Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica, área de especialización Proteínas Recombinantes, y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La regulación de la expresión génica es un evento crucial para el músculo esquelético, ya que determina la homeostasis y la plasticidad muscular, permitiendo la remodelación y transformación del músculo para adaptarse a distintos estímulos. La actividad eléctrica regula la expresión de diferentes genes del músculo esquelético por medio de un proceso conocido como “Acoplamiento Excitación-Transcripción”. Se ha demostrado recientemente que el ATP extracelular es un mediador esencial entre la estimulación eléctrica, la liberación transitoria de calcio intracelular y la expresión de genes en el músculo esquelético. Considerando que la regulación de la expresión génica esta mediada por la despolarización de la membrana plasmática, la consecuente liberación de ATP y la activación de vías de señalización intracelulares, este trabajo propone la existencia de un complejo multiproteico en la membrana del túbulo-T, que favorecería la adecuada coordinación entre el sensor de voltaje (Receptor de dihidropiridina, DHPR), el canal Panexina-1 (Panx1, liberador de ATP), receptores purinérgicos (P2Y), otras proteínas de membrana como Distrofina y otras moléculas intracelulares involucradas en la transducción de esta señal, como PI3Kγ. Actualmente se sabe que diversos procesos de señalización celular son regulados por complejos multiproteicos, un conjunto de proteínas asociadas para coordinar los distintos pasos en una vía de transducción de señal. Trabajo previo del laboratorio ha demostrado que DHPR interacciona con el canal de Panx1. El objetivo general de esta tesis fue identificar nuevos componentes del complejo multiproteico que regula el Acoplamiento Excitación-Transcripción, en células de músculo esquelético L6 que expresan el canal Panexina-1 recombinante y en preparación de triadas de músculo esquelético de ratón, mediante experimentos de co-inmunoprecipitación, electroforesis bidimensional BlueNative, inmunofluorescencia indirecta y ensayos de ligación por proximidad in situ. Los resultados obtenidos mostraron que el canal Panx1 interactúa con DHPR y P2Y2 en la membrana del túbulo-T. Además, por medio de co-inmunoprecipitación y ensayos de ligación por proximidad, demostramos que las proteínas Distrofina, Caveolina-3 y PI3Kγ también forman parte del complejo multiproteico que regularía el Acoplamiento Excitación- Transcripción, en mioblastos y miotubos de células L6 que sobre-expresan el canal Panx1 recombinante. Los análisis de colocalización realizados en miotubos de células L6-Panx1 mostraron una asociación entre Panx1-DHPR, Panx1-PI3K y Cav-3-Panx1, considerando coeficientes de Manders superiores al 50% de colocalización. Al resolver triadas de ratón usando la técnica de electroforesis bidimensional BlueNative SDS-PAGE, se demostró la presencia de un complejo multiproteico que contiene a las proteínas Panx1, Cav-3 y DHPR. Además, se logró identificar DHPR a partir de complejos aislados mediante la primera dimensión del BlueNative, mediante espectrometría de masas. Este estudio aporta nueva información respecto de cómo se organizan las proteínas relacionadas con la plasticidad muscular, que participan en el al Acoplamiento Excitación- Transcripción en el músculo esquelético. El entendimiento de este fenómeno tiene importantes implicancias en procesos fisiológicos, como la respuesta del músculo frente al ejercicio, y también con procesos patológicos que afectan al músculo esquelético como la sarcopenia y las distrofias musculares. Los resultados obtenidos en esta Tesis permiten abrir nuevas áreas de investigación relacionadas con el estudio de la relación entre el acoplamiento Excitación-Transcripción y la fisiopatología musculoesquelética / Gene expression regulation is a crucial event for skeletal muscle, because determines muscle homeostasis and plasticity that allows muscle remodeling for adapting to environmental demands. Electrical activity regulates the expression of an important number of skeletal muscle genes in a process known as “Excitation-Transcription Coupling”. We have previously demonstrated that extracellular ATP is a relevant mediator between electrical stimulation, intracellular calcium transients and gene expression