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Clonamiento, expresión y purificación de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas TcAP1 y TcAP2 de Trypanosoma cruzi en condiciones nativasDelgadillo Liberona, José Sebastián January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El agente causal de la enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad es de carácter endémico en América Latina; se estima un promedio de 10-15 millones de personas infectadas y 75-90 millones en riesgo de contraer la enfermedad. T. cruzi posee un ciclo de vida indirecto y se presenta en cuatro formas celulares; epimastigote, forma extracelular replicativa y no infectiva, tripomastigote metacíclico y tripomastigote sanguíneo, formas no replicativas e infectivas y amastigote, forma intracelular replicativa.
T. cruzi es capaz de sobrevivir al daño oxidativo del DNA generado por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) producidas por su propio metabolismo, así como aquellas producidas en el intestino del insecto vector y en células del hospedero mamífero. Este daño sería reparado mediante la actividad de las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP) de la vía de escisión de bases (BER). T. cruzi presenta en su genoma secuencias que codificarían para endonucleasas AP, entre ellas TcAP1, homóloga de APE1 humana y TcAP2, homóloga de APE2 humana y de Apn2 de Schizosaccaromyces pombe. La expresión de estas proteínas podría ser fundamental para la sobrevida del parásito, tanto en el vector triatomino como en el hospedero mamífero.
Para un estudio sistemático de las características de estas enzimas, se requiere obtenerlas en el más alto grado de pureza desde el parásito o por técnicas de ingeniería genética. En esta Memoria de Título se clonaron las secuencias génicas que codifican para TcAP1 y TcAP2 en vectores de expresión para células eucariontes, lo que se confirmó mediante secuenciación automática de DNA. Con estos constructos se transfectaron células S2 de Drosophila melanogaster, levaduras Pichia pastoris y epimastigotes de T. cruzi cepa Dm28c. Sorprendentemente, sólo fue posible expresar ambas endonucleasas en este último modelo.
La imposibilidad de expresar ambas endonucleasas AP en los modelos P. pastoris y D. melanogaster podría relacionarse a una variedad insuficiente o limitada de ciertos tRNAs, necesarios para la expresión de TcAP1 y TcAP2, con la consecuente disminución de la traducción de los mRNAs codificantes para ambos genes. Probablemente, los tRNAs que presentan anticodones específicos para la traducción de las endonucleasas AP de T. cruzi sólo se encuentran en concentraciones adecuadas en modelos celulares de expresión filogenéticamente cercanos a este protozoario.
Mediante cromatografía de afinidad se intentó purificar TcAP1-GFP a partir de homogeneizados de proteínas totales de epimastigotes transfectados que expresaban esta proteína recombinante. Sin embargo no se logró obtener la proteína recombinante en condiciones nativas de forma pura. Se concluye que la utilización de GFP asociado como proteína de fusión a TcAP1 sólo permite la identificación de la proteína recombinante y no una purificación adecuada de la misma / Proyecto Bicentenario Anillo ACT 112, CONICYT, Chile.
Proyecto FONDECYT 1090124.
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Identificación y caracterización de la enzima flap endonucleasa de trypanosoma cruzi (TcFEN1) : su rol en la proliferación del parásito y su resistencia frente a daño oxidativoPonce López, Iván Alexis January 2017 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Bioquímica / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es un protozoo parásito, agente causal de la enfermedad de Chagas, endémica en el continente americano. Presenta un ciclo de vida complejo, infectando tanto hospederos mamíferos como insectos triatominos (hematófagos) y presentando cuatro formas celulares: tripomastigotes sanguíneos, epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes metacíclicos. En humanos, la infección por T. cruzi en etapas avanzadas puede provocar serios trastornos cardíacos y digestivos, con un alto costo médico, y que pueden ser mortales de no ser tratados adecuadamente. Hasta el momento, no existe una cura definitiva para la infección crónica por T. cruzi.
