Tesis para optar al grado de Doctor En Ciencias de la Ingeniería Mención Ingeniería Química Y Biotecnología / Proponemos la adaptación de la metodología operación evolutiva (EVOP), técnica de optimización continúa usada en procesos industriales, la cual permitió identificar sitios de mutación y tipo de aminoácidos en la estructura de proteínas. A partir de modelos estructurales se determinan los efectos de las mutaciones sobre parámetros estructurales como la entropía de vibración, área de acceso al solvente (ASA), volumen, y cambios de fluctuación de los carbonos α, se evaluó la interacción con el sustrato mediante la aproximación de docking molecular. Con estas herramientas se identificaron ocho mutaciones en la xilanasa antártica Xyl-L (GH 10) que condujeron a un desplazamiento de la temperatura óptima de 30ºC a 57ºC, con respecto a la enzima nativa, las mutaciones propuestas modificaron el equilibrio configuracional y conformacional de la estructura enzimática generando una redistribución de las cargas provocando a su vez un cambio en el pH de la actividad máxima desplazándolo de pH 7 a pH 6 con respecto a la enzima nativa, mostrando que la estabilidad térmica es el producto de la acumulación de diferentes factores estructurales, provocados por las mutaciones identificadas, las cuales serian difíciles de encontrar por los métodos tradicionales de mutagénesis al azar o evolución dirigida. / Comisión Nacional de Investigación Cientifica y Tecnologíca (CONICYT) y el CeBiB

Memoria para optar al título de Bioquímico / El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 8 millones de personas infectadas. El ciclo de vida de T. cruzi involucra insectos vectores y mamíferos hospederos, en los cuales se diferencia en tres formas celulares finales: epimastigote (extracelular y replicativa) presente en los vectores triatominos; tripomastigote (extracelular no replicativa e infectiva) que se encuentra tanto en insectos vectores como en hospederos mamíferos; y amastigote (intracelular y replicativa) presente en hospederos mamíferos. En ambos hospederos, T. cruzi se encuentra sometido a la acción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) que dañan su DNA. No obstante, el parásito sobrevive a la acción del estrés oxidativo. En la mayoría de los eucariontes, el daño oxidativo al DNA es reparado principalmente por la vía de reparación por escisión de bases (BER), proceso conservado en el que participan una serie de proteínas con actividad enzimática, siendo fundamentales las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP). En el genoma de T. cruzi se identificó la secuencia de la endonucleasa AP TcAP1, homóloga al endonucleasa AP de humano (APE1). Se demostró que la sobrexpresión de esta enzima incrementa la viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a ROS/RNS y que la inhibición de la actividad de TcAP1 genera el efecto opuesto; es decir, disminuye la viabilidad de los parásitos tratados con agentes oxidantes. Actualmente, se sabe que APE1 humana se relaciona directamente con otras enzimas de la vía BER y modula la expresión de proteínas que participan de otras vías de reparación del DNA. Hasta el momento no se ha determinado si TcAP1 se asocia a otras proteínas, como ocurre con su ortóloga APE1 en humanos. En esta memoria de título se propuso generar herramientas que permitan a futuro identificar las proteínas parasitarias asociadas a la endonucleasa TcAP1 de T. cruzi, las cuales podrían modular o ser moduladas por ella. Para tales efectos, se diseñaron dos construcciones plasmidiales (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 y pTREX-cmyc-tcap1) con el objetivo de generar proteínas de fusión de TcAP1 asociadas a diferentes epítopes ((HA)3-(FLAG)3 o c-Myc). Estos vectores de expresión se transfectaron en XIepimastigotes de la cepa Y de T. cruzi, los que se seleccionaron con el antibiótico G-418. Solo se obtuvieron epimastigotes transfectantes que expresaron la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1, evidenciado mediante ensayos de Western blot. Utilizando un kit comercial (anti-cMyc), se realizaron ensayos de inmunoprecipitación sobre homogeneizados de proteínas totales obtenidas desde los epimastigotes transfectantes que expresan N-cMyc-TcAP1 y epimastigotes control no transfectados. Las proteínas obtenidas se separaron mediante electroforesis bidimensional en condiciones desnaturantes con el objetivo de evidenciar patrones electroforéticos diferenciales entre parásitos transfectantes y controles. Las proteínas detectadas de manera exclusiva para los parásitos transfectantes se enviaron a identificar mediante espectrometría de masa, sin embargo, no se obtuvieron resultados concluyentes. A pesar de los problemas presentados, esta memoria de título presenta una gran relevancia para nuestro laboratorio, ya que permitió generar herramientas para la futura identificación de proteínas reguladoras de la actividad de TcAP1 o que son reguladas por ella / The etiologic agent of Chagas disease is