Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas con mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias. / Lysosomal physiology has been shown to be important for the correct functioning of immune cells, including their migratory and their phagocytic properties. In this work, we aimed to explore the migratory process of immune cells and understand the connection between cytoskeletal dynamics and lysosomal degradative capacity. Specifically, we characterized the role of the calcium permeable channel Trpml in the process of cell migration, as well as that of the immune response and its connection with lysosomal physiology, using as model of study the Drosophila melanogaster macrophages, called hemocytes. Hemocytes are the cellular component of the immune response in Drosophila, performing key functions during development, as well as in immune defense in response to bacterial or parasitic infection. These cells are highly migratory in vivo and, importantly, present a substantial degree of functional and structural conservation with mammalian innate immune cells. Conveniently, the Drosophila genome contains only one gene coding for the Trpml channel, and its mutant phenotype resembles that of Mucolipidosis type IV patients, which bear a loss of function mutation in MCOLN1, the human homolog of the Drosophila trpml gene. Results presented in this thesis demonstrate that Trpml plays a fundamental role in phagolysosomal degradation and in vivo hemocyte migration, and that it participates in these processes through partially independent mechanisms. The most likely scenario is that Trpml is important for the degradative process by favoring phagolysosomal fusion and further phagocytic degradation. This is supported by the fact that calcium ions are needed for the fusion of phagosomal and lysosomal membranes. On the other hand, for the migratory process, localized Trpml activation from the lysosomes in the rear of polarized hemocytes, would promote the local activation of non-muscle myosin-II, which is necessary event to trigger cell body translocation during movement. / La fisiología lisosomal ha mostrado ser importante para el correcto funcionamiento de células inmunes, abarcando tanto sus propiedades migratorias como fagocíticas. En este trabajo, se quiso ahondar en el proceso migratorio de células del sistema inmune para comprender el nexo existente entre la dinámica del citoesqueleto y la capacidad degradativa de los lisosomas. En particular, se caracterizó el rol del canal lisosomal permeable a calcio, Trpml, en el proceso de migración celular, al igual que la respuesta inmune y su vínculo con la fisiología lisosomal, usando como modelo de estudio, los macrófagos de Drosophila melanogaster denominados hemocitos. Los hemocitos, son el componente celular de la respuesta inmune de Drosophila, cumpliendo funciones claves durante el desarrollo, así como durante la defensa ante infección por microorganismos o parásitos. Estas células son altamente migratorias in vivo, e importantemente, presentan un sustancial grado de conservación funcional y estructural con las células del sistema inmune innato de mamíferos. Convenientemente, Drosophila posee sólo un gen que codifica para el canal Trpml, cuyo fenotipo mutante semeja al de pacientes con Mucolipidosis tipo IV, quienes presentan pérdida de función del gen homólogo que codifica Trpml en humanos, MCOLN1. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que Trpml cumple un rol fundamental en la degradación fagolisosomal, y la migración de hemocitos in vivo, y que estaría participando en estos dos procesos mediante mecanismos parcialmente independientes. A partir de los resultados obtenidos podemos proponer que Trpml es fundamental para el procesamiento degradativo, mediante el favorecimiento de la fusión fagolisosomal, y consecuente degradación fagocítica. Esto posiblemente se sustenta en la necesidad de iones Ca2+ para la fusión de las membranas del fagosoma con el lisosoma. Por su parte, en el proceso migratorio, la activación localizada de Trpml desde los lisosomas en la región posterior de células polarizadas, promovería la activación de Miosina-II no muscular en esta región, evento necesario para la translocación del cuerpo celular. / Conicyt 21140289, Proyectos Redes 140004, Fondecyt 1140522, Anillo ACT 1401 y Fondap 15090007.

Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T18:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno_TreziaIedaBallerini_D.pdf: 6507064 bytes, checksum: 5515a1ea19ac4cfea55f25a3da2f2efa (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Experimentalmente, Biomphalaria glabrata pode ser utilizada como hospedeiro intermediário do nematódeo Angiostrongylus costaricensis, responsável pela angiostrongilíase abdominal. Esta zoonose, descrita no Brasil principalmente nos estados sulinos, pode acometer acidentalmente o homem, sendo que a infecção ocorre através da ingestão de moluscos parasitados ou água e alimentos contaminados com larvas de 3° estágio, eliminadas no muco dos moluscos hospedeiros. O objetivo deste trabalho foi estudar o desenvolvimento dos estágios larvais e o comportamento dos hemócitos na hemolinfa de B. glabrata infectada.Um total de 168 moluscos foi infectado com 120 larvas LI de A. costaricensis extraídas das fezes de camundongos Swiss albinos previamente infectados via oral sob tubagem esofágica com 6 larvas L3. Larvas de A. costaricensis foram recuperadas de 45 moluscos B. glabrata após 15, 22 e 29 dias de exposição ao parasita, através do método de Baermann, utilizando tecidos digeridos dos moluscos com solução de pepsina e ácido clorídrico. Constatou-se maior recuperação de larvas de A. costaricensis dos moluscos aos 29 dias de infecção. Para o estudo do desenvolvimento de Ao costaricensis, 60 moluscos infectados foram destinados a recuperação larval durante 30 dias consecutivos. Foi observada a mudança larval de LI para L2 aos 13 dias de infecção e L2 para L3 aos 18 dias de infecção. Hemolinfa de 45 moluscos infectados e não infectados com A. costaricensis foi coletada para verificação da resposta hemocitária durante 4 semanas. Os hemócitos foram distinguidos em hialinócitos e granulócitos. Enquanto nos moluscos não infectados predominaram os hialinócitos, naqueles infectados os granulócitos foram mais evidentes, principalmente entre o 18° ao 25° dia de infecção. Foi confirmada a ocorrência tanto da infecção percutânea como por via oral. Os locais mais parasitados foram: região cefalopodal, a preferida pelo nematódeo, seguida do intestino, rim e pulmão. Todas as larvas encontradas estavam viáveis e rodeadas por reação do tipo granulomatosa, independentes de sua localização / Abstract: Biomphalaria glabrata can be experimentally used as an intermediate host of the nematode Angiostrongylus costaricensis, responsible for abdominal angiostrongyliasis. This zoonosis, found in Brazil mainly in the southem states, can accidentally infect man through the ingestion of parasitized mollusks or contaminated water and food containing third-stage larvae, eliminated in the mucous secretion of the mollusks. The objective of this work was to study the development of larval stages and the behavior of hemocytes in the hemolymph of infected B. glabrata. A total of 168 mollusks were infected with 120 LI larvae of A. costaricensis, extracted ftom excrement of albino Swiss mice previously infected via the oral route by esophageal tube with 6 L3 larvae. The A. costaricensis larvae had been recovered from 45 B. glabrata mollusks at 15, 22 and 29 days after exposure to the parasite, by means of the method of Baermann, using molluscan tissues digested with pepsin and hydrochloric acid solution. A larger recovery of A. costaricensis larvae from the mollusk was found at 29 days after infection. For the study of the development of A. costaricensis, 60 infected mollusks were allocated for larval recovery during a period of 30 consecutive days. It was observed that there was a larval stage change, from L1 to L2, at the 13th day after infection and from L2 to L3 on the 18th day after infection.The hemolymph of 45 mollusks, both infected and not infected with A. costaricensis, was collected for verification of the hemocyte response during 4 weeks. The hemocytes were differentiated into hyalinocytes and granulocytes. While in the non infected mollusks the hyalinocytes had predominated, in those infected granulocytes were more evident, mainly between the 18th and the 25th day after infection. The occurence of infection, both via percutaneous and via oral routes, was confirmed. The most parasitized sites were the cephalopodan mass, preferred by the nematodes, folIowed by the intestines, kidneys and lungs. AlI the larvae found were viable and surrounded by reaction of the granulomatous type, independent of their situation / Doutorado / Mestre em Parasitologia