Este parásito sobrevive al efecto de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) generadas tanto por células del hospedero mamífero como por la digestión de la sangre en el insecto hematófago. Se ha propuesto que estas especies reactivas dañan el DNA del parásito y que éste sobrevive activando el mecanismo de reparación del DNA por escisión de bases (vía BER). Este es un proceso muy conservado, que presenta dos sub-vías: la vía corta, en la que se reemplaza un nucleótido, o la vía larga, donde se insertan dos o más nucleótidos. En esta vía de reparación del DNA participan distintas enzimas, como DNA glicosilasas, AP endonucleasas (APE), DNA polimerasas, flap endonucleasas (FEN1) y DNA ligasas. Hasta el momento, se ha demostrado que: 1) el DNA del parásito es dañado por ROS/RNS; 2) T. cruzi tiene la capacidad de reparar el daño producido por estas especies reactivas; 3) metoxiamina, un inhibidor de AP endonucleasas, aumenta la muerte celular provocada por ROS/RNS; 4) el parásito tiene dos DNA glicosilasas y dos AP endonucleasas activas. A la fecha de realización de esta Tesis no se había definido la presencia de flap endonucleasas así como de las diferentes vías (corta y/o larga) de reparación del DNA por escisión de bases en T. cruzi.
Las enzimas flap endonucleasas (FEN1) se caracterizan por reconocer sustratos de DNA con estructuras específicas, que se generan en diversos procesos celulares, como la replicación del DNA o su reparación mediante la vía larga del mecanismo BER. Estudios en diversos eucariontes han demostrado su importancia en la reparación del daño oxidativo al DNA, así como en la mantención de la integridad genómica.
En esta Tesis se investigó la presencia y actividad de una enzima flap endonucleasa de T. cruzi (TcFEN1), su expresión, su localización celular y su rol en la proliferación y en la sobrevida del parásito frente a condiciones de estrés oxidativo. Se demostró la presencia de actividad flap endonucleasa en distintas formas celulares de T. cruzi y se describieron algunas de sus propiedades. Paralelamente se encontró una secuencia correspondiente a una flap endonucleasa en el genoma publicado de T. cruzi, a partir de la cual se crearon plásmidos que permitieron la expresión en epimastigotes de T. cruzi de proteínas de fusión TcFEN1-GFP que también presentaron actividad flap endonucleasa y que se localizaron en el núcleo de epimastigotes del parásito, según estudios de microscopia de fluorescencia. Por otro lado, se observó un incremento en la proliferación de los epimastigotes que expresaban TcFEN1-GFP, así como una mayor sobrevida frente a la exposición sostenida a H2O2 respecto a lo observado en parásitos control. En base a los resultados obtenidos, TcFEN1 se presenta como protagonista en procesos claves para la infección por T. cruzi como son la proliferación y resistencia frente a daño oxidativo, por lo que desarrollar inhibidores específicos de TcFEN1 podría potenciar el efecto citotóxico del daño oxidativo al DNA generado por las células del hospedero, así como potenciar el tratamiento de la infección por T. cruzi por drogas convencionales, actualmente muy poco eficientes en el tratamiento de la enfermedad de Chagas crónica / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) is a protozoan parasite, the etiological agent of Chagas´s disease, endemic in the American continent. It presents a complex life cycle, infecting both mammalian and triatomine insects and presenting four cellular forms: blood trypomastigote, epimastigote, amastigote and metacyclic trypomastigote. In humans, T. cruzi infection in advanced stages can cause serious cardiac and digestive disorders, with a high medical cost, and can be fatal if not treated properly. To date, there is no definitive cure for chronic T. cruzi infection.