in skeletal muscle cells. Considering gene expression regulation is mediated by sarcolemma depolarization, ATP release and specific signaling pathways activation, this work propose the assembly of a multiprotein complex in T-tubules, allowing the proper coordination between the voltage sensor (dihydropyridine receptor, DHPR), the pannexin channel (Panx1; ATP release conduit), the P2Y nucleotide receptors, other membrane proteins such as Dystrophin, and several intracellular molecules involved in signal transduction, such as PI3Kγ. It is currently known that several cell signaling processes are mediated by multiprotein complexes, a cluster of proteins associated to achieve coordinated steps in a transduction pathway. Previous work in our laboratory has shown a likely protein-protein interaction between Panx1 and DHPR. The general aim of this thesis was to identify new molecular components of the multiprotein complex associated to Excitation-Transcription Coupling, in L6 skeletal muscle cells which stably express a recombinant Panx1, and in mouse triads preparation. We used co-immunoprecipitation, two-dimension Blue Native electrophoresis, indirect immunofluorescence and proximity ligation in situ assays. Our results showed a well-defined protein-protein interaction between the Panx1 channel, DHPR and P2Y2 receptor. Moreover, co-immunoprecipitation and Proximity ligation assay results, identified the proteins Dystrophin, Caveolin-3 and PI3Kγ as participants of the multiprotein complex involved in Excitation-Transcription coupling, both in myoblasts and myotubes of L6 skeletal muscle cell line, stably expressing recombinant Panx1 protein. The co-localization assays showed a well-defined association between Panx1-DHPR, Panx1- PI3K and Panx1-Cav-3, considering Manders’s coefficients higher than 50%. Triads samples resolution using BlueNative SDS-PAGE electrophoresis, evidenced a multiprotein complex containing DHPR, Panx1 and Cav-3. Furthermore, we identified DHPR by mass spectrometry, by complex isolation from 1D BlueNative gels. This study provides new information about the organization of the proteins related to muscle plasticity, involved in the Excitation-Transcription Coupling in skeletal muscles. The understanding of this process has relevant implications in physiological processes, such as the muscle response to exercise, and in pathological processes like sarcopenia and muscular dystrophies. Results emanated from this Thesis will allow opening new research areas related to clarify the association between Excitation-Transcription coupling and skeletal muscle physiopathology / Fondecyt Regular Nº 1110467; Fondecyt de Iniciación N° 11100454; Proyecto Anillo ACT N° 1111; Beca CONICYT N°22120686

Tesis para optar al Grado de Doctor en Bioquímica / El denominado divisoma bacteriano es un complejo multiproteíco que consta de, al menos, 12 proteínas esenciales, las cuales se reclutan de forma secuencial e interdependiente para llevar a cabo el proceso de segregación de los cromosomas, citoquinesis y separación de las células hijas. La temporalidad y secuencialidad en la formación del divisoma se ha estudiado extensamente y se ha descrito que ocurre en dos etapas. Primero ocurre la polimerización de FtsZ para formar el anillo Z, el que se estabiliza y ancla a la membrana mediante FtsA y ZipA, esta es la fase temprana y da origen al proto anillo. La fase tardía consiste en el reclutamiento del resto de las proteínas (FtsEX > FtsK > FtsQLB > FtsW > FtsI > FtsN) por el proto anillo, el cual actúa como andamio de toda la maquinaria. Una vez que este complejo multi proteico esta ensamblado, comienza el proceso de división bacteriana. Para comprender a cabalidad este complejo, es necesario conocer las interacciones existentes entre sus componentes. Al recopilar la información publicada sobre estas interacciones, nos damos cuenta que su descripción ha sido, principalmente, de forma cualitativa mediante técnicas genéticas y algunas bioquímicas, sin embargo, la información sobre las afinidades y cooperatividad de las interacciones en el proceso de ensamblaje del divisoma es casi inexistente. La escasa información que existe se explica por la dificultad en la purificación de los componentes del divisoma. En este trabajo se caracterizaron, de forma cuantitativa, las interacciones presentes en una sub