Tesis para optar al Grado de Doctor en Bioquímica / El denominado divisoma bacteriano es un complejo multiproteíco que consta de, al menos, 12 proteínas esenciales, las cuales se reclutan de forma secuencial e interdependiente para llevar a cabo el proceso de segregación de los cromosomas, citoquinesis y separación de las células hijas. La temporalidad y secuencialidad en la formación del divisoma se ha estudiado extensamente y se ha descrito que ocurre en dos etapas. Primero ocurre la polimerización de FtsZ para formar el anillo Z, el que se estabiliza y ancla a la membrana mediante FtsA y ZipA, esta es la fase temprana y da origen al proto anillo. La fase tardía consiste en el reclutamiento del resto de las proteínas (FtsEX > FtsK > FtsQLB > FtsW > FtsI > FtsN) por el proto anillo, el cual actúa como andamio de toda la maquinaria. Una vez que este complejo multi proteico esta ensamblado, comienza el proceso de división bacteriana. Para comprender a cabalidad este complejo, es necesario conocer las interacciones existentes entre sus componentes. Al recopilar la información publicada sobre estas interacciones, nos damos cuenta que su descripción ha sido, principalmente, de forma cualitativa mediante técnicas genéticas y algunas bioquímicas, sin embargo, la información sobre las afinidades y cooperatividad de las interacciones en el proceso de ensamblaje del divisoma es casi inexistente. La escasa información que existe se explica por la dificultad en la purificación de los componentes del divisoma. En este trabajo se caracterizaron, de forma cuantitativa, las interacciones presentes en una sub red del divisoma, específicamente en la red de interacciones de FtsEX. Según los datos publicados hasta la fecha, FtsEX interactúa con FtsZ, FtsA, FtsQ y EnvC, además se sabe que la unión y hidrólisis de ATP de FtsE es esencial para la división bacteriana. Se eligió FtsEX pues es un punto clave en el ensamblaje del divisoma, al ser la primera proteína en ser reclutada que actúa como un conector entre el citoplasma y el periplasma. Para efectuar esta caracterización mediante técnicas biofísicas se hizo necesario establecer protocolos de purificación y caracterización de las proteínas a ser estudiadas, para luego estudiar las interacciones. La purificación de FtsE se realizó en condiciones desnaturantes, pues el 100 % de esta aparece como cuerpos de inclusión. Distintas metodologías para obtener FtsE soluble se probaron sin éxito, por lo que se continúo trabajando en condiciones desnaturantes. El replegamiento de FtsE se estudió mediante dilución rápida y diálisis al equilibrio en distintas condiciones de pH, fuerza iónica, aditivos, etc. La única condición donde se obtuvo FtsE soluble fue en amortiguador acetato 50 mM pH 5. El replegamiento se siguió por dicroísmo circular, fluorescencia y dispersión de luz y todo indicó que FtsE adquirió estructura terciaria. Para corroborar la funcionalidad de FtsE, se estudió su interacción con ATP y ADP mediante termoforesis en micro escala. Se obtuvo isotermas de unión con ambos nucleótidos con constantes de disociación de 579 y 1394 μM, respectivamente. También se estudió la interacción de FtsE y FtsZ, la cual está descrita por co-purificación. Esta interacción se ajustó mejor a la ecuación de Hill con una constante de disociación de 9,1 μM y un coeficiente de Hill de 2,2. Estos resultados indican que FtsE ha adquirido, al menos, cierto grado de estructura que le permite interactuar con el resto de los componentes del divisoma. Se intentó una serie de estrategias para la sobreexpresión y purificación de FtsX obteniéndose resultados promisorios. La optimización de la sobreexpresión mediante el clonamiento de FtsE río arriba de FtsX y la sobreexpresión por el método de autoinducción disminuyó la toxicidad de FtsX. La solubilización de FtsX se logró con los detergentes CHAPS, colato y DDM. En la purificación en presencia del detergente DDM, se obtuvo una alta pureza, con un único contaminante. Finalmente se caracterizó la interacción entre el dominio periplasmático de FtsX (Xloop) con EnvC (Regulador de amidasas de la división celular), FtsQ y con ella misma. Estos resultados indican que EnvC interactúa con el monómero de Xloop y con el dímero de Xloop, con afinidades altas, Kd de 106 y 328 nM respectivamente. Además Xloop interactúa con FtsQ con una afinidad menor, Kd de 4 μM. Finalmente, los resultados obtenidos en este trabajo asocian FtsEX en la regulación de las amidasas involucradas en la remodelación del peptidoglicano en la división celular, mediante un secuestro de EnvC a la zona del septo. La alta afinidad observada en la interacción Xloop – ccEnvC sugiere que es un complejo estable, probablemente, se forme el complejo FtsEX/EnvC previo a la formación del divisoma. FtsE se reclutaría mediante la interacción con FtsZ y además estabilizaría el anillo Z. Por otro lado, la interacción de Xloop con FtsQ es de menor afinidad con respecto a su interacción con EnvC