This parasite survives the effect of reactive oxygen and nitrogen species (ROS / RNS) generated by both mammalian host cells and by the digestion of blood in the hematophagous insect. It has been proposed that those reactive species damage the DNA of the parasite but it survives by activating the mechanism of DNA repair by base excision (BER pathway). This is a highly conserved process, which has two sub-pathways: the short one, where a single nucleotide is replaced, or the long one, where two or more nucleotides are inserted. Different enzymes, such as DNA glycosylases, AP endonucleases (APE), DNA polymerases, flap endonucleases (FEN1) and ligases are involved in that DNA repair pathway. To date, it has been shown that: 1) the DNA of the parasite is damaged by ROS / RNS; 2) T. cruzi repairs the damage produced by these reactive species; 3) methoxyamine, an inhibitor of AP endonucleases, increases ROS/RNS-induced parasite cell death and 4) T. cruzi presents two DNA glycosylases and two active AP endonucleases. At the date of this thesis, the presence of the different pathways (short and / or long) of DNA repair by base cleavage in T. cruzi had not been defined.
Flap endonuclease enzymes (FEN1) are characterized by recognizing DNA substrates with specific structures, which are generated in various cellular processes, such as DNA replication or repair by the long path of the BER mechanism. Studies in various eukaryotes have demonstrated their importance in the repair of oxidative damage to DNA, as well as in the maintenance of genomic integrity.
In this thesis the presence and activity of a T. cruzi flap endonuclease enzyme (TcFEN1), its expression, its cellular localization and its role in the proliferation and survival of the parasite against oxidative stress conditions were investigated. The presence of TcFEN1 was demonstrated in different cellular forms of T. cruzi and some of its properties were described. In parallel, a sequence corresponding to a flap endonuclease was found in the published T. cruzi genome, from which plasmids were created that allowed expression in T. cruzi epimastigotes of TcFEN1-GFP fusion proteins that also had flap endonuclease activity and were located in the epimastigotes nucleus, according to fluorescence microscopy. On the other hand, there was an increase in the proliferation of epimastigotes expressing TcFEN1-GFP, as well as a higher survival to H2O2 sustained exposure than observed in control parasites. Based on the results obtained, TcFEN1 is presented as a protagonist in key processes for infection by T. cruzi, such as proliferation and resistance to oxidative damage. Therefore, the development of specific inhibitors of TcFEN1 may enhance the cytotoxic effect of oxidative DNA damage generated by the host cells, as well as potentiate the treatment of T. cruzi infection by conventional drugs, currently very ineffective in the treatment of chronic Chagas´disease / Conicyt; Fondecyt
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Generación de la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1 como herramienta para la futura identificación de proteínas que interaccionan con la endonucleasa apurínica/apirimidínica TcAP1 de Trypanosoma cruziCofré Lorca, Laura Alicia January 2017 (has links)
Memoria para optar al título de Bioquímico / El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 8 millones de personas infectadas. El ciclo de vida de T. cruzi involucra insectos vectores y mamíferos hospederos, en los cuales se diferencia en tres formas celulares finales: epimastigote (extracelular y replicativa) presente en los vectores triatominos; tripomastigote (extracelular no replicativa e infectiva) que se encuentra tanto en insectos vectores como en hospederos mamíferos; y amastigote (intracelular y replicativa) presente en hospederos mamíferos. En ambos hospederos, T. cruzi se encuentra sometido a la acción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) que dañan su DNA. No obstante, el parásito sobrevive a la acción del estrés oxidativo. En la mayoría de los eucariontes, el daño oxidativo al DNA es reparado principalmente por la vía de reparación por escisión de bases (BER), proceso conservado en el que participan una serie de proteínas con actividad enzimática, siendo fundamentales las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP). En el genoma de T. cruzi se identificó la secuencia de la endonucleasa AP TcAP1, homóloga al endonucleasa AP de humano (APE1). Se demostró que la sobrexpresión de esta enzima incrementa la viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a ROS/RNS y que la inhibición de la actividad de TcAP1 genera el efecto opuesto; es