red del divisoma, específicamente en la red de interacciones de FtsEX. Según los datos publicados hasta la fecha, FtsEX interactúa con FtsZ, FtsA, FtsQ y EnvC, además se sabe que la unión y hidrólisis de ATP de FtsE es esencial para la división bacteriana. Se eligió FtsEX pues es un punto clave en el ensamblaje del divisoma, al ser la primera proteína en ser reclutada que actúa como un conector entre el citoplasma y el periplasma. Para efectuar esta caracterización mediante técnicas biofísicas se hizo necesario establecer protocolos de purificación y caracterización de las proteínas a ser estudiadas, para luego estudiar las interacciones. La purificación de FtsE se realizó en condiciones desnaturantes, pues el 100 % de esta aparece como cuerpos de inclusión. Distintas metodologías para obtener FtsE soluble se probaron sin éxito, por lo que se continúo trabajando en condiciones desnaturantes. El replegamiento de FtsE se estudió mediante dilución rápida y diálisis al equilibrio en distintas condiciones de pH, fuerza iónica, aditivos, etc. La única condición donde se obtuvo FtsE soluble fue en amortiguador acetato 50 mM pH 5. El replegamiento se siguió por dicroísmo circular, fluorescencia y dispersión de luz y todo indicó que FtsE adquirió estructura terciaria. Para corroborar la funcionalidad de FtsE, se estudió su interacción con ATP y ADP mediante termoforesis en micro escala. Se obtuvo isotermas de unión con ambos nucleótidos con constantes de disociación de 579 y 1394 μM, respectivamente. También se estudió la interacción de FtsE y FtsZ, la cual está descrita por co-purificación. Esta interacción se ajustó mejor a la ecuación de Hill con una constante de disociación de 9,1 μM y un coeficiente de Hill de 2,2. Estos resultados indican que FtsE ha adquirido, al menos, cierto grado de estructura que le permite interactuar con el resto de los componentes del divisoma. Se intentó una serie de estrategias para la sobreexpresión y purificación de FtsX obteniéndose resultados promisorios. La optimización de la sobreexpresión mediante el clonamiento de FtsE río arriba de FtsX y la sobreexpresión por el método de autoinducción disminuyó la toxicidad de FtsX. La solubilización de FtsX se logró con los detergentes CHAPS, colato y DDM. En la purificación en presencia del detergente DDM, se obtuvo una alta pureza, con un único contaminante. Finalmente se caracterizó la interacción entre el dominio periplasmático de FtsX (Xloop) con EnvC (Regulador de amidasas de la división celular), FtsQ y con ella misma. Estos resultados indican que EnvC interactúa con el monómero de Xloop y con el dímero de Xloop, con afinidades altas, Kd de 106 y 328 nM respectivamente. Además Xloop interactúa con FtsQ con una afinidad menor, Kd de 4 μM. Finalmente, los resultados obtenidos en este trabajo asocian FtsEX en la regulación de las amidasas involucradas en la remodelación del peptidoglicano en la división celular, mediante un secuestro de EnvC a la zona del septo. La alta afinidad observada en la interacción Xloop – ccEnvC sugiere que es un complejo estable, probablemente, se forme el complejo FtsEX/EnvC previo a la formación del divisoma. FtsE se reclutaría mediante la interacción con FtsZ y además estabilizaría el anillo Z. Por otro lado, la interacción de Xloop con FtsQ es de menor afinidad con respecto a su interacción con EnvC sugiriendo una interacción menos estable por esta última. Sin embargo, cabe destacar que las concentraciones locales, en el proceso de divisón celular, pueden variar considerablemente ya que la mayoría de las Fts’s son reclutadas al mismo sitio, aumentando su concentración local. Este podría ser un sistema de control que utilizaría FtsEX para regular a las amidasas, mediante la intearcción con otros componentes del divisoma, como podría ser el caso de FtsQ / The so-called bacterial divisome is a multiprotein complex consisting of at least 12 essential proteins, which are recruited sequentially and interdependent to carry out the process of chromosome segregation, cytokinesis and separation of the daughter cells. The timing and sequencing in the formation of divisome has been studied extensively and has been reported to occur in two stages. First occurs FtsZ polymerization to form the Z ring, which is stabilized and membrane anchor through ZipA and FtsA, this is the early stage and gives