sugiriendo una interacción menos estable por esta última. Sin embargo, cabe destacar que las concentraciones locales, en el proceso de divisón celular, pueden variar considerablemente ya que la mayoría de las Fts’s son reclutadas al mismo sitio, aumentando su concentración local. Este podría ser un sistema de control que utilizaría FtsEX para regular a las amidasas, mediante la intearcción con otros componentes del divisoma, como podría ser el caso de FtsQ / The so-called bacterial divisome is a multiprotein complex consisting of at least 12 essential proteins, which are recruited sequentially and interdependent to carry out the process of chromosome segregation, cytokinesis and separation of the daughter cells. The timing and sequencing in the formation of divisome has been studied extensively and has been reported to occur in two stages. First occurs FtsZ polymerization to form the Z ring, which is stabilized and membrane anchor through ZipA and FtsA, this is the early stage and gives rise to the proto ring. The late stage involves the recruiting of other proteins (FtsEX> FtsK> FtsQLB> FtsW> FtsI> FtsN) to the proto ring, which acts as a scaffold of all machinery. Once this multi-protein complex is assembled, it begins the process of bacterial division. To fully understand this complex, it is necessary to know the interactions between its components. In compiling the information published on these interactions, we realize that the description has been mainly qualitatively by genetic and biochemical techniques. However, information on the affinities and cooperativity of interactions in the assembly process are almost nonexistent. This lack of information is explained by the difficulty in purifying divisome components. In this work, the interactions from a sub network of the divisome assembly were characterized quantitatively, specifically on the network centered on FtsEX. According to data published to date, FtsEX interacts with FtsZ, FtsA, FtsQ and EnvC, it is also known that the binding and hydrolysis of ATP by FtsE is essential for bacterial division. FtsEX was chosen because it is a key point in the assembly of the divisome, being the first protein to be recruited, and it can acts as a connector between the cytoplasm and the periplasm. To perform this characterization by biophysical techniques, it became necessary to establish purification protocols for this proteins, and then study the interactions. Purification of FtsE was performed on denatured conditions, as 100% of this protein is expressed as inclusion bodies. Different methodologies for FtsE expression as soluble were tested without success, so work continued on denatured conditions. FtsE refolding was studied by rapid dilution and equilibrium dialysis under different conditions of pH, ionic strength, additives, etc. The only condition, where soluble FtsE was obtained, was 50 mM acetate buffer pH 5. Refolding was monitored by circular dichroism, fluorescence and light scattering, proven that FtsE did acquire tertiary structure. To corroborate the functionality of FtsE, it interactions with ATP and ADP was measured by MicroScale Thermophoresis. Binding isotherms were obtained with both nucleotides with dissociation constants of 579 and 1394 uM, respectively. The interaction of FtsE and FtsZ, which was previously described by co-purification, was also studied. This interaction was best fitted to the Hill equation with a dissociation constant of 9.1 uM and a Hill coefficient of 2.2. These results indicate that FtsE did acquire tertiary structure that lets it interact with the other components of divisome. A number of strategies for overexpression and purification of FtsX were attempted, yielding promising results. Cloning FtsE upstream of FtsX and overexpression by the method of auto-induction diminished FtsX toxicity. FtsX solubilization was achieved with the detergents CHAPS, cholate and DDM. Purification in the presence of detergent DDM gave the best result with a single contaminant protein. Finally the interaction between the periplasmic domain of FtsX (Xloop) with EnvC (regulator of cell division amidases), FtsQ and with itself was studied. These results indicate that EnvC interacts with Xloop monomer and dimer, with high affinities, Kd 106 nM and 328 nM respectively. Furthermore, Xloop interacts with FtsQ with lower affinity, Kd 4 uM. Finally, the results obtained in this work showed that FtsEX recruits and regulates the amidases involved in the remodeling of peptidoglycan in cell division, by a sequestration EnvC to the area of the septum. The high affinity interaction observed between Xloop - ccEnvC suggests that a stable complex FtsEX / EnvC is formed prior to the recruitment of the divisome. FtsE is recruited by interacting with FtsZ and also stabilize the ring Z. It was also showed that Xloop interacts with FtsQ with lower affinity with respect to it interaction with EnvC suggesting a less stable complex. However, it is noteworthy that the local concentration of the proteins from the divisome can vary considerably, since most Fts's are recruited to the same site, increasing their local concentration. This could be a control system on how FtsEX regulate amidases activities, increasing the concentration of FtsQ to compete for the Xloop which will release EnvC to activate the amidases / Conicyt; Fondecyt

