Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Las arañas del género Loxosceles son un grupo numeroso de especies repartidas por todo el mundo, encontrándose en Chile únicamente la Loxosceles laeta. Se conocen popularmente como arañas de rincón, viven exclusivamente junto al hombre y lo muerden solo si se ven amenazadas. La mordedura de la araña provoca en el hombre una condición clínica denominada loxoscelismo, que puede ser de compromiso cutáneo con necrosis de la piel afectada (loxoscelismo cutáneo) o de compromiso sistémico con hemólisis generalizada, pudiendo provocar la muerte por falla renal severa (loxoscelismo viscerocutáneo). El veneno está compuesto por toxinas proteicas de bajo peso molecular, siendo solo una de ellas, la esfingomielinasa D (SMD) o fosfolipasa D, capaz de emular los efectos nocivos del veneno completo. Los tratamientos para el loxoscelismo se basan en medidas de sostén y pese a que existe un antisuero equino disponible en el país, no se usa debido al riesgo de provocar reacción anafiláctica y a su eficacia no comprobada. Tal como los anticuerpos, los aptámeros son moléculas de RNA o DNA capaces de unirse fuerte y específicamente a su molécula blanco. Los aptámeros capaces de bloquear la SMD se presentan como una alternativa segura y eficaz para tratar el loxoscelismo: no son inmunogénicos, son muy específicos, económicos y fáciles de obtener a través de la selección iterativa (SELEX) de un universo de moléculas de RNA o DNA de secuencia aleatoria. En este trabajo se sintetizó de novo el cDNA de la SMD isoforma Ll1 de la Loxosceles laeta mediante polimerización por PCR de oligonucleótidos que se sobrelapan, se clonó en un vector bacteriano de expresión y se generó la proteína recombinante (34,1 kDa) en Escherichia coli. Con la proteína purificada se realizaron dos procesos de selección iterativa por afinidad partiendo de 3,6x1013 moléculas de RNA de 107 nucleótidos siendo los 60 centrales aleatorios. Los procesos, de 10 y 12 ciclos, se efectuaron a relaciones molares de proteína:RNA de 1:5 y 1:10, respectivamente, obteniendo conjuntos de RNAs con hasta ~40% (ciclo 10, 1:5) y ~25% (ciclo 8, 1:10) de capacidad inhibitoria de la actividad esfingomielinásica. Este trabajo es el primer acercamiento a la obtención de aptámeros individuales que constituyan la base molecular de un medicamento biotecnológico de RNA y de un método diagnóstico para el envenenamiento por Loxosceles laeta, araña endémica del país y el animal ponzoñoso de mayor importancia clínica en Chile. / Spiders of the genus Loxosceles are a large group of species spread worldwide, Loxosceles laeta being the only species found in Chile. It is commonly known as brown spider, it lives exclusively with man and only bites when threatened. The spider bite causes a clinical condition called loxoscelism characterized by cutaneous necrosis of the affected site (cutaneous loxoscelism) or systemic involvement with hemolysis, that can cause death due to severe kidney failure (viscerocutaneous loxoscelism). The venom toxins are low molecular weight proteins, only one of which is capable of emulating the harmful effects of whole venom: sphingomyelinase D (SMD) or phospholipase D. Treatment for loxoscelism is based solely on supportive measures. Although an equine antiserum is available in Chile it is not used because of the risk of anaphylactic reactions and unproven efficacy. Similarly to antibodies, aptamers are RNA or DNA molecules capable of binding strongly and specifically to their target. Thus, aptamers which bind to SMD and block it may provide a safe and effective alternative for treating loxoscelism: they are not immunogenic, are highly specific, economic and easy to obtain through iterative selection (SELEX) from a universe of RNA or DNA molecules of random sequence. In this work the cDNA of the LI1 isoform of Loxosceles laeta sphingomyelinase D was synthesized de novo by PCR polymerization of overlapping oligonucleotides, cloned in a bacterial expression vector, and used to generate the recombinant protein (34.1 kDa) in Escherichia coli. Two iterative selection processes were performed with the purified protein, selecting aptamers by affinity for SMD-Ll1 from a pool of 3.6x1013 RNA molecules of 107 nucleotides having a core of 60 nucleotides of random sequence. Each selection process was performed with a protein to RNA ratio of either 1:5 (10 cycles) or 1:10 (12 cycles). The ability of these RNA pools to inhibit SMD-Ll1 sphingomyelinase activity reached ~40% (cycle 10, 1:5) and ~25% (cycle 8, 1:10). This work is the first biotechnological approach to obtain RNA aptamers with therapeutic and diagnostic potential for loxoscelism, disease caused by the poisonous animal having the greatest medical relevance in Chile / Fondecyt 1100209