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A esquistossomose à uma doenÃa que no Brasil ainda à um sÃrio problema de saÃde pÃblica. AlteraÃÃes ambientais, comportamentais e imunolÃgicas ocorridas nos seus hospedeiros intermediÃrios podem predizer o sucesso ou nÃo de uma infecÃÃo. As alteraÃÃes ocorridas durante o desenvolvimento de uma infecÃÃo envolvem fatores internos e externos ao molusco. Dentre os internos as alteraÃÃes celulares (hemÃcitos) e humorais (soro) tÃm sido bastante estudadas. Em relaÃÃo aos externos a temperatura foi um dos fatores por nÃs escolhido para se avaliar a sua importÃncia na relaÃÃo molusco-parasito, principalmente porque a quase totalidade dos trabalhos abordando este assunto data da dÃcada de 50. Este trabalho teve como objetivo estudar a resistÃncia ou susceptibilidade de moluscos do gÃnero Biomphalaria frente à infecÃÃo pelo S. mansoni diante de fatores endÃgenos e exÃgenos. HemÃcitos de B. glabrata foram obtidos conforme tÃcnica preconizada e avaliados quanto a sua capacidade fagocitÃria, utilizando a tÃcnica de reduÃÃo do MTT, um sal de formazan, sendo seus valores quantificados por absorbÃncia a 570 nm. Caramujos B. glabrata foram tambÃm infectados nas temperaturas de 15oC, 20oC e 30oC e analisados quanto à eliminaÃÃo de cercarias aos 30 e 60 dias pÃs-infecÃÃo (DPI). Em outro experimento, um grupo de B. tenagophila (CF)- susceptÃvel, recebeu soro de B. tenagophila (Taim) - resistente, sendo posteriormente infectados pelo S. mansoni e observados quanto à alteraÃÃo do nÃvel de resistÃncia. Nossos resultados mostram que o comportamento dos hemÃcitos quanto a sua atividade fagocitÃria apresentou diferenÃa significativa entre os grupos B. glabrata nÃo infectado no seu estado basal comparado com o grupo nÃo infectado e resfriado, como tambÃm os mesmos grupos quando ativados pelo zymozan. Um outro dado obtido mostra que a diminuiÃÃo da temperatura influencia no desenvolvimento da infecÃÃo com diferenÃas significativas (p<0,05) entre 15oC e 30oC. Observamos tambÃm que a transferÃncia de soro conferiu um aumento no nÃmero de caramujos resistentes originalmente susceptÃveis em torno de 50% em comparaÃÃo ao grupo nÃo imunizado (p<0.05). A extrapolaÃÃo destes dados pode levar a um melhor entendimento da esquistossomose sobre o ponto de vista epidemiolÃgico. Os resultados obtidos nos permitem concluir que a atividade fagocitÃria dos hemÃcitos de B. glabrata à influenciada pela temperatura, e que esta influi diretamente na capacidade de infecÃÃo de B. glabrata pelo S. mansoni. Observamos tambÃm que a transferÃncia de soro de B. tenagophila resistente para B. tenagophila susceptÃvel, aumentou a resistÃncia desta Ãltima ao Schistosoma mansoni. / Schistosomiasis is one illnesses that in Brazil still is a serious problem of public health. Ambient, mannering and immunological alterations occured in its intermediate hosts can predict the success or not of one infection. The alterations that occured during the development of an infection involve internal and external factors on the molusc. Among the interns the cellular alterations (hemocytes) and humoral (serum) have been sufficiently studied. In relation to external the temperature was one of the factors chosen for us to evaluate its importance in the relation snail-parasite, mainly because almost the totality of the works approaching this subject dates of the fifty decade. This work had as objective study the resistance and susceptibility of snails of the genus Biomphalaria ahead of the S. Mansoni infection in front of endogenous and exogens factors. Hemocytes of B. glabrata had been gotten according to praised technique and evaluated about its fagocitary capacity, using the technique of reduction of the MTT, being its values quantified for absorbancy 570mm. B. glabrata snailswere also infected in the temperatures of 15oC, 20oC and 30oC and analyzed about the elimination of cercaries to the 30 and 60 days after-infection (DPI). In another experiment, a group of B. tenagophila (CF) - susceptible, received serum from B. tenagophila (Taim) - resistant, being later infected by the S. mansoni and observed about the alteration of the resistance level. Our results show that the behavior of the hemocytes about its fagocitary activity presented significant values between B. glabrata groups not infected in its compared basal state with the not infected and cooled group, as also the same groups when activated by zimozan. Another gotten data shows that the reduction of the temperature influences in the infection development with significant differences (p<0,05) between 15oC and 30oC. We also observe that the serum transference conferred an increase in the number of resistant snails originally susceptible around 50% in comparison to the group not immunized (p<0.05). The extrapolation of these data can take to one better understanding of schistosomiasis on the epidemiologist point of view. The results gotten allow us to conclude that the fagocitary activity of the hemocytes of B. glabrata is influenced by the temperature, as also that the transference of serum of B. tenagophila resistant for B. tenagophila susceptible, increased the resistance of this last one. Finally, we can also affirm that the temperature influences directly in the capacity of infection of B. glabrata by the S. mansoni.