decir, disminuye la viabilidad de los parásitos tratados con agentes oxidantes. Actualmente, se sabe que APE1 humana se relaciona directamente con otras enzimas de la vía BER y modula la expresión de proteínas que participan de otras vías de reparación del DNA. Hasta el momento no se ha determinado si TcAP1 se asocia a otras proteínas, como ocurre con su ortóloga APE1 en humanos. En esta memoria de título se propuso generar herramientas que permitan a futuro identificar las proteínas parasitarias asociadas a la endonucleasa TcAP1 de T. cruzi, las cuales podrían modular o ser moduladas por ella. Para tales efectos, se diseñaron dos construcciones plasmidiales (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 y pTREX-cmyc-tcap1) con el objetivo de generar proteínas de fusión de TcAP1 asociadas a diferentes epítopes ((HA)3-(FLAG)3 o c-Myc). Estos vectores de expresión se transfectaron en XIepimastigotes de la cepa Y de T. cruzi, los que se seleccionaron con el antibiótico G-418. Solo se obtuvieron epimastigotes transfectantes que expresaron la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1, evidenciado mediante ensayos de Western blot. Utilizando un kit comercial (anti-cMyc), se realizaron ensayos de inmunoprecipitación sobre homogeneizados de proteínas totales obtenidas desde los epimastigotes transfectantes que expresan N-cMyc-TcAP1 y epimastigotes control no transfectados. Las proteínas obtenidas se separaron mediante electroforesis bidimensional en condiciones desnaturantes con el objetivo de evidenciar patrones electroforéticos diferenciales entre parásitos transfectantes y controles. Las proteínas detectadas de manera exclusiva para los parásitos transfectantes se enviaron a identificar mediante espectrometría de masa, sin embargo, no se obtuvieron resultados concluyentes. A pesar de los problemas presentados, esta memoria de título presenta una gran relevancia para nuestro laboratorio, ya que permitió generar herramientas para la futura identificación de proteínas reguladoras de la actividad de TcAP1 o que son reguladas por ella / The etiologic agent of Chagas disease is the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi). This disease is endemic in Latin America and an estimated 8 million people are infected. The life cycle of T. cruzi involves triatomine insect vectors and mammalian hosts, in which it differs in three final cellular forms: epimastigote (extracellular and replicative) present in triatomine vectors; trypomastigote (non-replicative and infective extracellular form) found in both, insect vectors and mammalian hosts; and amastigote (intracellular and replicative) present in mammalian hosts only. Inside both hosts, T. cruzi is exposed to reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) that damage the parasite DNA, however the parasite survives. In most eukaryotes, oxidative DNA damage is repaired mainly by the base excision repair pathway (BER), a conserved mechanism, in which a series of proteins with enzymatic activity participate, being apurinic/apyrimidinic endonucleases (AP endonuclease) essential to this process. In the T. cruzi genome the nucleotide coding sequence for an AP endonuclease (TcAP1), homologous to human AP endonuclease (APE1), was identified. In previous reports it has been demonstrated that the overexpression of this enzyme in T. cruzi, increases the viability of epimastigotes and trypomastigotes exposed to ROS/RNS and that the inhibition of TcAP1 activity generates the opposite effect, decreasing the parasite viability. Currently, human APE1 is known to directly interact with other enzymes of the BER pathway and modulates the expression of proteins involved in other DNA repair pathways. To date, it has not been determined whether T. cruzi TcAP1 is associated with other proteins, similar to those reported for APE1 ortholog human protein. In this work, it was proposed to generate tools that allow the future identification of parasitic proteins that interacts with the TcAP1 endonuclease, which could modulate their activity or or proteins that modulate their activity product of its interaction with TcAP1. For this purpose, two plasmid constructs (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 and XIIIpTREX-cmyc-tcap1) were designed with the aim of generating TcAP1 fusion proteins associated with different tags ((HA)3-(FLAG)3 or c-Myc). These expression vectors were transfected into epimastigotes of the T. cruzi Y strain, which were selected with the G-418 antibiotic. Only transfectant epimastigotes expressing the N-cMyc-TcAP1 fusion protein, evidenced by Western blot assays, were obtained. Using a commercial kit (anti-cMyc), immunoprecipitation