Os venenos de aranhas do gênero Loxosceles possuem uma ampla gama de atividades em diferentes células, tecidos e sistemas, e é notória a sua capacidade de causar a formação da lesão dermonecrótica. Em um trabalho prévio, relatamos uma intensa trombocitopenia induzida pelo veneno loxoscélico em coelhos. Objetivou-se no presente estudo avaliar primeiramente a interação in vitro entre as plaquetas, humanas e de coelhos, com o veneno de Loxosceles gaucho e seu principal componente, a fração esfingomielinásica. Posteriormente, investigou-se o papel da plaqueta no desenvolvimento da lesão dermonecrótica através de um modelo de trombocitopenia em coelhos. Nos estudos in vitro, os resultados de agregação em plasma rico em plaquetas evidenciou que tanto o veneno total quanto a fração esfingomielinásica induziram um aumento desta resposta nas plaquetas das duas espécies, que foi mais intensa nas plaquetas humanas. Uma vez que em plaquetas lavadas a agregação não foi constatada, confirmou-se a necessidade de componente(s) plasmático(s) para a indução desta resposta. Ainda, os dados de LDH indicaram que o veneno total, nas concentrações aqui utilizadas, não foi capaz de causar à lise plaquetária. Com relação à ativação, o veneno total, foi capaz de aumentar a expressão da LIBS1 nas plaquetas de ambas as espécies e de P-selectina na plaqueta de coelho. Sob as nossas condições experimentais, a fração não promoveu o aumento dos marcadores de ativação. Finalizando os estudos in vitro, o veneno total e a fração provocaram um aumento da adesão nas plaquetas das duas espécies, sendo que a resposta à fração esfingomielinásica mostrou-se dose-dependente. O estudo experimental, por vez, necessitou de uma etapa preliminar para a obtenção de um anticorpo anti-plaqueta, produzido em cabras, que mostrou-se eficaz em induzir um intenso quadro trombocitopênico em coelhos. Análises histopatológicas indicam que a ausência das plaquetas não diminuiu a formação de trombos intravasculares na área da derme sob a ação do veneno. O desenvolvimento da lesão dermonecrótica em coelhos injetados com o veneno loxoscélico mostrou-se mais intenso naqueles depletados de plaquetas do que nos animais com número normal de plaquetas, constatável pelo desenvolvimento de maiores áreas de equimose e das escaras necróticas. Os resultados semelhantes dos níveis plasmáticos do fator de von Willembrand, dos tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativada, assim como dos testes de fagocitose por polimorfonucleares isolados do sangue periférico, entre os coelhos trombocitopênicos e aqueles com contagem normal de plaquetas, evidenciam que não houve alterações expressivas nas células endoteliais, no sistema da coagulação e na capacidade fagocítica via C3b dos polimorfonucleares do sangue periférico. Os presentes resultados mostram que o veneno loxoscélico in vitro é capaz de elicitar em plaquetas humanas e de coelhos as respostas de agregação, de adesão e de ativação. Por fim, as diferenças no desenvolvimento da lesão, constatadas entre o animal trombocitopênico e o animal normal, evidenciam que a plaqueta é um fator importante para controlar a expansão e a gravidade da lesão dermonecrótica induiza em coelhos pelo veneno loxoscélico. / Venoms from Loxosceles spiders exhibit a wide range of activities on different cells, tissues and systems, being specially evident their ability to cause a dermonecrotic lesion. In a previous paper, we showed that Loxosceles gaucho spider venom induces intense thrombocytopenia in rabbits. Thus, in the present study, we firstly aimed to evaluate the in vitro interaction between human and rabbits platelets and L. gaucho venom and its major component, the sphingomyelinase fraction. Secondly, we investigated the platelet role in the dermonecrotic lesion formation using an experimental model of thrombocytopenia in rabbits. Both total venom and its sphingomyelinase fraction stimulated in vitro aggregation per se in platelet-rich plasma from both species, but a more intense response was obtained with human platelets. Taking into consideration that neither total venom nor its sphingomyelinase fraction induced aggregation of washed platelets, it can be deduced that one or more plasma components are necessary to induce this response. Moreover, LDH data indicated that total venom, at least at the concentration levels used in this study, cannot induce platelet lysis. Regarding platelet activation, total venom was able to increase the expression of LIBS1 on both human and rabbit platelet surface and P-selectin on only rabbit platelet surface. However, the sphingomyelinase fraction did not increase the expression of any marker of platelet activation, at least in the experimental conditions used in this study. Another in vitro study showed that both total venom and its sphingomyelinase fraction induce an increase in human and rabbit platelet adhesion, with the sphingomyelinase fraction exhibiting a dose-dependent response. For the study using an animal model of thrombocytopenia, it was necessary to previously produce goat antibodies against