the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi). This disease is endemic in Latin America and an estimated 8 million people are infected. The life cycle of T. cruzi involves triatomine insect vectors and mammalian hosts, in which it differs in three final cellular forms: epimastigote (extracellular and replicative) present in triatomine vectors; trypomastigote (non-replicative and infective extracellular form) found in both, insect vectors and mammalian hosts; and amastigote (intracellular and replicative) present in mammalian hosts only. Inside both hosts, T. cruzi is exposed to reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) that damage the parasite DNA, however the parasite survives. In most eukaryotes, oxidative DNA damage is repaired mainly by the base excision repair pathway (BER), a conserved mechanism, in which a series of proteins with enzymatic activity participate, being apurinic/apyrimidinic endonucleases (AP endonuclease) essential to this process. In the T. cruzi genome the nucleotide coding sequence for an AP endonuclease (TcAP1), homologous to human AP endonuclease (APE1), was identified. In previous reports it has been demonstrated that the overexpression of this enzyme in T. cruzi, increases the viability of epimastigotes and trypomastigotes exposed to ROS/RNS and that the inhibition of TcAP1 activity generates the opposite effect, decreasing the parasite viability. Currently, human APE1 is known to directly interact with other enzymes of the BER pathway and modulates the expression of proteins involved in other DNA repair pathways. To date, it has not been determined whether T. cruzi TcAP1 is associated with other proteins, similar to those reported for APE1 ortholog human protein. In this work, it was proposed to generate tools that allow the future identification of parasitic proteins that interacts with the TcAP1 endonuclease, which could modulate their activity or or proteins that modulate their activity product of its interaction with TcAP1. For this purpose, two plasmid constructs (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 and XIIIpTREX-cmyc-tcap1) were designed with the aim of generating TcAP1 fusion proteins associated with different tags ((HA)3-(FLAG)3 or c-Myc). These expression vectors were transfected into epimastigotes of the T. cruzi Y strain, which were selected with the G-418 antibiotic. Only transfectant epimastigotes expressing the N-cMyc-TcAP1 fusion protein, evidenced by Western blot assays, were obtained. Using a commercial kit (anti-cMyc), immunoprecipitation assays were performed on total protein homogenates obtained from transfectant epimastigotes expressing N-cMyc-TcAP1 and untransfected control epimastigotes. The proteins obtained were separated by two-dimensional electrophoresis under denaturing conditions with the aim of evidencing differential electrophoretic patterns between transfectant and control parasites. The proteins exclusively detected for the transfectant parasites were sent to be identified by mass spectrometry. However, these could not be identified. Despite the presented problems, this title memory presents a great relevance for our laboratory, since it allowed to generate tools for the future identification of proteins that interacts with the TcAP1 enzyme

Ingeniero Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha crecido continuamente en los últimos años, debido al avance en las técnicas de cultivo y al entendimiento de los procesos celulares. La venta de productos obtenidos a partir de estas técnicas deja importantes utilidades y la obtención de nuevos medicamentos deja grandes ganancias sociales. Dentro de los factores que ayudan a mejorar la productividad, se ha estudiado la posibilidad de intervenir los procesos de apoptosis y degradación de proteínas. En este contexto es donde cobra relevancia la obtención de modelos que estudien estas vías. En este documento se busca estudiar y modelar la degradación de proteínas via lisosomal. Para ello se realiza una investigación bibliográfica, se eligen los componentes del modelo, se plantean reacciones para poder deducir ecuaciones y simularlas. Se obtienen gráficos que describen diferentes procesos del sistema. Uno de los proncipales resultados fue la ratificación de que la degradación via lisosoma es más lenta que el replegamiento de proteínas. Las proteínas son degradadas entre 16 y 30 minutos luego de comenzada la simulación. Se logra describir tanto la generación de autolisosoma como la degradación de este. Se propone y realiza una simplificación de la formación del complejo Atg12Atg5Atg16, la que no altera visiblemente la degradación de autolisosoma. Por otra parte, se propone en un futuro modificar las condiciones gatillantes del estrés celular, con el fin de robustecer el modelo Finalmente se destaca la utilidad que puede tener un modelo de degradación de proteínas agregadas vía lisosomal. La aplicación de este podría generar utilidades y posicionar a la industria en un nivel más competitivo.