rise to the proto ring. The late stage involves the recruiting of other proteins (FtsEX> FtsK> FtsQLB> FtsW> FtsI> FtsN) to the proto ring, which acts as a scaffold of all machinery. Once this multi-protein complex is assembled, it begins the process of bacterial division. To fully understand this complex, it is necessary to know the interactions between its components. In compiling the information published on these interactions, we realize that the description has been mainly qualitatively by genetic and biochemical techniques. However, information on the affinities and cooperativity of interactions in the assembly process are almost nonexistent. This lack of information is explained by the difficulty in purifying divisome components. In this work, the interactions from a sub network of the divisome assembly were characterized quantitatively, specifically on the network centered on FtsEX. According to data published to date, FtsEX interacts with FtsZ, FtsA, FtsQ and EnvC, it is also known that the binding and hydrolysis of ATP by FtsE is essential for bacterial division. FtsEX was chosen because it is a key point in the assembly of the divisome, being the first protein to be recruited, and it can acts as a connector between the cytoplasm and the periplasm. To perform this characterization by biophysical techniques, it became necessary to establish purification protocols for this proteins, and then study the interactions. Purification of FtsE was performed on denatured conditions, as 100% of this protein is expressed as inclusion bodies. Different methodologies for FtsE expression as soluble were tested without success, so work continued on denatured conditions. FtsE refolding was studied by rapid dilution and equilibrium dialysis under different conditions of pH, ionic strength, additives, etc. The only condition, where soluble FtsE was obtained, was 50 mM acetate buffer pH 5. Refolding was monitored by circular dichroism, fluorescence and light scattering, proven that FtsE did acquire tertiary structure. To corroborate the functionality of FtsE, it interactions with ATP and ADP was measured by MicroScale Thermophoresis. Binding isotherms were obtained with both nucleotides with dissociation constants of 579 and 1394 uM, respectively. The interaction of FtsE and FtsZ, which was previously described by co-purification, was also studied. This interaction was best fitted to the Hill equation with a dissociation constant of 9.1 uM and a Hill coefficient of 2.2. These results indicate that FtsE did acquire tertiary structure that lets it interact with the other components of divisome. A number of strategies for overexpression and purification of FtsX were attempted, yielding promising results. Cloning FtsE upstream of FtsX and overexpression by the method of auto-induction diminished FtsX toxicity. FtsX solubilization was achieved with the detergents CHAPS, cholate and DDM. Purification in the presence of detergent DDM gave the best result with a single contaminant protein. Finally the interaction between the periplasmic domain of FtsX (Xloop) with EnvC (regulator of cell division amidases), FtsQ and with itself was studied. These results indicate that EnvC interacts with Xloop monomer and dimer, with high affinities, Kd 106 nM and 328 nM respectively. Furthermore, Xloop interacts with FtsQ with lower affinity, Kd 4 uM. Finally, the results obtained in this work showed that FtsEX recruits and regulates the amidases involved in the remodeling of peptidoglycan in cell division, by a sequestration EnvC to the area of the septum. The high affinity interaction observed between Xloop - ccEnvC suggests that a stable complex FtsEX / EnvC is formed prior to the recruitment of the divisome. FtsE is recruited by interacting with FtsZ and also stabilize the ring Z. It was also showed that Xloop interacts with FtsQ with lower affinity with respect to it interaction with EnvC suggesting a less stable complex. However, it is noteworthy that the local concentration of the proteins from the divisome can vary considerably, since most Fts's are recruited to the same site, increasing their local concentration. This could be a control system on how FtsEX regulate amidases activities, increasing the concentration of FtsQ to compete for the Xloop which will release EnvC to activate the amidases / Conicyt; Fondecyt