Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica, área de especialización Proteínas Recombinantes, y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La regulación de la expresión génica es un evento crucial para el músculo esquelético, ya que determina la homeostasis y la plasticidad muscular, permitiendo la remodelación y transformación del músculo para adaptarse a distintos estímulos. La actividad eléctrica regula la expresión de diferentes genes del músculo esquelético por medio de un proceso conocido como “Acoplamiento Excitación-Transcripción”. Se ha demostrado recientemente que el ATP extracelular es un mediador esencial entre la estimulación eléctrica, la liberación transitoria de calcio intracelular y la expresión de genes en el músculo esquelético. Considerando que la regulación de la expresión génica esta mediada por la despolarización de la membrana plasmática, la consecuente liberación de ATP y la activación de vías de señalización intracelulares, este trabajo propone la existencia de un complejo multiproteico en la membrana del túbulo-T, que favorecería la adecuada coordinación entre el sensor de voltaje (Receptor de dihidropiridina, DHPR), el canal Panexina-1 (Panx1, liberador de ATP), receptores purinérgicos (P2Y), otras proteínas de membrana como Distrofina y otras moléculas intracelulares involucradas en la transducción de esta señal, como PI3Kγ. Actualmente se sabe que diversos procesos de señalización celular son regulados por complejos multiproteicos, un conjunto de proteínas asociadas para coordinar los distintos pasos en una vía de transducción de señal. Trabajo previo del laboratorio ha demostrado que DHPR interacciona con el canal de Panx1. El objetivo general de esta tesis fue identificar nuevos componentes del complejo multiproteico que regula el Acoplamiento Excitación-Transcripción, en células de músculo esquelético L6 que expresan el canal Panexina-1 recombinante y en preparación de triadas de músculo esquelético de ratón, mediante experimentos de co-inmunoprecipitación, electroforesis bidimensional BlueNative, inmunofluorescencia indirecta y ensayos de ligación por proximidad in situ. Los resultados obtenidos mostraron que el canal Panx1 interactúa con DHPR y P2Y2 en la membrana del túbulo-T. Además, por medio de co-inmunoprecipitación y ensayos de ligación por proximidad, demostramos que las proteínas Distrofina, Caveolina-3 y PI3Kγ también forman parte del complejo multiproteico que regularía el Acoplamiento Excitación- Transcripción, en mioblastos y miotubos de células L6 que sobre-expresan el canal Panx1 recombinante. Los análisis de colocalización realizados en miotubos de células L6-Panx1 mostraron una asociación entre Panx1-DHPR, Panx1-PI3K y Cav-3-Panx1, considerando coeficientes de Manders superiores al 50% de colocalización. Al resolver triadas de ratón usando la técnica de electroforesis bidimensional BlueNative SDS-PAGE, se demostró la presencia de un complejo multiproteico que contiene a las proteínas Panx1, Cav-3 y DHPR. Además, se logró identificar DHPR a partir de complejos aislados mediante la primera dimensión del BlueNative, mediante espectrometría de masas. Este estudio aporta nueva información respecto de cómo se organizan las proteínas relacionadas con la plasticidad muscular, que participan en el al Acoplamiento Excitación- Transcripción en el músculo esquelético. El entendimiento de este fenómeno tiene importantes implicancias en procesos fisiológicos, como la respuesta del músculo frente al ejercicio, y también con procesos patológicos que afectan al músculo esquelético como la sarcopenia y las distrofias musculares. Los resultados obtenidos en esta Tesis permiten abrir nuevas áreas de investigación relacionadas con el estudio de la relación entre el acoplamiento Excitación-Transcripción y la fisiopatología musculoesquelética / Gene expression regulation is a crucial event for skeletal muscle, because determines muscle homeostasis and plasticity that allows muscle remodeling for adapting to environmental demands. Electrical activity regulates the expression of an important number of skeletal muscle genes in a process known as “Excitation-Transcription Coupling”. We have previously demonstrated that extracellular ATP is a relevant mediator between electrical stimulation, intracellular calcium transients and gene expression in skeletal muscle cells. Considering gene expression regulation is mediated by sarcolemma depolarization, ATP release and specific signaling pathways activation, this work propose the assembly of a multiprotein complex in T-tubules, allowing the proper coordination between the voltage sensor (dihydropyridine receptor, DHPR), the pannexin channel (Panx1; ATP release conduit), the P2Y nucleotide receptors, other membrane proteins such as Dystrophin, and several intracellular molecules involved in signal transduction, such as PI3Kγ. It is currently known that several cell signaling processes are mediated by multiprotein complexes, a cluster of proteins associated to achieve coordinated steps in a transduction pathway. Previous work in our laboratory has shown a likely protein-protein interaction between Panx1 and DHPR. The general aim of this thesis was to identify new molecular components of the multiprotein complex associated to Excitation-Transcription Coupling, in L6 skeletal muscle cells which stably express a recombinant Panx1, and in mouse triads preparation. We used co-immunoprecipitation, two-dimension Blue Native electrophoresis, indirect immunofluorescence and proximity ligation in situ assays. Our results showed a well-defined protein-protein interaction between the Panx1 channel, DHPR and P2Y2 receptor. Moreover, co-immunoprecipitation and Proximity ligation assay results, identified the proteins Dystrophin, Caveolin-3 and PI3Kγ as participants of the multiprotein complex involved in Excitation-Transcription coupling, both in myoblasts and myotubes of L6 skeletal muscle cell line, stably expressing recombinant Panx1 protein. The co-localization assays showed a well-defined association between Panx1-DHPR, Panx1- PI3K and Panx1-Cav-3, considering