Memoria para optar al título de Ingeniero Civil Químico / Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología / En búsqueda de un sistema de expresión recombinante que reduzca los requerimientos de purificación respecto a los de alternativas existentes, se optó por desarrollar la secreción inducible. Para esto fue necesario definir los componentes del sistema junto con la variable operacional de control, cuya modificación activa la liberación de las proteínas producidas desde la célula hospedera al sobrenadante del cultivo. Las proteínas autotransportadoras poseen un sistema de secreción eficiente y constan de dos dominios distintivos en su forma madura: el dominio pasajero (DP), unidad funcional que se expone al medio extracelular, y la unidad de translocación (UT), que se inserta en la membrana externa para permitir el paso del DP desde el periplasma. Dentro de esta familia, el antígeno 43 (Ag43) de Escherichia coli K12 representa un candidato ideal como base para el sistema de expresión. El enlace peptídico que une al DP y la UT es clivado autoproteolíticamente y posteriormente ambos dominios permanecen asociados por interacciones no covalentes, por lo que se pueden separar fácilmente. Si en el corte o la asociación participan aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas, una modificación en el pH del medio podría alterar su interacción, cambiando la tasa de liberación del DP. Para identificar la zona dentro de la proteína que cataliza la proteólisis se diseñaron variantes de Ag43 nativa con distintos segmentos del DP y enhanced green fluorescent protein (EGFP) como módulo reportero. Se construyeron mediante Gibson Assembly en vectores pET22 y luego se indujo su expresión. Analizando proteínas quiméricas tanto de células enteras como lisadas se comprueba que el corte ocurre incluso cuando se elimina el sitio activo propuesto en literatura, correspondiente a un motivo aspartil-proteasa dentro del DP. Utilizando la fluorescencia de EGFP se monitoreó la localización del DP en función del tiempo paralelamente en medios con pH 7, 6 y 5, observándose una disminución en la liberación hacia el sobrenadante a medida que éste se acidifica. Se determinó que el segmento del DP necesario para la autoproteólisis son sus últimos 50 aminoácidos (extremo carboxilo), lo que refuta el supuesto de que el sitio identificado previamente es responsable del corte. Dado que el pH óptimo de cultivo para E. coli es de 7 y la liberación máxima en el sobrenadante se registró para el mismo pH, se descarta la acidificación del medio como método para inducir la secreción. Existe la posibilidad de mantener la secuencia nativa y estudiar el comportamiento del fenómeno frente a cambios en otras variables de operación o identificar con exactitud los aminoácidos clave para el corte y la asociación entre dominios con el fin de someterlos a Ingeniería de Proteínas.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La proteína RfaH de E. coli es un regulador transcripcional perteneciente a la ampliamente conservada familia NusG, que incrementa la expresión de genes distales en operones estrechamente relacionados con virulencia. Esta expresión controlada toma lugar de manera posterior al reclutamiento específico de RfaH a una hebra de ADN expuesta en la superficie del complejo de elongación de transcripción, pausado en la secuencia nucleotídica ops. RfaH posee un dominio C-terminal plegado en forma de α-hélice (αCTD) compactada contra la superficie de unión a polimerasa de ARN (ARNP) del dominio N-terminal e inhibiéndolo, mientras que el de su parálogo NusG corresponde a un plegamiento barril-β (βCTD) sin interacción a la ARNP y con alta movilidad. Sin embargo, cuando ambos dominios de RfaH se disocian (evento necesario para unirse a la ARNP), el dominio C-terminal sufre un cambio de plegamiento desde α-hélice a un barril-β idéntico estructuralmente al de NusG, permitiendo la activación del NTD, y además reclutando la proteína ribosómica S10 para acoplar la transcripción con la traducción. RfaH es la primera proteína metamórfica cuyo cambio estructural está asociado a un cambio funcional. Debido a la escasa estabilidad de RfaH en solución la mayoría de los estudios termodinámicos han sido computacionales, sugiriendo la presencia de un intermediario que conecta ambos estados; sin embargo, a la fecha no se ha realizado un análisis profundo que conecte las dinámicas observadas computacionalmente con datos experimentales contrastables. En este trabajo de tesis se