. Ambos são tóxicos e apresentam eficácia limitada, sendo necessária a busca de novas alternativas terapêuticas. Os peptidios antimicrobianos (PAMs) podem ser alternativas potenciais aos tratamentos convencionais já disponíveis, pois eles apresentam mecanismo de ação rápido, baixa probabilidade de desenvolvimento da resistência e podem atuar em conjunto com esquema de fármacos existentes. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da Batroxicidina (BatxC), um peptideo relacionado à catalicidina da glândula de veneno da serpente Bothrops atrox, sobre as formas diferentes formas evolutivas de cepas Y de Trypanosoma cruzi . O tratamento com BatxC em 24,48 e 72h, causou diminuição da viabilidade dos parasitos em praticamente todas as concentrações estudadas (1,56; 3,12;6,25; 12,5;25 e 50μM) com um IC50 de 11,3; 6,33 e 9,6 μM respectivamente, com índice de seletividade de 315. Ensaios com as formas tripomastigotas em diferentes concentrações (0,045; 0,09; 0,18; 0,39; 0,78 e 1,56 μM), demostraram que o BatxC é tóxico a partir das concentrações de 0,18 μM, aproximando-se 100% de letalidade na concentração de 1,56 μM. Finalizando os ensaios de toxicidade do BatxC, ensaios em formas amastigotas também foram realizados após estudo da citotoxidade em células LLC-MK2 e RAW264.7, mostrando que nas concentrações testadas (0,44 e 0,88 μM) em 24 , houve uma redução de 40% e 45% de células infectadas, respectivamente. Em 48h não houve diminuição do percentual de infecção das células. O percentual de inibição das formas amastigotas tratadas com BatxC foi de 33% (IC50) e 43,5% (2xIC50) em 24h, e 23% (IC50) e 33% (2xIC50) em 48h. Esses resultados demostraram uma redução do índice de sobrevivência de formas amastigotas. Posteriormente, ensaios de citometria de fluxo com Anexina VPE e 7-aminoactinomicina (7-AAD), demostraram uma maior população de parasitos marcados com 7-AAD, nas concentrações avaliadas IC50 (11,3μM) e 2x IC50 (22,6μM) demostrando que a morte induzida pela BatxC é predominantemente por necrose. Em seguida foram realizados ensaios com DCF e Rodamina 123, para investigar o envolvimento de espécies reativas de oxigênio (EROS) e alteração do potencial de membrana mitocondrial, na morte celular induzida por BatxC. Os resultados obtidos demostraram que houve um aumento dos EROS e alteração do potencial transmembranico mitocondrial. A via de morte celular de T.cruzi por um mecanismo necrótico foi finalmente confirmada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) que demostrou perda de integridade da membrana celular. Em conclusão, a BatxC inibiu todas as formas evolutivas de cepa Y de T. cruzi, com alto índice de seletividade, induzindo necrose.