assays were performed on total protein homogenates obtained from transfectant epimastigotes expressing N-cMyc-TcAP1 and untransfected control epimastigotes. The proteins obtained were separated by two-dimensional electrophoresis under denaturing conditions with the aim of evidencing differential electrophoretic patterns between transfectant and control parasites. The proteins exclusively detected for the transfectant parasites were sent to be identified by mass spectrometry. However, these could not be identified. Despite the presented problems, this title memory presents a great relevance for our laboratory, since it allowed to generate tools for the future identification of proteins that interacts with the TcAP1 enzyme
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Uso de la reacción en cadena de la polimerasa y de la endonucleasa de restricción BccI para la detección diferencial de cuatro serovares de Leptospira interrogans : estudio preliminarBravo Músare, Javier Alonso January 2017 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La leptospirosis es una enfermedad de distribución mundial, que afecta tanto a animales como a humanos. Es transmitida por la orina de todo animal infectado dentro de los cuales los roedores son uno de los más reconocidos, además de poder ingresar al organismo a través de elementos contaminados como alimentos o el agua de bebida, e incluso por mucosa o piel erosionada. Leptospira interrogans serovar canícola, Leptospira interrogans serovar icterohaemorragiae, Leptospira interrogans serovar pomona y Leptospira interrogans serovar grippotyphosa afectan a caninos, porcinos, equinos y bovinos. Existe especial preocupación ante la posibilidad de infeccion con esta bacteria, produciendo cuadros de signología variada, desde fiebres oscilantes, enfermedad renal, hemorragias, e incluso la muerte. Producto de las características de esta enfermedad, y de los múltiples serovares patógenos de este agente, se hacen necesarios métodos diagnósticos con los cuales se pueda detectar la leptospirosis y diferenciar sus serovares, en lo posible, de una forma rápida, exacta y por su condición de enfermedad infecciosa, segura.
Es así como surge la interrogante de un método diagnóstico diferencial de cuatro serovares patógenos de Leptospira, plasmados en el objetivo de esta Memoria de Titulo, añadiendo al protocolo, la participación de la enzima de restricción: BccI, del cual se obtendrán fragmentos de distinto tamaño que permitirían la discriminación entre los serovares expuestos anteriormente.
Como conclusión para este estudio, la detección de Leptospira interrogans mediante PCR fue exitosa, demostrando que los partidores diseñados son específicos para este agente. No así con la diferenciación de los 4 serovares de Leptospira, debido a que la enzima de restricción escindió la doble hebra de ADN, en los 4 serovares, entregando resultados distintos a los esperados. / Leptospirosis is a world disease, affecting both animals and humans, which is transmitted by all infected animal, having the rodents as the most recognized, or enters the body through contaminated elements such as food or drinking water, and even by mucosa or eroded skin. Leptospira interrogans serovar canícola, Leptospira interrogans serovar icterohaemorragiae, Leptospira interrogans serovar pomona y Leptospira interrogans serovar grippotyphosa affect canines, pigs, horses and cattle, making it a concern since it affects pets and productive animals, producing varied signology, from oscillating fever, kidney disease, hemorrhages, to death. Due to the characteristics of this disease, and of the number of pathogenic serovars of the causative agent of this disease, diagnostic methods are necessary in order to detect leptospirosis and to differentiate its serovars in a fast, accurate and because of its infectious, safe condition.
This is how the question of a differential diagnosis method of four Leptospira serovars, expressed in the objective of this work, through the molecular technique of the polymerase chain reaction (PCR), arises, adding the action of the restriction enzyme BccI, and thus generate fragments of different size for the differentiation of the serovars discussed above, by recognition of the gene encoding a lipoprotein membrane, LipL32.
As conclusion for this study, the detection of Leptospira interrogans by PCR was successful also proving that the primers designed for the realization of the method are specific for this agent. Not so with the differentiation of the 4 serovars of Leptospira, because the restriction enzyme cleaves the doublé strand of DNA, in the 4 serovars, delivering different results than expected.