evaluó si el plegamiento del dominio C-terminal de RfaH ocurre previo al desplegamiento del NTD, con especial énfasis en las características termodinámicas de aquél proceso. Esto se realizó mediante distintos enfoques computacionales incluyendo modelos basados en estructura y dinámica molecular de confinamiento. Computacionalmente, se utilizaron modelos nativo-céntricos para simular el desplegado mecánico de RfaH en ambos estados nativos. A pesar de que estos modelos se han usado consistentemente para estudiar fenómenos de plegamiento, las magnitudes computacionales o “reducidas” no se encuentran calibradas respecto a su contraparte experimental. Por ello, inicialmente se estudió el desplegado mecánico de 35 proteínas depositadas en el PDB para poder estimar la capacidad de estos modelos de reproducir características experimentales. Utilizando ponderación por orden de contacto, se obtuvo una aproximación lineal de las fuerzas estimadas/experimentales (R=0,934) con un error estándar de 56 pN. Al realizar simulaciones de estiramiento de RfaH en estas condiciones, se observó consistentemente que el CTD se despliega independiente del NTD. A una velocidad de 100 nm∙s-1, la disociación y desplegado del αCTD ocurre a 43 ± 6 pN, mientras que el βCTD se despliega a los 35 ± 5 pN dando lugar a la formación de un intermediario β-extendido, que expone su núcleo hidrofóbico y se despliega a los 29 ± 4 pN. Utilizando este enfoque también se modeló el replegamiento del CTD en ambos estados. Mostrando alta histéresis para el caso del αCTD, y distribuciones de trabajo solapantes con las del desplegamiento para ambos pasos de desplegamiento del βCTD, permitiendo estimar un ΔG de 12,0 y 8,7 kcal mol-1 para la reacción βCTD ⇄ I ⇄ desplegado, respectivamente. Por otro lado, se calculó la estabilidad de ambos estados mediante dinámica molecular de confinamiento, entregando un ΔG = 6,5 kcal∙mol-1 para la reacción αRfaH ⇄ βRfaH. Una descomposición a nivel de residuo de esta diferencia de energía muestra alta correlación con la estabilidad relativa calculada a partir de espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio. Esto permitió identificar una estabilidad diferencial de segmentos al interior de RfaH, en la cual los residuos 129-146 están altamente estabilizados en el αCTD asociado al NTD, mientras que las otras dos regiones 115-128 y 147-162 favorecen enormemente un plegamiento βCTD, y apoyan la predicción energética predicha por las dinámicas de confinamiento. Este trabajo corresponde a la primera investigación termodinámica de la transición de RfaH, dando luces además de los directores en secuencia de esta transformación, y caracterizando su estabilidad y vía por la cual se conecta con el estado desplegado / The idea of a singular native state has been overruled by metamorphic proteins such as RfaH. This is a transcription factor composed of two domains: The N-terminal (NTD, 100 residues) and C-terminal (52 residues) domains. In solution this protein is autoinhibited, and it becomes activated by completely refolding its C-terminal domain from its initial α-hairpin to a β-barrel when binding to the transcriptional machinery. Through multiple molecular dynamics approaches, it was possible to computationally characterize and predict the folding pathways of both RfaH states, and estimate the free-energy difference required for converting them. Using structure-based models, the single-molecule mechanical unfolding of α-folded RfaH was simulated, which takes place by two sequential events: the simultaneous dissociation and unfolding of its α-helical C-terminal domain (αCTD), and a secondary unfolding of the NTD. On the other hand, when starting from the β-folded C-terminal domain (βCTD), RfaH unfolding occurs mediated by two different intermediates: first, the β-barrel opens and becomes solvent exposed turning into an extended-β intermediate. In a tertiary transition, this intermediate is unfolded and only the NTD remains structured, which shares the same folding characteristics as when unfolding from the α-state RfaH. Analysis of the unfolding of 35 different proteins using structure-based models allowed for estimation of forces from simulations. Using this approach, reversible unfolding of CTD was performed, yielding high hysteresis between the un- and refolding of the αCTD; and overlapping work distributions for such processes in the βCTD, enabling equilibrium free energy calculation through Crooks fluctuation theorem. Thus, the predicted ΔG° values for the reaction βCTD ⇄ Intermediate ⇄ unfolded are 12.0 and 8.7 kcal mol-1 respectively. By using confinement molecular dynamics, it was possible to estimate the free energy of the RfaH metamorphosis (αRfaH ⇄ βRfaH) calculated to be 6.5 kcal mol-1. The further decomposition of this free energy is highly correlated with thermodynamic analysis of hydrogen-deuterium mass spectrometry experiments performed for both CTD states. Altogether, this research provides insights into the folding mechanism and thermodynamics of the metamorphic RfaH protein, constituting a significant step forward in understanding the molecular determinants behind the duality of metamorphic proteins

