Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-04-17T18:56:08Z No. of bitstreams: 1 Ribeiro, Mara Fernandes [Dissertação, 2014].pdf: 3051138 bytes, checksum: 7536143779553e35c3e2d8ad11a9b9bf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:56:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro, Mara Fernandes [Dissertação, 2014].pdf: 3051138 bytes, checksum: 7536143779553e35c3e2d8ad11a9b9bf (MD5) / Os acidentes causados por aranhas do gênero Loxosceles representam importante problema de saúde pública no Brasil, sendo as principais espécies de importância médica L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. O veneno dessas aranhas promove grave dermonecrose no local da picada, e menos comumente, doença sistêmica que pode ser fatal. O mecanismo de ação desse veneno não está completamente elucidado, trata-se de um processo multifatorial, que envolve a ação direta do veneno sobre os tecidos e a resposta do organismo a agressão causada pelo mesmo. Os camundongos constituem o modelo experimental menos susceptível ao desenvolvimento dos efeitos locais decorrentes do envenenamento por aranhas Loxosceles, dessa forma, sua utilização representa grande interesse clínico, cujo objetivo é desvendar tal mecanismo de proteção presente nestes animais. Este trabalho teve como objetivo caracterizar as atividades do veneno de Loxosceles intermedia, bem como avaliar as atividades in vivo deste veneno em camundongos. A manipulação e os procedimentos com os animais obedeceram aos princípios da CEUA/UFF (Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense). Foi demonstrado, in vitro, que o veneno de L. intermedia não apresenta atividade fosfolipásica A2, a atividade hialuronidásica e colágenásica foram dependente da concentração do veneno enquanto que a atividade proteolítica e esfingomielinásica foram observadas apenas em altas concentrações. Para descrever as ações do veneno de L. intermedia em camundongos, foi proposta a utilização de três diferentes linhagens: BALB/c, C57BL/6 e Suiço. A atividade edematogênica na pata dos camundongos inoculados com o veneno foi observada para as três linhagens testadas, sendo persistente por 24 horas, apenas para as linhagens BALB/c e C57BL/6. A análise histopatológica do local de inoculação intradérmica do veneno no abdomen apresentou diferenças relevantes, como, intensa congestão vascular em Suiços e presença de infiltrado inflamatório no local de inoculação na pele de BALB/c e C57BL/6. A partir destes achados, investigou-se a mobilização de células inflamatórias a partir da medula óssea, no baço e no sangue por citometria de fluxo, que demonstrou resposta imunológica inata típica, com aumento da cinética de células mieloides e linfócitos T citotóxicos para camundongos C57BL/6, e resposta tipicamente adquirida/humoral, com aumento preferencial de linfócitos B convencionais e T auxiliar para camundongos BALB/c. Desta forma, este trabalho demonstrou que modelos animais semelhantes podem apresentar diferentes respostas a inoculação deste veneno. A presença do infiltrado inflamatório no local de inoculação do veneno e a mobilização de células inflamatórias a partir da medula óssea, baço e sangue revelaram que diferentes linhagens de camundongos apresentam diferenças no tipo celular envolvido na resposta imunológica decorrente do envenenamento ou esta diferença pode estar relacionada ao tempo e velocidade da resposta em cada linhagem de camundongos. A partir destes resultados este trabalho sugere que camundongos da linhagem BALB/c podem ser utilizados como modelo para estudar a produção de IgM e IgG induzido pelo veneno, incluindo análise de citocinas, quimiocinas e mecanismos moleculares, por outro lado camundongos C57BL/6 podem ser utilizados para descrever a participação de células mielóides durante o envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles / Accidents caused by spiders of the genus Loxosceles represent an important public health problem in Brazil, being the major species of medical importance L. intermedia, L. laeta and L. gaucho. The venom of these spiders induces an intense dermonecrosis at the bite site, and less commonly, systemic disease that can be fatal. The mechanism of action of this venom is not fully elucidated, it is a multifactorial process, which involves the direct action of the venom on the tissues and the body's response to aggression caused by it. The mice are an experimental model less susceptible to development the local effects of poisoning Loxosceles spiders. Thus, their use is great clinical interest, whose goal is to unravel the mechanism of this protection in these animals. This study aimed to characterize the