rabbit platelets, which showed to be effective to induce an intense thrombocytopenia in rabbits. Histopathological analysis of venom-induced dermic tissue lesion indicated that platelet absence does not decrease the formation of intravascular thrombi in the injured area. Nonetheless, bigger areas of equimosis and necrotic scabs could be observed in the dermonecrotic lesion of rabbits injected with loxoscelic venom and depleted of platelets. In the different groups, plasma levels of von Willembrand factor, prothrombin and activated partial thromboplastin times, and data from phagocytosis tests using polymorphonuclear cells isolated from rabbit periferical blood were similar comparing thrombocitopenic rabbits with those exhibiting normal platelet count; therefore, we can deduce that there is not any expressive alteration in endotelial cells, coagulation system and phagocytic ability of polymorphonuclear leukocytes via their complement receptor C3b. In conclusion, the loxoscelic venom is able to unchain in vitro different mechanisms leading to adhesion, activation and aggregation of both human and rabbit platelets. Furthermore, due to differences in the dermic lesion patterns between thrombocitopenic and normal animals, we can conclude that platelets must play a key role in controlling the expansion and severity of the dermonecrotic lesion induced in rabbits by L. gaucho venom.

Os venenos de aranhas do gênero Loxosceles possuem uma ampla gama de atividades em diferentes células, tecidos e sistemas, e é notória a sua capacidade de causar a formação da lesão dermonecrótica. Em um trabalho prévio, relatamos uma intensa trombocitopenia induzida pelo veneno loxoscélico em coelhos. Objetivou-se no presente estudo avaliar primeiramente a interação in vitro entre as plaquetas, humanas e de coelhos, com o veneno de Loxosceles gaucho e seu principal componente, a fração esfingomielinásica. Posteriormente, investigou-se o papel da plaqueta no desenvolvimento da lesão dermonecrótica através de um modelo de trombocitopenia em coelhos. Nos estudos in vitro, os resultados de agregação em plasma rico em plaquetas evidenciou que tanto o veneno total quanto a fração esfingomielinásica induziram um aumento desta resposta nas plaquetas das duas espécies, que foi mais intensa nas plaquetas humanas. Uma vez que em plaquetas lavadas a agregação não foi constatada, confirmou-se a necessidade de componente(s) plasmático(s) para a indução desta resposta. Ainda, os dados de LDH indicaram que o veneno total, nas concentrações aqui utilizadas, não foi capaz de causar à lise plaquetária. Com relação à ativação, o veneno total, foi capaz de aumentar a expressão da LIBS1 nas plaquetas de ambas as espécies e de P-selectina na plaqueta de coelho. Sob as nossas condições experimentais, a fração não promoveu o aumento dos marcadores de ativação. Finalizando os estudos in vitro, o veneno total e a fração provocaram um aumento da adesão nas plaquetas das duas espécies, sendo que a resposta à fração esfingomielinásica mostrou-se dose-dependente. O estudo experimental, por vez, necessitou de uma etapa preliminar para a obtenção de um anticorpo anti-plaqueta, produzido em cabras, que mostrou-se eficaz em induzir um intenso quadro trombocitopênico em coelhos. Análises histopatológicas indicam que a ausência das plaquetas não diminuiu a formação de trombos intravasculares na área da derme sob a ação do veneno. O desenvolvimento da lesão dermonecrótica em coelhos injetados com o veneno loxoscélico mostrou-se mais intenso naqueles depletados de plaquetas do que nos animais com número normal de plaquetas, constatável pelo desenvolvimento de maiores áreas de equimose e das escaras necróticas. Os resultados semelhantes dos níveis plasmáticos do fator de von Willembrand, dos tempos de protrombina e de tromboplastina parcial ativada, assim como dos testes de fagocitose por polimorfonucleares isolados do sangue periférico, entre os coelhos trombocitopênicos e aqueles com contagem normal de plaquetas, evidenciam que não houve alterações expressivas nas células endoteliais, no sistema da coagulação e na capacidade fagocítica via C3b dos polimorfonucleares do sangue periférico. Os presentes resultados mostram que o veneno loxoscélico in vitro é capaz de elicitar em plaquetas humanas e de coelhos as respostas de agregação, de adesão e de ativação. Por fim, as diferenças no desenvolvimento da lesão, constatadas entre o animal trombocitopênico e o animal normal, evidenciam que a plaqueta é um fator importante para controlar a expansão e a gravidade da lesão dermonecrótica induiza em coelhos pelo veneno loxoscélico. / Venoms from Loxosceles spiders exhibit a wide range of activities on different cells, tissues and systems, being specially evident their ability to cause a dermonecrotic lesion. In a previous paper, we showed that Loxosceles gaucho spider venom induces intense thrombocytopenia in rabbits. Thus, in the present