Ingeniero Civil Eléctrico / Los avances tecnológicos han permitido secuenciar el ADN de un organismo de manera mucho más accesible que en el pasado. Esto ha generado grandes volúmenes de información; en particular, de los principales productos génicos, las proteínas. Sin embargo, solo se ha logrado asignar funcionalidad a una centésima parte de las proteínas disponibles, ya que ello se realiza de forma experimental, lo cual es muy laborioso y lento. Es por ello que se han desarrollado un gran número de métodos computacionales que buscan predecir la funcionalidad de las proteínas. Dentro de ellos, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ha sido el más usado, el cual asigna funcionalidad basándose en la noción de homología: proteínas con secuencias aminoacídicas similares tendrían funciones similares. Sin embargo se ha visto que proteínas con secuencias muy distintas pueden tener la misma funcionalidad, y variaciones en la secuencia de una proteína pueden tener grandes impactos en su función. Debido a las limitaciones de la inferencia de funcionalidad basado en homología, numerosos acercamientos basados en aprendizaje de máquinas han sido propuestos como alternativas. CAFA (Critical Assesment of Functional Annotation) es una competencia que busca evaluar las distintas alternativas que han surgido. Este desafío ha arrojado que no existe un método que sobrepase claramente a los demás, además de probar que si bien las alternativas propuestas sobrepasan el rendimiento de BLAST, este último aún sigue teniendo efectividad. En el presente trabajo se propone BLAST-KNN: un algoritmo que ensambla técnicas de aprendizaje de máquinas junto a BLAST para mejorar el proceso de clasificación funcional en enzimas, un subconjunto de las proteínas, utilizando la nomenclatura de los números EC (Enzyme Commission) como etiquetas. De esta manera se aprovecha la efectividad de BLAST y se intentan corregir aquellas clases en que este no tiene un rendimiento perfecto. Se incorpora el uso del programa InterProScan como extractor de características para representar las proteínas, lo que entrega la ventaja de tener información basada no solo en homología. Se seleccionan las características más relevantes usando técnicas de teoría de la información. Usando los datos disponible en SwissProt que cuentan con sus cuatro dígitos EC asignados, se logran mejorar 835 clases en términos del puntaje F1 obtenido solo por BLAST, lo que representa el 55.48% de las clases en que BLAST no tiene un rendimiento perfecto. Además, se muestra un predominio de BLAST-KNN frente a BLAST al evaluar clases con más de un número EC asignado, mejorando el 60.3% de los casos. Por otro lado, se valida PANTHER, CDD y los descriptores propios de InterPro (IPR) como fuente importante de información al momento de predecir números EC a nuevas enzimas. Las limitantes del algoritmo propuesto están en la poca información por clase disponible, teniendo una distribución no uniforme en el número de muestras por etiquetas, lo que fuerza a utilizar algoritmos simples para clasificar. Se propone mejorar la representación de las enzimas incorporando nuevas características, así como extender el clasificador a uno que considere enzimas que no tengan los cuatro dígitos EC asignados. / Este trabajo ha sido parcialmente financiado por Conicyt 11150107