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Efecto de la expresión de la endonucleasa apurínica/apirimidínica APE1 humana y su dominante negativo en epimastigotes de Trypanosoma cruzi sometidos a estrés oxidativoBahamondes León, Paula Alejandra January 2016 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana es uno de los principales problemas de salud pública en América Latina. Dicha patología determina además severas consecuencias a nivel socioeconómico, tanto en la región endémica como en países no endémicos, debido a la globalización de la enfermedad. El agente causal es el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi el cual afecta diversas especies de mamíferos, incluido el humano. Este parásito unicelular presenta un ciclo de vida indirecto, precisando de un vector biológico para su transmisión (insectos hematófagos triatominos). T. cruzi se encuentra en tres formas celulares: epimastigote en insectos vectores; tripomastigote, tanto en vectores triatominos (tripomastigote metacíclico) como en hospederos mamíferos (tripomastigote sanguíneo) y amastigote, forma intracelular presente en hospederos mamíferos. Estas diversas formas parasitarias dan cuenta de la gran plasticidad del parásito para adaptarse a las diferentes condiciones del medio al que se enfrenta, lo que implica notables cambios de su forma, motilidad y características bioquímicas. T. cruzi sobrevive al daño del ADN por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno generadas en ambos hospederos, probablemente por activación del mecanismo de escisión de bases (vía BER), proceso altamente conservado en el que las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (APEs) juegan un rol fundamental.
APE1 es la principal AP endonucleasa de Homo sapiens encargada de reparar sitios abásicos en el DNA. Estudios demuestran que ratones carentes de APE1 mueren tempranamente en el desarrollo, poniendo de manifiesto su importancia en la reparación del DNA. Indagaciones destinadas a hacer más eficientes los tratamientos quimioterapéuticos contra el cáncer, desarrollaron una forma dominante negativa para APE1 que se une al sustrato con una mayor afinidad que la proteína nativa, pero que carece de actividad AP endonucleasa. De esta forma se impediría la reparación del DNA de células tumorales, incrementando su porcentaje de apoptosis por acción de anticancerígenos genotóxicos. En T. cruzi se ha descrito la secuencia del gen ortólogo de ape1 (tcap1) y se ha demostrado que la sobreexpresión de la proteína TcAP1 en epimastigotes de T. cruzi incrementa su viabilidad frente a H2O2 y NOO-.
En esta Memoria de Título se desarrollaron vectores plasmidiales destinados a expresar la forma nativa de APE1 humana, así como del dominante negativo de APE1 (APE1DN) en epimastigotes de T. cruzi. Tanto APE1 como APE1DN presentaron una localización preferentemente nuclear; sin embargo también fue posible detectar ambas proteínas en el citoplasma de los parásitos transfectados. La expresión de la forma nativa de APE1 otorgó mayor resistencia a parásitos frente a la exposición de concentraciones crecientes de H2O2; por el contrario, la expresión de APE1DN incrementó la sensibilidad de los epimastigotes a dicho agente oxidante probablemente por la inhibición de la actividad endonucleasa apurínica/apirimidínica parasitaria. Finalmente se purificó en condiciones nativas la proteína APE1DN desde homogeneizados de epimastigotes transfectados; esta proteína recombínate será utilizada en ensayos bioquímicos posteriores. Sobre la base de estudios previos que demuestran un incremento de la resistencia a agentes oxidantes de epimastigotes que sobrexpresan TcAP1, los resultados de esta Memoria de Título sugieren un importante grado de conservación en la actividad endonucleasa apurínica/apirimidínica entre humano y parásito. Sin embargo, debido al escaso nivel de conservación aminoacídica entre TcAP1 parasitaria y APE1 humana (cercano al 30%) es factible el desarrollo de agentes químicos que permitan inhibir específicamente la endonucleasa parasitaria y, consecuentemente, la vía BER de T. cruzi, sin afectar a Homo sapiens. Estos inhibidores podrían potenciar el efecto citotóxico de daño oxidativo al DNA generado por