Manders’s coefficients higher than 50%. Triads samples resolution using BlueNative SDS-PAGE electrophoresis, evidenced a multiprotein complex containing DHPR, Panx1 and Cav-3. Furthermore, we identified DHPR by mass spectrometry, by complex isolation from 1D BlueNative gels. This study provides new information about the organization of the proteins related to muscle plasticity, involved in the Excitation-Transcription Coupling in skeletal muscles. The understanding of this process has relevant implications in physiological processes, such as the muscle response to exercise, and in pathological processes like sarcopenia and muscular dystrophies. Results emanated from this Thesis will allow opening new research areas related to clarify the association between Excitation-Transcription coupling and skeletal muscle physiopathology / Fondecyt Regular Nº 1110467; Fondecyt de Iniciación N° 11100454; Proyecto Anillo ACT N° 1111; Beca CONICYT N°22120686

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / El músculo esquelético es un tejido esencial en la mantención de la homeostasis de la glucosa en el organismo. Alteraciones en la respuesta a la hormona insulina en este tejido se relacionan directamente con el desarrollo de resistencia a insulina y diabetes tipo 2. Los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de resistencia a insulina en el músculo esquelético no se conocen con claridad. En este sentido, trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que las alteraciones en la homeostasis del calcio (Ca2+) intracelular disminuyen la respuesta a insulina en el músculo esquelético y cardíaco. HERPUD1 es una proteína ubicada en la membrana del retículo endoplasmático (RE), involucrada en la mantención de la homeostasis del Ca2+ intracelular en condiciones de estrés celular. Se ha descrito que el ratón knockout general para la proteína Herpud1 es intolerante a la glucosa, sin mostrar alteraciones en la secreción de insulina. Dado que el músculo esquelético es principal encargado de la incorporación de glucosa dependiente de insulina en condiciones postprandiales, en esta tesis proponemos que la proteína Herpud1 es necesaria para la adecuada respuesta a insulina en el músculo esquelético. Proponemos además que Herpud1 regula la respuesta a insulina a través de la mantención de la homeostasis del Ca2+ intracelular y su efecto sobre la actividad de la serina-treonina fosfatasa activada por Ca2+ calcineurina. Previamente se ha descrito que esta fosfatasa interactúa con Akt, disminuyendo la señalización de insulina en cardiomiocitos. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que el silenciamiento de la proteína Herpud1 disminuye la captación de glucosa, la translocación del transportador de glucosa GLUT4 hacia la membrana plasmática y la señalización inducida por insulina en la línea celular de músculo esquelético de rata L6 (miotubos). También observamos una disminución en la fosforilación de Akt (Ser- 473) inducida por insulina en el músculo sóleo del ratón knockout general para la proteína Herpud1. El silenciamiento de Herpud1 también se asocia a un aumento en la respuesta de Ca2+ citosólico y a una disminución en la respuesta de Ca2+ mitocondrial dependientes del IP3R en los miotubos L6. Este desbalance en la respuesta de Ca2+ intracelular fue acompañado de un aumento en la actividad de calcineurina. Demostramos además que calcineurina regula la respuesta a insulina en los miotubos L6, y que la inhibición de calcineurina restablece la respuesta a insulina en las células L6 knockdown para Herpud1. Basado en estos resultados, concluimos que la proteína Herpud1 es necesaria para la respuesta a insulina en los miotubos L6 a través de la regulación del eje Ca2+-calcineurina / Skeletal muscle is an essential tissue in the maintenance of glucose homeostasis in the body. Alterations in the response to insulin in skeletal muscle are directly related to the development of insulin resistance and type 2 diabetes. The molecular mechanisms involved in the development of insulin resistance in this tissue are incompletely understood. In this sense, previous works from our laboratory show that alterations in intracellular calcium (Ca⁠2+) homeostasis decreases the insulin response in skeletal and cardiac muscle. Herpud1 is a protein located in the membrane of endoplasmic reticulum (ER), involved in the maintenance of intracellular Ca⁠2+ homeostasis under stress conditions. It has been reported that the general Herpud1 knockout mice display intolerance to a glucose load without showing altered insulin secretion. Given that skeletal muscle is primarily responsible for insulin-dependent glucose incorporation in postprandial conditions, in this thesis we propose that Herpud1 is necessary for the adequate insulin response in this tissue. We also propose that Herpud1 regulates the insulin response through maintenance of intracellular Ca⁠2+ homeostasis and its effect on the activity of the serine-threonine phosphatase activated by Ca⁠2+ calcineurin. Previously it has been described that calcineurin interacts with Akt, decreasing insulin signaling in cardiomyocytes The results obtained in this work show that the silencing of Herpud1 decreases glucose uptake, GLUT4 translocation to plasma membrane and insulin-dependent intracellular signaling in rat derived skeletal muscle cell line L6 (myotubes). We also observed a decrease in insulin-induced Akt (Ser⁠-473) phosphorylation in soleus muscle from general Herpud1-knockout mice. The silencing of Herpud1 is also associated with an increase in the cytosolic Ca⁠2+ response and a decrease in the mitochondrial Ca⁠2+ response induced by IP3R agonist histamine in L6 myotubes. This imbalance in the intracellular Ca⁠2+ response was accompanied by an increase in calcineurin activity. We also show that calcineurin regulates insulin response in L6 myotubes, and that the inhibition of calcineurin restores the insulin response in Herpud1-depleted L6 myotubes. Based on these findings, we conclude that Herpud1 is necessary for the insulin response in L6 myotubes through its role in the regulation of Ca2+-calcineurin axis