activities of Loxosceles intermedia venom, as well as evaluating the in vivo activity of this venom in mice. Manipulation and procedures with animals obeyed the principles of CEUA / UFF (Ethics Committee on Animal Use Universidade Federal Fluminense). It has been shown in vitro that the venom of L. intermedia shows no phospholipase A2 activity and the hyaluronidase and collagenase were dependent on the concentration of the poison and while the proteolytic and sphingomyelinase activity were observed only at high concentrations. To describe the actions of the venom of L. intermedia in mice, it was proposed to use three different strains: BALB/c, C57BL/6 and Swiss. The activity in the paw edema of mice inoculated with the venom was observed for the three strains tested, being persistent for 24 hours, only for the strains BALB/c and C57BL/6. Histopathological analysis of the site of venom intradermal inoculation in the abdomen showed significant differences, as intense vascular congestion in Swiss and inflammatory infiltration at the site of inoculation in the skin of BALB/c and C57BL/6. From these findings, we investigated the mobilization of inflammatory cells from the bone marrow, spleen like effector organ, and migration into the blood by flow cytometry, which showed a typical innate immune response, with increased kinetics of myeloid cells and cytotoxic T lymphocytes to C57BL/6 mice, and response typically acquired / humoral, with a preferential increase of conventional B lymphocytes and T helper to BALB/c mice. Thus, this study demonstrated that similar animal models may have different responses to inoculation of this venom. The presence of the inflammatory infiltrate at the site of inoculation of the venom and the mobilization of inflammatory cells from the bone marrow, spleen and blood revealed that different strains of mice differ in cell type involved in the immune response resulting from poisoning and this difference can be related time and speed of response for each strain of mice. From these results, this study suggests that BALB/c mice can be used as a model to study the production of IgM and IgG induced by the venom, including analysis of cytokines, chemokines and molecular mechanisms, on the other hand C57BL/6 mice can be used to describe the involvement of myeloid cells during poisoning by spiders of the genus Loxosceles

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alinemargraf.pdf: 7420254 bytes, checksum: 591624049aa55aa68ad2d024197a427a (MD5) Previous issue date: 2009-09-30 / Loxosceles intermedia is a poisonous species widely distributed in the region of Curitiba and Campos Gerais of the Paraná State. There are descriptions in the literature concerning the reproductive behavior of this species and, more recently, studies have been carried out in order to describe the post-embryonic development of the female reproductive system. The adult male reproductive system is composed by two testicles connected to the vas deferens by two structures, a duct and an ampulla, not yet described for other spider species. Then in this work were described the morphological aspects of the development of the male reproductive system, the morphology of the duct and ampulla in the adult male and discussed possible functional and evolutionary implications of this segments on reproduction of L. intermedia. For the analysis in light microcopy, male animals at different stages of the development were etherized and sacrificed. Their abdomens were removed and fixed in 4% paraformaldehyde/ 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, and embedded in historesin (Leica). Subsequently, the serial 5 Tm sections were submitted to HE staining and PAS reaction. For the analysis in SEM, adult male animals were dissected and their whole testis-duct-ampulla was removed and fixed in 0.2 M sodium cacodilate, 2.5% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde, pH 7.4. The tissues were dehydrated and dried in alcohol series and critical point, respectively. Subsequently, the tissues were coated with gold and analyzed by SEM. Considering the fact that the organs of the male reproductive system of L. intermedia are tiny and fragile, which makes them difficult to dissect for observation in SEM by the usual methods, in this work was also evaluated some protocols, using paraffin, paraplast or PEG (for short and long time of infiltration) as infiltration medium, for obtaining serial sections, as well as three adherence substances to slides (5.5% albumin, 0.1% gelatin and 1% gelatin, the tissues samples were submitted of infiltration and 20 Tm sections were obtained, placed on glass slides, washed with