study, we firstly aimed to evaluate the in vitro interaction between human and rabbits platelets and L. gaucho venom and its major component, the sphingomyelinase fraction. Secondly, we investigated the platelet role in the dermonecrotic lesion formation using an experimental model of thrombocytopenia in rabbits. Both total venom and its sphingomyelinase fraction stimulated in vitro aggregation per se in platelet-rich plasma from both species, but a more intense response was obtained with human platelets. Taking into consideration that neither total venom nor its sphingomyelinase fraction induced aggregation of washed platelets, it can be deduced that one or more plasma components are necessary to induce this response. Moreover, LDH data indicated that total venom, at least at the concentration levels used in this study, cannot induce platelet lysis. Regarding platelet activation, total venom was able to increase the expression of LIBS1 on both human and rabbit platelet surface and P-selectin on only rabbit platelet surface. However, the sphingomyelinase fraction did not increase the expression of any marker of platelet activation, at least in the experimental conditions used in this study. Another in vitro study showed that both total venom and its sphingomyelinase fraction induce an increase in human and rabbit platelet adhesion, with the sphingomyelinase fraction exhibiting a dose-dependent response. For the study using an animal model of thrombocytopenia, it was necessary to previously produce goat antibodies against rabbit platelets, which showed to be effective to induce an intense thrombocytopenia in rabbits. Histopathological analysis of venom-induced dermic tissue lesion indicated that platelet absence does not decrease the formation of intravascular thrombi in the injured area. Nonetheless, bigger areas of equimosis and necrotic scabs could be observed in the dermonecrotic lesion of rabbits injected with loxoscelic venom and depleted of platelets. In the different groups, plasma levels of von Willembrand factor, prothrombin and activated partial thromboplastin times, and data from phagocytosis tests using polymorphonuclear cells isolated from rabbit periferical blood were similar comparing thrombocitopenic rabbits with those exhibiting normal platelet count; therefore, we can deduce that there is not any expressive alteration in endotelial cells, coagulation system and phagocytic ability of polymorphonuclear leukocytes via their complement receptor C3b. In conclusion, the loxoscelic venom is able to unchain in vitro different mechanisms leading to adhesion, activation and aggregation of both human and rabbit platelets. Furthermore, due to differences in the dermic lesion patterns between thrombocitopenic and normal animals, we can conclude that platelets must play a key role in controlling the expansion and severity of the dermonecrotic lesion induced in rabbits by L. gaucho venom.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-04-17T18:56:08Z No. of bitstreams: 1 Ribeiro, Mara Fernandes [Dissertação, 2014].pdf: 3051138 bytes, checksum: 7536143779553e35c3e2d8ad11a9b9bf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:56:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro, Mara Fernandes [Dissertação, 2014].pdf: 3051138 bytes, checksum: 7536143779553e35c3e2d8ad11a9b9bf (MD5) / Os acidentes causados por aranhas do gênero Loxosceles representam importante problema de saúde pública no Brasil, sendo as principais espécies de importância médica L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. O veneno dessas aranhas promove grave dermonecrose no local da picada, e menos comumente, doença sistêmica que pode ser fatal. O mecanismo de ação desse veneno não está completamente elucidado, trata-se de um processo multifatorial, que envolve a ação direta do veneno sobre os tecidos e a resposta do organismo a agressão causada pelo mesmo. Os camundongos constituem o modelo experimental menos susceptível ao desenvolvimento dos efeitos locais decorrentes do envenenamento por aranhas Loxosceles, dessa forma, sua utilização representa grande interesse clínico, cujo objetivo é desvendar tal mecanismo de proteção presente nestes animais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar as atividades do veneno de Loxosceles intermedia, bem como avaliar as atividades in vivo deste veneno em camundongos. A manipulação e os procedimentos com os animais obedeceram aos princípios da CEUA/UFF (Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense). Foi demonstrado, in vitro, que o veneno de L. intermedia não apresenta atividade fosfolipásica A2, a atividade hialuronidásica e colágenásica foram dependente da concentração do veneno enquanto que a atividade proteolítica e esfingomielinásica foram observadas apenas em altas concentrações. Para descrever as ações do veneno de L. intermedia em camundongos, foi proposta a utilização de três diferentes linhagens: BALB/c, C57BL/6 e Suiço. A atividade edematogênica na pata dos camundongos inoculados com o veneno foi observada para as três linhagens testadas, sendo persistente por 24 horas, apenas para as linhagens BALB/c e C57BL/6. A análise histopatológica do local de inoculação intradérmica do veneno no abdomen apresentou diferenças relevantes, como, intensa congestão vascular em Suiços e presença de infiltrado inflamatório no local de inoculação na pele de BALB/c e C57BL/6. A partir destes achados, investigou-se a mobilização de células inflamatórias a partir da medula óssea, no baço e no sangue por citometria de fluxo, que demonstrou resposta imunológica inata típica, com aumento da cinética de células mieloides e linfócitos T citotóxicos para camundongos C57BL/6, e resposta tipicamente adquirida/humoral, com aumento preferencial de linfócitos B convencionais e T auxiliar para camundongos BALB/c. Desta forma, este trabalho demonstrou que modelos animais semelhantes podem apresentar diferentes respostas a inoculação deste veneno. A presença do infiltrado inflamatório no local de inoculação do veneno e a mobilização de células inflamatórias a partir da medula óssea, baço e sangue revelaram que diferentes linhagens de camundongos apresentam diferenças no tipo celular envolvido na resposta imunológica decorrente do envenenamento ou esta diferença pode estar relacionada ao tempo e velocidade da resposta em cada linhagem de camundongos. A partir destes resultados este trabalho sugere que camundongos da linhagem BALB/c podem ser utilizados como modelo para estudar a produção de IgM e IgG induzido pelo veneno, incluindo análise de citocinas, quimiocinas e mecanismos moleculares, por outro lado camundongos C57BL/6 podem ser utilizados para descrever a participação de células mielóides durante o envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles / Accidents caused by spiders of the genus Loxosceles represent an important public health problem in Brazil, being the major species of medical importance L. intermedia, L. laeta and L. gaucho. The venom of these spiders induces an intense dermonecrosis at the bite site, and less commonly, systemic disease that can be fatal. The mechanism of action of this venom is not fully elucidated, it is a multifactorial process, which involves the direct action of the venom on the tissues and the body's response to aggression caused by it. The mice are an experimental model less susceptible to development the local effects of poisoning Loxosceles spiders. Thus, their use is great clinical interest, whose goal is to unravel the mechanism of this protection in these animals. This study aimed to characterize the activities of Loxosceles intermedia venom, as well as evaluating the in vivo activity of this venom in mice. Manipulation and procedures with animals obeyed the principles of CEUA / UFF (Ethics Committee on Animal Use Universidade Federal Fluminense). It has been shown in vitro that the venom of L. intermedia shows no phospholipase A2 activity and the hyaluronidase and collagenase were dependent on the concentration of the poison and while the proteolytic and sphingomyelinase activity were observed only at high concentrations. To describe the actions of the venom of L. intermedia in mice, it was proposed to use three different strains: BALB/c, C57BL/6 and Swiss. The activity in the paw edema of mice inoculated with the venom was observed for the three strains tested, being persistent for 24 hours, only for the strains BALB/c and C57BL/6. Histopathological analysis of the site of venom intradermal inoculation in the abdomen showed significant differences, as intense vascular congestion in Swiss and inflammatory infiltration at the site of inoculation in the skin of BALB/c and C57BL/6. From these findings, we investigated the mobilization of inflammatory cells from the bone marrow, spleen like effector organ, and migration into the blood by flow cytometry, which showed a typical innate immune response, with increased kinetics of myeloid cells and cytotoxic T lymphocytes to C57BL/6 mice, and response typically acquired / humoral, with a preferential increase of conventional B lymphocytes and T helper to BALB/c mice. Thus, this study demonstrated that similar animal models may have different responses to inoculation of this venom. The presence of the inflammatory infiltrate at the site of inoculation of the venom and the mobilization of inflammatory cells from the bone marrow, spleen and blood revealed that different strains of mice differ in cell type involved in the immune response resulting from poisoning and this difference can be related time and speed of response for each strain of mice. From these results, this study suggests that BALB/c mice can be used as a model to study the production of IgM and IgG induced by the venom, including analysis of cytokines, chemokines and molecular mechanisms, on the other hand C57BL/6 mice can be used to describe the involvement of myeloid cells during poisoning by spiders of the genus Loxosceles