cardiomiocitos y células del sistema inmune innato. / Chagas disease, also known as American Trypanosomiasis, is one of the most important public health problems in Latin America, with consequences in the economy and social wellness of endemics countries. Today this illness is taking a major impact due to its expansion to non endemic regions. The causative agent of this disease is Trypanosoma cruzi, a protozoan parasite which infects many mammals, including humans. Vectorial transmission of Chagas’ disease is produced by infected triatomine insects that upon feeding on mammal blood, deposits feces with infective parasites (trypomastigotes) that are ingested in vacuoles (parasitophorous vacuoles) in host cells. In the cytoplasm, trypomastigotes differentiate to round amastigotes that undergo 8-9 cycles of multiplication before transforming back to trypomastigotes that escape to circulation. Upon infection of target tissues trypomastigotes change to intracellular amastigotes (amastigote nests) that maintain T. cruzi infection for life. Eventually, blood trypomastigotes may be ingested by a triatomine and transformed to epimastigotes in the vector’s midgut. After multiplication, epimastigotes move to the insect hindgut where they differentiate into infective metacyclic trypomastigotes. Thus, this parasite presents an important plasticity, adapting to different media which implies changes in shape, motility and biochemical properties.
In its life cycle, T. cruzi must overcome diverse oxygen and nitrogen reactive species (ROS and RNS, respectively) that induce DNA damage. For T. cruzi survival, resulting in the development of a chronic infection in mammal hosts, the parasite has to repair its DNA, most probably by activation of the base excision repair pathway (BER). This is a highly conserved mechanism, where apurinic/apyrimidinic endonucleases (APEs) play a key role.
APE1 is the main AP endonuclease in Homo sapiens devoted to repair abasic sites in damaged DNA. The importance of this enzyme is demonstrated by studies in which mice depleted of APE1 dye early during development. Interestingly, studies directed to develop new drugs against cancer have shown that a dominant negative form of that enzyme (APE1DN) binds to an apurinic/apyrimidinic substrate with higher affinity than the native protein, but without AP endonuclease activity. Thus, APE1DN impedes DNA repair in tumor cells, increasing apoptosis induced by genotoxic anti-tumoral drugs. In T. cruzi the sequence of an orthologous ape1 gen (tcape1) has been described and it has been shown that over-expression of the TcAPE1 protein in epimastigotes increases the viability of parasites when chased with H2O2 or NOO-.
In this work plasmidial vectors expressing human APE1 in T. cruzi epimastigotes, as well its negative dominant form (APE1DN), have been developed. Both, APE1 and APE1DN, are mostly located in the nucleus though a low signal was also present in the cytoplasm of transfected parasites. Expression of native human APE1 conferred resistance of transfected parasites to H2O2 exposition. Contrarily, expression of the APE1DN form increases the sensitivity of parasites when exposed to H2O2, probably by inhibition of the native apurinic/apyrimidinic enzyme activity. Additionally, APE1DN was purified in native conditions from transfected epimastigotes homogenates; this recombinant protein will be used in the future in biochemical assays.
Considering that epimastigotes over-expressing TcAP1 show an increase in the resistance to ROS/RNS, results of the present work suggest an important conservation in the apurinic/apyrimidinic endonuclease activity among Homo sapiens and T. cruzi. However, considering the low level of amino acidic conservation between the parasite TcAPE1 and the human APE1 (approx. 30%), it may be possible to develop chemicals directed to inhibit the parasite endonuclease activity without affecting the human one. Those inhibitors could potentiate the parasite DNA damage induced by ROS/RNS generated in the parasitophorous vacuole and by the immune system. / Financiamiento: Proyecto Bicentenario Anillo ACT 112, Proyectos Fondecyt Nos. 1090124, 11100053 y 1130113.
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