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / El músculo esquelético es un tejido esencial en la mantención de la homeostasis de la glucosa en el organismo. Alteraciones en la respuesta a la hormona insulina en este tejido se relacionan directamente con el desarrollo de resistencia a insulina y diabetes tipo 2. Los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de resistencia a insulina en el músculo esquelético no se conocen con claridad. En este sentido, trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que las alteraciones en la homeostasis del calcio (Ca2+) intracelular disminuyen la respuesta a insulina en el músculo esquelético y cardíaco. HERPUD1 es una proteína ubicada en la membrana del retículo endoplasmático (RE), involucrada en la mantención de la homeostasis del Ca2+ intracelular en condiciones de estrés celular. Se ha descrito que el ratón knockout general para la proteína Herpud1 es intolerante a la glucosa, sin mostrar alteraciones en la secreción de insulina. Dado que el músculo esquelético es principal encargado de la incorporación de glucosa dependiente de insulina en condiciones postprandiales, en esta tesis proponemos que la proteína Herpud1 es necesaria para la adecuada respuesta a insulina en el músculo esquelético. Proponemos además que Herpud1 regula la respuesta a insulina a través de la mantención de la homeostasis del Ca2+ intracelular y su efecto sobre la actividad de la serina-treonina fosfatasa activada por Ca2+ calcineurina. Previamente se ha descrito que esta fosfatasa interactúa con Akt, disminuyendo la señalización de insulina en cardiomiocitos. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que el silenciamiento de la proteína Herpud1 disminuye la captación de glucosa, la translocación del transportador de glucosa GLUT4 hacia la membrana plasmática y la señalización inducida por insulina en la línea celular de músculo esquelético de rata L6 (miotubos). También observamos una disminución en la fosforilación de Akt (Ser- 473) inducida por insulina en el músculo sóleo del ratón knockout general para la proteína Herpud1. El silenciamiento de Herpud1 también se asocia a un aumento en la respuesta de Ca2+ citosólico y a una disminución en la respuesta de Ca2+ mitocondrial dependientes del IP3R en los miotubos L6. Este desbalance en la respuesta de Ca2+ intracelular fue acompañado de un aumento en la actividad de calcineurina. Demostramos además que calcineurina regula la respuesta a insulina en los miotubos L6, y que la inhibición de calcineurina restablece la respuesta a insulina en las células L6 knockdown para Herpud1. Basado en estos resultados, concluimos que la proteína Herpud1 es necesaria para la respuesta a insulina en los miotubos L6 a través de la regulación del eje Ca2+-calcineurina / Skeletal muscle is an essential tissue in the maintenance of glucose homeostasis in the body. Alterations in the response to insulin in skeletal muscle are directly related to the development of insulin resistance and type 2 diabetes. The molecular mechanisms involved in the development of insulin resistance in this tissue are incompletely understood. In this sense, previous works from our laboratory show that alterations in intracellular calcium (Ca⁠2+) homeostasis decreases the insulin response in skeletal and cardiac muscle. Herpud1 is a protein located in the membrane of endoplasmic reticulum (ER), involved in the maintenance of intracellular Ca⁠2+ homeostasis under stress conditions. It has been reported that the general Herpud1 knockout mice display intolerance to a glucose load without showing altered insulin secretion. Given that skeletal muscle is primarily responsible for insulin-dependent glucose incorporation in postprandial conditions, in this thesis we propose that Herpud1 is necessary for the adequate insulin response in this tissue. We also propose that Herpud1 regulates the insulin response through maintenance of intracellular Ca⁠2+ homeostasis and its effect on the activity of the serine-threonine phosphatase activated by Ca⁠2+ calcineurin. Previously it has been described that calcineurin interacts with Akt, decreasing insulin signaling in cardiomyocytes The results obtained in this work show that the silencing of Herpud1 decreases glucose uptake, GLUT4 translocation to plasma membrane and insulin-dependent intracellular signaling in rat derived skeletal muscle cell line L6 (myotubes). We also observed a decrease in insulin-induced Akt (Ser⁠-473) phosphorylation in soleus muscle from general Herpud1-knockout mice. The silencing of Herpud1 is also associated with an increase in the cytosolic Ca⁠2+ response and a decrease in the mitochondrial Ca⁠2+ response induced by IP3R agonist histamine in L6 myotubes. This imbalance in the intracellular Ca⁠2+ response was accompanied by an increase in calcineurin activity. We also show that calcineurin regulates insulin response in L6 myotubes, and that the inhibition of calcineurin restores the insulin response in Herpud1-depleted L6 myotubes. Based on these findings, we conclude that Herpud1 is necessary for the insulin response in L6 myotubes through its role in the regulation of Ca2+-calcineurin axis