Master of Science / Department of Entomology / Robert "Jeff" J. Whitworth / The brown recluse spider (BRS), Loxosceles reclusa (Gertsch & Mulaik), receives unfavorable publicity because of its common association with humans and the medical importance of its toxic bite. BRS range includes much of the south and central United States where they can be found in almost all structures, from homes and sheds to woodpiles and discarded materials. Typical management techniques for the control of BRS involve the use of residual contact insecticides and/or the use of glue traps. Contact insecticides rely on BRS remaining in contact with a treated surface for a length of time to achieve control and may not cause significant BRS mortality. However, if the insecticide kills another household pest that the BRS later scavenges upon, and thus results in the death or decreased reproduction of the BRS, the homeowner rids themselves of pests and potentially reduces BRS populations. This research was initiated with the objective of evaluating how feeding on live vs. dead vs. insecticide-killed prey impacts selected biological aspects of BRS as indicated by, mortality, and weight change over an eight-week period. Follow-on experiments evaluated the effect on fecundity of the adult BRS surviving the eight week trials. In four trials of juvenile and five trials of adult BRS, house crickets, Acheta domesticus (Linnaeus), used as prey, were exposed to one of four treatments: 1) Spinosad insecticide treated surface, 2) synthetic pyrethroid insecticide treated surface, 3) freeze-killed and 4) an untreated (live), and fed to spiders once weekly for eight weeks. BRS exposed to synthetic pyrethroid-killed crickets had significantly greater mortality than all other treatments.

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estudar, a morfologia das glândulas produtoras de veneno da aranha L intermedia, bem como esclarecer questões relacionadas ao perfil e funções dos oligossacarídeos conjugados às glicoproteínas deste veneno. A aranha marrom, do gênero Loxosceles, tornou-se de grande importância médica, devido aos acidentes de envenenamento (loxoscelismo) que vem ocorrendo em diferentes partes do mundo. As atividades biológicas do veneno da aranha marrom normalmente incluem lesões dermonecróticas no local da picada, acompanhadas por efeitos hemolíticos e hemorrágicos e também pelo quadro clínico de insuficiência renal aguda (IRA). Pelo uso de microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, demonstrou-se que a organização das glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia seguem a arquitetura geral das glândulas de veneno de outras aranhas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as glândulas de veneno são estruturas pares, situadas no cefalotórax e que descarregam seus produtos de secreção diretamente em um par de tubos ligados a cada quelícera. Usando-se microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão, observou-se que as glândulas apresentam camadas de fibras de músculos estriados, em contato com uma membrana basal que separa a região muscular da camada epitelial. As células epiteliais possuem um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e vesículas secretoras contendo o veneno, uma mistura complexa de proteínas. Com as técnicas de lectina-blotting, cromatografia de afinidade lectínica e tratamentos com glicosidases, detectou-se no veneno estruturas do tipo alta-manose N-ligadas, proteínas com resíduos de fucose N-Iigados e proteínas com resíduos de N-acetilgalactosamina O-ligados, mas ausência de glicosaminoglicanos ou estruturas complexas contendo galactose ou ácido siálico terminais. Com veneno deglicosilado enzimática ou quimicamente, demonstrou-se que a agregação plaquetária (atividade trombocitopênica), como também os efeitos fibronectinolítico e fibrinogenolítico (hemorrágicos), são açúcar-independentes quando comparados com os efeitos do veneno glicosilado. Uma análise através de zimograma copolimerizado em géis de gelatina, mostrou que a loxolisina B, uma metaloprotease gelatinolítica de 32-35 kDa, é uma glicoproteína do tipo alta-manose e que após uma N-deglicosilação enzimática teve seu peso molecular reduzido em aproximadamente 2 kDa e seu efeito gelatinolítico residual em 28%, quando comparado com a molécula glicosilada. Nesta condição apontou também uma atividade gelatinolítica dependente da glicosilação pós-traducional. O tratamento químico ou enzimático do veneno de L. intermedia (deglicosilação), reduziu significativamente seu efeito dermonecrótico quando testado experimentalmente em coelhos. Este dado sugere fortemente que resíduos de oligossacarídeos exercem um importante papel nos efeitos lesivos do veneno da aranha marrom e abre a possibilidade de se postular uma terapia tópica das lesões cutâneas, baseada em carboidratos.

