Ingeniero Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha crecido continuamente en los últimos años, debido al avance en las técnicas de cultivo y al entendimiento de los procesos celulares. La venta de productos obtenidos a partir de estas técnicas deja importantes utilidades y la obtención de nuevos medicamentos deja grandes ganancias sociales. Dentro de los factores que ayudan a mejorar la productividad, se ha estudiado la posibilidad de intervenir los procesos de apoptosis y degradación de proteínas. En este contexto es donde cobra relevancia la obtención de modelos que estudien estas vías. En este documento se busca estudiar y modelar la degradación de proteínas via lisosomal. Para ello se realiza una investigación bibliográfica, se eligen los componentes del modelo, se plantean reacciones para poder deducir ecuaciones y simularlas. Se obtienen gráficos que describen diferentes procesos del sistema. Uno de los proncipales resultados fue la ratificación de que la degradación via lisosoma es más lenta que el replegamiento de proteínas. Las proteínas son degradadas entre 16 y 30 minutos luego de comenzada la simulación. Se logra describir tanto la generación de autolisosoma como la degradación de este. Se propone y realiza una simplificación de la formación del complejo Atg12Atg5Atg16, la que no altera visiblemente la degradación de autolisosoma. Por otra parte, se propone en un futuro modificar las condiciones gatillantes del estrés celular, con el fin de robustecer el modelo Finalmente se destaca la utilidad que puede tener un modelo de degradación de proteínas agregadas vía lisosomal. La aplicación de este podría generar utilidades y posicionar a la industria en un nivel más competitivo.

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas con mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias. / Lysosomal physiology has been shown to be important for the correct functioning of immune cells, including their migratory and their phagocytic properties. In this work, we aimed to explore the migratory process of immune cells and understand the connection between cytoskeletal dynamics and lysosomal degradative capacity. Specifically, we characterized the role of the calcium permeable channel Trpml in the process of cell migration, as well as that of the immune response and its connection with lysosomal physiology, using as model of study the Drosophila melanogaster macrophages, called hemocytes. Hemocytes are the cellular component of the immune response in Drosophila, performing key functions during development, as well as in immune defense in response to bacterial or parasitic infection. These cells are highly migratory in vivo and, importantly, present a substantial degree of functional and structural conservation with mammalian innate immune cells. Conveniently, the Drosophila genome contains only one gene coding for the Trpml channel, and its mutant phenotype resembles that of Mucolipidosis type IV patients, which bear a loss of function mutation in MCOLN1, the human homolog of the Drosophila trpml gene. Results presented in this thesis demonstrate that Trpml plays a fundamental role in phagolysosomal degradation and in vivo hemocyte migration, and that it participates in these processes through partially independent mechanisms. The most likely scenario is that Trpml is important for the degradative process by favoring phagolysosomal fusion and further phagocytic degradation. This is supported by the fact that calcium ions are needed for the fusion of phagosomal and lysosomal membranes. On the other hand, for the migratory process, localized Trpml activation from the lysosomes in the rear of polarized hemocytes, would promote the local activation of non-muscle myosin-II, which is necessary event to trigger cell body translocation during movement. / La fisiología lisosomal ha mostrado ser importante para el correcto funcionamiento de células inmunes, abarcando tanto sus propiedades migratorias como fagocíticas. En este trabajo, se quiso ahondar en el proceso migratorio de células del sistema inmune para comprender el nexo existente entre la dinámica del citoesqueleto y la capacidad degradativa de los lisosomas. En particular, se caracterizó el rol del canal lisosomal permeable a calcio, Trpml, en el proceso de migración celular, al igual que la respuesta inmune y su vínculo con la fisiología lisosomal, usando como modelo de estudio, los macrófagos de Drosophila melanogaster denominados hemocitos. Los hemocitos, son el componente celular de la respuesta inmune de Drosophila, cumpliendo funciones claves durante el desarrollo, así como durante la defensa ante infección por microorganismos o parásitos. Estas células son altamente migratorias in vivo, e importantemente, presentan un sustancial grado de conservación funcional y estructural con las células del sistema inmune innato de mamíferos. Convenientemente, Drosophila posee sólo un gen que codifica para el canal Trpml, cuyo fenotipo mutante semeja al de pacientes con Mucolipidosis tipo IV, quienes presentan pérdida de función del gen homólogo que codifica Trpml en humanos, MCOLN1. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que Trpml cumple un rol fundamental en la degradación fagolisosomal, y la migración de hemocitos in vivo, y que estaría participando en estos dos procesos mediante mecanismos parcialmente independientes. A partir de los resultados obtenidos podemos proponer que Trpml es fundamental para el procesamiento degradativo, mediante el favorecimiento de la fusión fagolisosomal, y consecuente degradación fagocítica. Esto posiblemente se sustenta en la necesidad de iones Ca2+ para la fusión de las membranas del fagosoma con el lisosoma. Por su parte, en el proceso migratorio, la activación localizada de Trpml desde los lisosomas en la región posterior de células polarizadas, promovería la activación de Miosina-II no muscular en esta región, evento necesario para la translocación del cuerpo celular. / Conicyt 21140289, Proyectos Redes 140004, Fondecyt 1140522, Anillo ACT 1401 y Fondap 15090007.