Memoria para optar al título de Bioquímico / La vía de señalización Slit/Robo es una vía conservada en muchas especies que está involucrada en la guía de axones y dendritas durante el desarrollo del SNC. Estudios previos han demostrado que esta vía cumple un rol importante en la formación y mantención de límites en estadios tempranos del desarrollo del lóbulo óptico de Drosophila melanogaster. En este trabajo nos centramos en caracterizar la función del ligando de esta vía, la proteína Slit, la cual es secretada al medio extracelular y es procesada proteolíticamente. Encontramos que Slit influye en el establecimiento de límites entre compartimentos durante el desarrollo del lóbulo óptico. Mediante experimentos de rescate del fenotipo de mutantes Slit, usando el sistema Gal4/UAS, evaluamos la contribución de Slit en las diferentes subpoblaciones celulares del lóbulo óptico, donde se expresa: células gliales, neuronas de la médula y fotorreceptores. Descubrimos que la fuente principal de Slit son las neuronas de la médula, aunque investigaciones pasadas sugerían que Slit era secretada por glías. Además, analizamos si la función de Slit es a corta distancia, para lo cual realizamos experimentos de rescate específico en neuronas de la médula utilizando una versión de la proteína Slit con un segmento transmembrana en su extremo N-terminal, para mantenerla anclada a la membrana plasmática. Encontramos que esta versión de la proteína no rescata el fenotipo mutante de slit, por lo que creemos que Slit estaría actuando a largo alcance. Finalmente, realizamos experimentos de rescate específico en neuronas de la médula con una versión de Slit que no se procesa, para determinar si el corte proteolítico de Slit era requerido para su función y encontramos que este procesamiento es dispensable en este contexto. De esta forma, concluimos que Slit en el lóbulo óptico es secretado principalmente por las neuronas de la médula, actúa a larga distancia, y no requiere ser procesado para su acción / The Slit/Robo pathway is a widely conserved across species. It is involved in axon guidance during the development of the Central Nervous System (CNS). Previous studies have demonstrated the importance of this pathway in the formation and maintenance of boundaries in the optic lobe during early developmental stages in Drosophila melanogaster. During this thesis we focused on the characterization of the ligand of this pathway, the Slit protein, which is secreted to the extracellular medium and proteolytically processed. We observed that Slit is important in the establishment of boundaries in the optic lobe during the entire development of the animal. Through rescue experiments using the Gal4/UAS system, we evaluated the role of Slit in different optic lobe subpopulations where is expressed: glia, medulla neurons and photoreceptors. Thereby, we found out that the main source of Slit expression are medulla neurons, even though previous studies suggested that Slit is secreted by glial cells. Then, we assessed if the role of Slit is performed at short-range. For this aim we performed rescue experiments in medulla neurons using a Slit construct bound to a transmembrane domain to keep it attached to the plasma membrane. We observed that this construct did not rescue the mutant phenotype when expressed in medulla neurons. Finally, we performed rescue experiments using a Slit construct that cannot be processed because it lacks the cleavage site, and found that the proteolytic cleavage is not necessary in this cellular context. In summary, we found that during the development of the optic lobe, Slit protein is mainly secreted by medulla neurons, acts as a long-range cue and does not require proteolytic processing for its activity / Fondecyt 11150610

Tesis (bioquímica)--Universidad de Chile, 2013 Tesis (magíster en bioquímica, área de especialización en bioquímica toxicológica y diagnóstico molecular)--Universidad de Chile, 2013