Os envenenamentos por aranhas das espécies L. laeta, L. intermedia e L. gaucho, podem causar dermonecrose e efeitos sistêmicos. O principal componente tóxico do veneno destas apresenta atividade de esfingomielinase D (SMase D). O objetivo do presente estudo foi comparar o potencial neutralizante do novo soro anti-SMases D recombinantes e do soro anti-Aracnídico contra os efeitos tóxicos dos três venenos. A análise por \"Western blot\" revelou que o anti-Aracnídico reconheceu a maioria dos componentes presentes nos três venenos, enquanto o anti-SMases D reconheceu apenas os componentes de 30-35 kDa, correspondente às isoformas nativas de SMases D. Por ELISA, verificou-se que o soro anti-SMases D contém títulos superiores de IgGT, IgGa, b e c e. Nos testes de soroneutralização, o soro anti-SMases D tem melhor atividade inibitória sobre as atividades dermonecrótica, hemolítica e esfingomielinásica dos venenos de L. intermedia e L. laeta. Para o veneno de L. gaucho, o soro anti-Aracnídico teve resultados similares ou melhores. Embora o soro anti-SMases D apresente um significante potencial neutralizante é necessária a inclusão da SMase D do veneno de L. gaucho para a obtenção de um anti-soro eficaz contra estes venenos. / Envenomation by spiders of species L. laeta, L. intermedia and L. gaucho causes local dermonecrosis and systemic effects. The main toxic component is endowed with sphingomyelinase D (SMase D) activity. The aim of this study was to compare the neutralization potentials of the anti-SMases D and the anti-arachnidic sera, against the toxic effects of venoms of these three species. The analysis by western blot has revealed that the anti-arachnidic serum was able to recognize the majority of the components present on the venoms of the three species, but anti-SMases D has recognized only components of 30-35 kDa, which corresponds to natives SMases D. By ELISA, it has been determined that the anti-SMases D serum contains higher titres of IgGT, IgGa, b and c than the anti-arachnidic serum. Serum neutralization tests have showed that the anti-SMases D serum has better inhibitory shingomyelinasic, dermonecrotic and haemolytic activities of the venoms from L. intermedia and L. laeta. For L. gaucho venom, the results have been similar or better than the anti-arachnidic serum. Although the anti-SMases D serum shows a significant neutralization potential, it is necessary the inclusion of a SMase D from L. gaucho venom, to obtain a efficient antiserum against this venom.

O veneno de aranhas Loxosceles consiste em uma mistura de proteínas com atividade enzimática ou tóxica, incluindo as esfingomielinases D (SMases D), consideradas como os principais componentes tóxicos do veneno, responsáveis pelo estabelecimento dos efeitos locais e sistêmicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial inibitório de moléculas selecionadas por docking molecular sobre as propriedades tóxicas das SMases D. Os dados obtidos mostram que as moléculas selecionadas foram capazes de inibir a atividade hidrolítica da toxina, o mecanismo de hemólise dependente de complemento e eficazes no controle da progressão das lesões dermonecróticas em coelhos. Estes resultados indicam que inibidores específicos para as SMases D são capazes de controlar as reações locais e sistêmicas induzidas pelo veneno de Loxosceles. Estas são ferramentas promissoras para estudos de estrutura/função e para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para o loxoscelismo. / Loxosceles spider venom is a mixture of proteins with enzymatic or toxic activity, including sphingomyelinases D (SMases D), considered as the main toxic components of the venom responsible for the establishment of local and systemic effects. This study aimed to evaluate the inhibitory potential of molecules selected by molecular docking on the toxic properties of SMases D. The results demonstrated that selected molecules were able to inhibit the hydrolytic activity of the toxin, the mechanism of complement-dependent hemolysis and effective in reducing the progression of the dermonecrotic lesion in rabbits. These results indicate that specific inhibitors for SMases D are capable of controlling local and systemic reactions induced by Loxosceles venom. These are promising tools for function/structure studies and for developing new therapeutic interventions for the loxoscelism.

