Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Calreticulina es una proteína con múltiples funciones presente en todas las células de organismos superiores, salvo eritrocitos. En protozoos parásitos, hemos demostrado que calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe el sistema del complemento humano y la angiogénesis y promueve la infectividad parasitaria. Esta proteína se expresa en la superficie del parásito y en organelos citoplásmicos. Su gen posee una localización cromosómica variable, sugiriendo que TcCRT estaría codificada por múltiples copias génicas organizadas en “tandem” con posibles implicancias funcionales. Obtuvimos ADN cromosomal de cultivos in vitro de epimastigotes. Mediante Electroforesis en Gel de Campo Pulsado (PFGE), seguido por hibridación con sonda radiactiva (correspondiente al dominio C-terminal de TcCRT) localizamos el gen TcCRT en las cepas Y, MF y Tulahuén y los clones DM28c y Cl Brener. Para evaluar el número de copias del gen TcCRT se realizó una cinética de digestiones parciales con la enzima BamH1 para generar fragmentos de ADN que contengan desde una a múltiples copias del gen. Los productos de digestión fueron separados por PFGE y el gen fue detectado con la sonda anterior. Nuestros resultados corroboran que TcCRT se encuentra en varios cromosomas de diferente tamaño, probablemente correspondan a pares homólogos donde TcCRT está presente en una sola copia. Estos datos concuerdan con la secuencia publicada del genoma de T. cruzi, Cl Brener, y sugieren que las múltiples funciones de TcCRT estarían controladas a nivel postranscripcional.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / La calreticulina recombinante de Trypanosoma cruzi (rTcCRT) aplicada tóipicamente es más efectiva que su contraparte humana en inducir proliferación y migración fibroblástica in vitro, correlacionándose con los efectos in vivo de esta proteína, la cual estimula un cierre acelerado de heridas en piel de ratas. Para estudiar una de las posibles vías por la cual podría ocurrir este proceso, se analizó la influencia directa de rTcCRT sobre la diferenciación a fibroblastos a partir de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) subcutáneo, adyacente a la herida. Para esto, se propuso detectar la expresión de genes fibrogénicos específicos en ADSC, en presencia de rTcCRT, in vitro. Las ADSC de rata fueron aisladas y cultivadas para comprobar el potencial multilinaje a linaje osteogénico, adipogénico y fibrogénico. La diferenciación a cada linaje a través de tinción histoquímica y RT-PCR, a las cuatro semanas. Por otro lado, se cultivaron ADSC en medio de cultivo suplementado con rTcCRT para observar el potencial efecto diferenciador a fibroblastos. Su detección se realizó a través tinción tricrómica de Mallory luego de cuatro semanas, revelando la presencia de fibras colágenas, con patrones similares a aquellos obtenidos en los controles positivos de fibroblastos dérmicos de rata. Se utilizó RT-PCR para identificar la expresión de genes fibrogénicos, mostrando una significativa expresión de genes fibrogénicos en las ADSC suplementadas con rTcCRT y una expresión no detectable en las ADSC control sin suplementar. / Recombinant Trypanosoma cruzi calreticulin (rTcCRT) topically applied is more efficient than its human counterpart on its capacity to increase fibroblastic proliferation and migration in vitro, and correlates with an accelerated rat skin wound healing process in vivo. To study one of the possible pathways by which this process occurs, the direct influence of rTcCRT in the differentiation to fibroblasts of the subcutaneous population of rat adipose derived stem cells (ADSC) surrounding the wound, was analyzed. For this purpose, we detected the expression of specific fibrogenic genes in rTcCRT-supplemented ADSC, in vitro. Rat ADSC were obtained and cultured to analyze their multilineage potential to osteogenic, adipogenic and fibrogenic lineages. The differentiation was detected through histological staining and RT-PCR, after four weeks of culture. On the other hand, ADSC were cultured in supplemented growth medium supplemented with rTcCRT to observe the fibroblast differentiation-effect. The detection was accomplished by Mallory's trichrome staining direct histology after four weeks of culture, revealing the presence of collagen fibers with similar staining patterns to those obtained with rat skin fibroblasts primary cultures as positive controls. RT-PCR was also used to identify the expression of fibrogenic genes, showing significative expression of fibrogenic genes in the rTcCRT-supplemented ADSC and no detectable expression in ADSC negative control cultures. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1130257 y Proyecto U-INICIA 2036.