O mecanismo de divisão mais comum entre procariotos é a divisão binária, na qual a célula- mãe reparte seu genoma e conteúdo citoplasmático de forma igual entre duas células filhas. Esse processo é mediado por um complexo protéico especializado, chamado divisoma, composto por cerca de 20 proteínas, que promovem a constrição da parede celular e membrana citoplasmática, formando o septo de divisão. O complexo é organizado em torno do anel Z, uma estrutura em anel composta pela proteína FtsZ, um homólogo de tubulina presente na maioria dos procariotos e em algumas organelas de eucariotos. Partindo de um levantamento detalhado da distribuição dos genes do divisoma em genomas completos de procariotos, aplicamos métodos de máxima verossimilhança para inferência de estados ancestrais e reconstruímos o conteúdo gênico do divisoma no ultimo ancestral comum das bactérias atuais. Estendendo essas análises com a aplicação de métodos filogenéticos, inferimos os eventos responsáveis pelas variações de composição deste complexo, observadas entre os diferentes grupos de bactérias. Nossos resultados mostram que o último ancestral comum de todas as bactérias já possuía a maior parte dos componentes conhecidos do divisoma, sugerindo a existência de uma parede de peptideoglicano e a presença de um aparato molecular tão ou mais complexo que o observado nas linhagens atuais, incluindo a presença de componentes considerados acessórios e de distribuição relativamente restrita, como as proteínas envolvidas na localização do anel Z (sistema Min) e alguns efetores positivos da polimerização de FtsZ. Observamos também que a evolução do complexo não foi muito afetada por eventos de transferência lateral, mas apresenta vários exemplos de perda de genes, em especial em linhagens com genoma reduzido, o que sugere a redundância de vários componentes já presentes no ancestral e a freqüente redução da complexidade, pelo menos dos componentes centrais do divisoma. Episódios de expansão de famílias de componentes do divisoma em linhagens específicas e os mecanismos evolutivos responsáveis pela incorporação de tais variações são discutidos. A caracterização da história evolutiva detalhada do divisoma, aqui apresentada, poderá servir como ponto de partida para novas análises evolutivas e como base para elaboração de experimentos funcionais. / The most common cell division mechanism among prokaryotes is binary fission, where a mother cell partitions its cytoplasm and genome equally among two daughter cells. This process is mediated by a specialized protein complex, known as the divisome, composed of around 20 proteíns, that promotes constriction of the cell wall and cytoplasmic membrane, thus forming the division septa. The complex is organized around the Z-ring, a ring-shaped struture composed by FtsZ, a tubulin homolog present in most prokaryotes and some eukaryotic organelles. After a detailed revision of the distribution of divisome genes among completely sequenced prokaryotic genomes, we applied maximum likelihood methods for the inference of ancestral states and reconstructed the gene content of the divisome in the last common ancestor of all extant bacteria. We then performed phylogeneticanalysis of all cell division genes and inferred the series of events responsible for the observed variations of the complex´s composition among bactérial lineages and their common ancestor. Our results show that the last common ancestor of all bacteria already possessed most of the known divisome components, thus suggesting the existence of a peptidoglycan cell wall and the presence of a molecular apparatus, perhaps more complex than those found in extant bacteria, including the presence of some accessory components with a somewhat restricted distribution, like the proteíns involved in the localization of the Z-ring (Min sistem) and some positive effectors os FtsZ polimerization. We also observed that the complex´s evolution was almost never the subject of horizontasl gene transfer events, but shows several examples of gene loss, specially in lineages displaying clear signs of genome reduction, thus suggesting the redundancy of several components in the ancestral divisome and a certain degree complexity reduction, at least for core components of the divisome. Lineage specific expansion of divisome component and the evolutionary mechanisms behind such processes are discussed. This characterization of the detailed evolutionary history of the divisome might serve as a starting point for new evolutionary analysis and as a basis for the design of functional experiments.