Doctorado en Ciencias, mención Microbiología / El melanoma maligno es un tipo de cáncer a la piel de baja incidencia, pero elevada tasa de mortalidad, por ello continúa la búsqueda de terapias complementarias para su tratamiento. La viroterapia antitumoral aprovecha la destrucción celular que producen algunos virus durante su ciclo infectivo, para eliminar las células tumorales. Sin embargo, a pesar de los promisorios resultados, esta terapia produce efectos adversos debido a la utilización de virus activos. El uso de proteínas virales, como las proteínas de fusión viral, han sido evaluadas como una alternativa en diversas estrategias antitumorales, ya que inducen la formación de sincicios altamente inestables que llevan a una muerte celular capaz de activar a células el sistema inmune in vitro. Sin embargo, la expresión intratumoral de este tipo de proteínas y su efecto modulador en una respuesta inmune antitumoral in vivo, aún no se ha estudiado en detalle. En este estudio, se evaluó y caracterizó el efecto de la expresión de la proteína de fusión del virus respiratorio sincicial humano (hRSV), del reovirus aviar (ARV) y del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) en células de melanoma murino. Se sintetizaron nanopartículas homogéneas utilizando quitosano y vectores de expresión para las proteínas ARV-p10 (NP-ARV) e ISAV-F (NP-ISAV). La expresión de ambas proteínas mediante la transfección con nanopartículas in vitro produjo la formación de sincicios a las 48 horas post-transfección, y un efecto citotóxico a las 120 horas en el caso de NP-ARV y a partir de las 48 horas post-transfección para NP-ISAV. El tratamiento intratumoral de tumores de melanoma con NP-ARV y NP-ISAV indujo un retraso en el crecimiento tumoral e incluso casos de regresión completa del tumor, además de un aumento de linfocitos Th1 sistémicos para NP-ARV. Resultados similares fueron obtenidos tras el tratamiento intratumoral con una suspensión de quitosano (CH), sugiriendo un papel inmunomodulador antitumoral. Por lo tanto, en melanoma murino 1)- la expresión de ARV-p10 e ISAV-F utilizando nanopartículas de quitosano como método de transfección produce la muerte celular mediada por la formación de sincicios in vitro y 2)- el tratamiento intratumoral con CH, NP-ARV y NP-ISAV produce un control del desarrollo del tumor, posiblemente mediado por una respuesta inmune antitumoral de tipo Th1. / Malignant melanoma is a type of skin cancer with low incidence, but a high mortality rate. Therefore, the search for complementary therapies for its treatment continues. The antitumor virotherapy takes advantage of the cellular destruction that some viruses produce during their infective cycle, to eliminate the tumor cells. However, despite the promising results, this therapy produces adverse effects due to the use of active viruses. The use of viral proteins, such as viral fusion proteins, have been evaluated as an alternative in various antitumor strategies, since they induce the formation of highly unstable syncytia that lead to cell death capable of activating the immune system cells in vitro. However, intratumoral expression of this type of proteins and its modulating effect on an antitumor immune response in vivo has not yet been studied in detail. In this study, the effect of expression of fusion protein of human respiratory syncytial virus (hRSV), avian reovirus (ARV) and infectious salmon anemia virus (ISAV) on murine melanoma cells was evaluated and characterized. Homogeneous nanoparticles were synthesized using chitosan and expression vectors for the ARV-p10 (NP-ARV) and ISAV-F (NP-ISAV) proteins. The expression of both proteins by transfection with nanoparticles in vitro produced the formation of syncytia at 48 hours post-transfection, and a cytotoxic effect at 120 hours in the case of NP-ARV and after 48 hours post-transfection for NP-ISAV. Intratumoral treatment of melanoma tumors with NP-ARV and NP-ISAV induced a delay in tumor growth and even cases of complete regression of the tumor, in addition to an increase in systemic Th1 lymphocytes for the case of NP-ARV. Comparable results were obtained after intratumoral treatment with a suspension of chitosan (CH), suggesting an antitumor immunomodulatory role. Therefore, in murine melanoma 1)- the expression of ARV-p10 and ISAV-F using chitosan nanoparticles as transfection method produces cell death mediated by the formation of syncytia in vitro and 2)- the intratumoral treatment with CH, NP-ARV and NP-ISAV produce a control of tumor development, possibly mediated by a Th1 type antitumor immune response. / beca de Doctorado Nacional año 2012 y la beca de Apoyo de Tesis año 2015 otorgada por la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT), cuyo financiamiento me permitió cursar el programa de Doctorado en ciencias, mención Microbiología y financió la realización de esta tesis. / diciembre 2018