O sistema complemento parece ter surgido com o aparecimento de C3 e fator B (FB), os únicos componentes encontrados nos organismos mais primitivos, o que sugere que a via alternativa seja a mais antiga. Fragmentos de cDNA codificantes para FB (Lox-FB) e C3 (Lox-C3) foram sintetizados a partir do RNA total isolado da glândula de veneno de Loxosceles laeta e amplificados por técnicas de RACE-PCR. Lox-FB apresenta uma organização de domínios clássica, composta por domínios CCP, vWFA e de serino protease. Os aminoácidos envolvidos na ligação ao C3b são conservados, no entanto, a tríade catalítica clássica não foi encontrada. Lox-C3 apresenta uma configuração de domínios similar a do C3 humano, contendo dois sítios putativos de processamento: um entre as cadeias α e γ, e outro entre as cadeias α e β, indicando que Lox-C3 seja composto por três cadeias. As análises filogenéticas indicaram que Lox-C3 e Lox-FB são mais próximos evolutivamente aos componentes equivalentes da aranha Hasarius adansoni, com valores de identidade de 53% e 43%, respectivamente. / The complement system seems to have arisen with the appearance of C3 and factor B (FB), the only components found in the most primitive organisms, suggesting that the alternative pathway is the oldest. cDNA fragments coding for the complement factor B (Lox-FB) and C3 (Lox-C3) were synthesized from total RNA Loxosceles laeta venom gland and amplified using RACE-PCR techniques. Lox-FB has a classical domain organization in mosaic, composed by CCPs, vWFA and serine protease domains. The amino acids involved in binding to C3b are conserved, however, the classical calatytic triad was not found. Lox-C3 presents a similar configuration of domains to C3 human and has two putative processing sites: the first one is located between α and γ chains and other between α and β chains, indicating that Lox-C3 is composed by three chains. The phylogenetic analyses indicated that Lox-C3 and Lox-FB are evolutionary closer to the equivalent components of Hasarius adansoni, with identity values of 53% and 43%, respectively.

O veneno de aranhas Loxosceles consiste em uma mistura de proteínas com atividade enzimática ou tóxica, incluindo as esfingomielinases D (SMases D), consideradas como os principais componentes tóxicos do veneno, responsáveis pelo estabelecimento dos efeitos locais e sistêmicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial inibitório de moléculas selecionadas por docking molecular sobre as propriedades tóxicas das SMases D. Os dados obtidos mostram que as moléculas selecionadas foram capazes de inibir a atividade hidrolítica da toxina, o mecanismo de hemólise dependente de complemento e eficazes no controle da progressão das lesões dermonecróticas em coelhos. Estes resultados indicam que inibidores específicos para as SMases D são capazes de controlar as reações locais e sistêmicas induzidas pelo veneno de Loxosceles. Estas são ferramentas promissoras para estudos de estrutura/função e para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas para o loxoscelismo. / Loxosceles spider venom is a mixture of proteins with enzymatic or toxic activity, including sphingomyelinases D (SMases D), considered as the main toxic components of the venom responsible for the establishment of local and systemic effects. This study aimed to evaluate the inhibitory potential of molecules selected by molecular docking on the toxic properties of SMases D. The results demonstrated that selected molecules were able to inhibit the hydrolytic activity of the toxin, the mechanism of complement-dependent hemolysis and effective in reducing the progression of the dermonecrotic lesion in rabbits. These results indicate that specific inhibitors for SMases D are capable of controlling local and systemic reactions induced by Loxosceles venom. These are promising tools for function/structure studies and for developing new therapeutic interventions for the loxoscelism.