O mecanismo de divisão mais comum entre procariotos é a divisão binária, na qual a célula- mãe reparte seu genoma e conteúdo citoplasmático de forma igual entre duas células filhas. Esse processo é mediado por um complexo protéico especializado, chamado divisoma, composto por cerca de 20 proteínas, que promovem a constrição da parede celular e membrana citoplasmática, formando o septo de divisão. O complexo é organizado em torno do anel Z, uma estrutura em anel composta pela proteína FtsZ, um homólogo de tubulina presente na maioria dos procariotos e em algumas organelas de eucariotos. Partindo de um levantamento detalhado da distribuição dos genes do divisoma em genomas completos de procariotos, aplicamos métodos de máxima verossimilhança para inferência de estados ancestrais e reconstruímos o conteúdo gênico do divisoma no ultimo ancestral comum das bactérias atuais. Estendendo essas análises com a aplicação de métodos filogenéticos, inferimos os eventos responsáveis pelas variações de composição deste complexo, observadas entre os diferentes grupos de bactérias. Nossos resultados mostram que o último ancestral comum de todas as bactérias já possuía a maior parte dos componentes conhecidos do divisoma, sugerindo a existência de uma parede de peptideoglicano e a presença de um aparato molecular tão ou mais complexo que o observado nas linhagens atuais, incluindo a presença de componentes considerados acessórios e de distribuição relativamente restrita, como as proteínas envolvidas na localização do anel Z (sistema Min) e alguns efetores positivos da polimerização de FtsZ. Observamos também que a evolução do complexo não foi muito afetada por eventos de transferência lateral, mas apresenta vários exemplos de perda de genes, em especial em linhagens com genoma reduzido, o que sugere a redundância de vários componentes já presentes no ancestral e a freqüente redução da complexidade, pelo menos dos componentes centrais do divisoma. Episódios de expansão de famílias de componentes do divisoma em linhagens específicas e os mecanismos evolutivos responsáveis pela incorporação de tais variações são discutidos. A caracterização da história evolutiva detalhada do divisoma, aqui apresentada, poderá servir como ponto de partida para novas análises evolutivas e como base para elaboração de experimentos funcionais. / The most common cell division mechanism among prokaryotes is binary fission, where a mother cell partitions its cytoplasm and genome equally among two daughter cells. This process is mediated by a specialized protein complex, known as the divisome, composed of around 20 proteíns, that promotes constriction of the cell wall and cytoplasmic membrane, thus forming the division septa. The complex is organized around the Z-ring, a ring-shaped struture composed by FtsZ, a tubulin homolog present in most prokaryotes and some eukaryotic organelles. After a detailed revision of the distribution of divisome genes among completely sequenced prokaryotic genomes, we applied maximum likelihood methods for the inference of ancestral states and reconstructed the gene content of the divisome in the last common ancestor of all extant bacteria. We then performed phylogeneticanalysis of all cell division genes and inferred the series of events responsible for the observed variations of the complex´s composition among bactérial lineages and their common ancestor. Our results show that the last common ancestor of all bacteria already possessed most of the known divisome components, thus suggesting the existence of a peptidoglycan cell wall and the presence of a molecular apparatus, perhaps more complex than those found in extant bacteria, including the presence of some accessory components with a somewhat restricted distribution, like the proteíns involved in the localization of the Z-ring (Min sistem) and some positive effectors os FtsZ polimerization. We also observed that the complex´s evolution was almost never the subject of horizontasl gene transfer events, but shows several examples of gene loss, specially in lineages displaying clear signs of genome reduction, thus suggesting the redundancy of several components in the ancestral divisome and a certain degree complexity reduction, at least for core components of the divisome. Lineage specific expansion of divisome component and the evolutionary mechanisms behind such processes are discussed. This characterization of the detailed evolutionary history of the divisome might serve as a starting point for new evolutionary analysis and as a basis for the design of functional experiments.