La supervivencia celular frente a los cambios ambientales requiere el mantenimiento de un equilibrio dinámico entre la síntesis y la degradación de proteínas. La degradación de proteínas, además de regular diferentes procesos celulares, tiene como función principal la eliminación de productos que no son útiles para la célula en determinadas situaciones o cuya acumulación puede ser tóxica. Los productos de esta degradación, es decir los aminoácidos, son reutilizados para la síntesis de nuevas moléculas o son metabolizados para la obtención de energía. La alteración de esta proteólisis intracelular puede llevar a la acumulación en el citoplasma de orgánulos defectuosos o de moléculas que se pueden agrupar en agregados insolubles y que pueden así desencadenar diferentes patologías. Aunque se ha avanzado bastante durante los últimos años en los conocimientos sobre la degradación intracelular de proteínas y de sus principales mecanismos, existen bastantes detalles moleculares todavía desconocidos. Por este motivo es necesario aportar nueva información sobre estos procesos que además podría ser relevante para identificar nuevas dianas terapéuticas y desarrollar tratamientos más eficaces para las enfermedades derivadas de alteraciones en los mismos. La degradación de proteínas ocurre por diferentes mecanismos que pueden clasificarse generalmente en dependientes o no de unos orgánulos citoplásmicos, los lisosomas. La macroautofagia (a la que se denomina generalmente con el término más simple de autofagia) y el sistema ubicuitina-proteasomas son, respectivamente, los más importantes de esos dos grupos. Básicamente, el sistema ubicuitina-proteasomas consiste en la poliubicuitinación de proteínas que son después degradadas por los proteasomas. La autofagia en cambio se inicia con el secuestro de porciones del citoplasma en estructuras de doble membrana que se cierran formando los autofagosomas. Posteriormente, los autofagosomas se fusionan con endosomas y con lisosomas dando lugar a los autolisosomas, en los que por la acción de las proteasas o catepsinas lisosomales se degrada el material encerrado. La autofagia está regulada por una amplia variedad de vías de señalización que responden a multitud de factores ambientales. Entre estos últimos, la situación de ayuno de nutrientes es la inductora más potente de la autofagia. Durante la privación de nutrientes como los aminoácidos, la célula sufre un estrés energético que debe tratar de reducir produciendo ATP a partir de nuevas fuentes. Para ello activa la autofagia para degradar los componentes de la célula, como las proteínas, hasta producir sus unidades básicas que después son metabolizadas. Por el contrario, se ha demostrado que cuando se proporcionan aminoácidos a la célula la autofagia es inhibida. Aunque el efecto sobre la autofagia de los aminoácidos ha sido estudiado ampliamente en muchos laboratorios, no estaba tan claro ese efecto en el caso de otro nutriente, la glucosa, ya que cuando planteamos ese estudio los datos eran contradictorios. En este trabajo hemos podido establecer claramente que la glucosa tiene un papel inductor sobre la autofagia empleando técnicas muy variadas que incluyen: la cuantificación por ¿Western-blot¿ de los niveles del marcador de autofagia LC3-II en presencia o en ausencia de inhibidores lisosomales, la cuantificación de la proteína degradada, total y por la vía autofágica, mediante experimentos de pulso y caza, la cuantificación morfométrica de estructuras autofágicas (equivalentes a autofagosomas y autolisosomas) por microscopia electrónica y la cuantificación de la masa lisosomal por fluorescencia. Además, hemos comprobado que la glucosa también induce la ubicuitinación de proteínas y la degradación de estas por los proteasomas. Con estos y otros datos obtenidos durante el desarrollo de esta tesis doctoral, hemos podido concluir que la glucosa induce la autofagia en todos los tipos celulares estudiados y en todas las condiciones ensayadas. Este efecto disminuye o se enmascara cuando están presentes a la vez otros factores que son inhibidores de la autofagia, como los aminoácidos o el suero bovino fetal, lo que podría explicar algunos de los datos contradictorios en la literatura. La glucosa aporta la energía necesaria para el correcto funcionamiento de la autofagia a partir de unos niveles mínimos de ATP. Un descenso en la disponibilidad energética a través de la inhibición de la glucólisis reprime la autofagia inducida por la glucosa. Sin embargo, la estimulación de la autofagia por glucosa no parece depender únicamente de la disponibilidad de ATP, sino que hemos identificado una vía de señalización en la que no interviene AMPK a pesar de responder al descenso de los niveles de ATP y al aumento de los niveles de calcio durante la incubación en un medio carente de glucosa. Esta vía tampoco implica a mTORC1 y en ella sí interviene en cambio la MAPK p38¿, como hemos comprobado con diferentes inhibidores de esta quinasa, con el uso de siRNAs o empleando MEFs p38-/-. Consideramos que estos resultados contribuyen a clarificar más la regulación de la autofagia por nutrientes y, más concretamente, por uno tan relevante como es la glucosa. / Moruno Manchón, JF. (2013). Regulación de la degradación intracelular de proteínas por glucosa [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34775 / TESIS