solvent or water, dried at room temperature, coated with gold and analyzed in SEM. Infiltration with PEG for a short time and adhesion with 1% gelatin was found to be the best protocol resulting in the maintenance of the cell shape and tissue characteristics. Following the development of the male reproductive system of the brown spider it was observed that the maturation of the testis is the first event to take place. After the appearance of synspermium inside the testicles, the differentiation of the duct, ampulla and vas deferens is observed, and finally the external modification of the palps in copulatory organs occurs. In adult male, the tissue of the duct is composed of a non-secretory epithelium, without a defined lumen. The function of the duct is probably the selection of viable sperm cells. The ampulla wall is composed of a secretory epithelium whose glycoprotein secretion involves the synspermium. The secretion released by the ampulla could be involved in distinct aspects of the functionality of the gametes. The ampulla secretion could also be related to mechanisms of sexual selection, not yet established for this species of spider. In conclusion, this morphological novelty in L. intermedia male reproductive system appears to constitute an important evolutionary event on spider reproduction. / Loxosceles intermedia é uma espécie de aranha venenosa amplamente distribuída na região de Curitiba e Campos Gerais do Paraná. Há descrições na literatura sobre o comportamento reprodutivo dessa espécie e, mais recentemente, estudos têm sido realizados a fim de descrever o desenvolvimento pós-embrionário do sistema reprodutor masculino. O sistema reprodutor masculino adulto é composto por dois testículos, ligado ao vas deferens por duas estruturas, um ducto e uma ampola, ainda não descritas para outras espécies de aranhas. Neste trabalho foram descritos os aspectos morfológicos do desenvolvimento do sistema reprodutor masculino, a morfologia do ducto e da ampola no macho adulto e discutidas as possíveis implicações funcionais e evolutivas destes segmentos sobre a reprodução de L. intermedia. Para a análise em microscopia óptica, os machos em diferentes fases do desenvolvimento foram anestesiados e sacrificados. Seus abdomens foram removidos e fixados em 4% paraformaldeído / tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, e incorporado em historesina (Leica). Posteriormente, os cortes seriados a 5 Tm foram submetidos à coloração HE e reação PAS. Para a análise em MEV, machos adultos foram dissecados e o conjunto testículo-ducto-ampola foi removido e fixado em cacodilato de sódio 0,2 M, glutaraldeído 2,5% e paraformaldeído 2%, pH 7,4. Os tecidos foram desidratados e secos em série alcoólica e ponto crítico. Posteriormente, os tecidos foram cobertos com ouro e analisadas por MEV. Considerando-se o fato de que os órgãos do sistema reprodutor masculino de L. intermedia são pequenos e frágeis, o que torna difícil a dissecção para observação em MEV pelos métodos usuais, neste trabalho também foram avaliados alguns protocolos de infiltração, utilizando parafina, paraplast e PEG (por tempo curto e longo prazo de infiltração), para a obtenção de cortes seriados, bem como testou-se três substâncias de adesão às lamínulas (albumina 5,5%, gelatina 0,1% e gelatina 1%), as amostras de tecidos foram submetidos a infiltração e cortes a 20 μm foram obtidos. Estes foram colocados em lâminas de vidro, lavados com solvente ou água, secos à temperatura ambiente, revestidos com ouro e analisados em MEV. Infiltração com PEG por um tempo curto e aderência com gelatina 1% foi o melhor protocolo resultando na manutenção da forma das células e das características do tecido. No desenvolvimento do sistema reprodutor masculino da aranha marrom foi observado que a maturação do testículo é o primeiro evento a acontecer. Após o aparecimento da synspermium dentro dos testículos, a diferenciação do ducto, ampola e vas deferens é observada e, finalmente, a modificação externa do palpos em órgãos copulatórios ocorre. No macho adulto, o tecido do ducto é composto de um epitélio não secretor, sem uma luz definida. A função do ducto é, provavelmente, a seleção de espermatozóides viáveis. A parede da ampola é composta por um epitélio secretor, cuja secreção glicoproteíca envolve o synspermium. A secreção liberada pelo ampola pode esta envolvida em aspectos distintos da funcionalidade dos gametas, bem como pode também estar relacionada a mecanismos de seleção sexual, ainda não definidos para esta espécie de aranha. Conclui-se que, esta novidade morfológica no sistema reprodutor masculino de L. intermedia parece constituir um importante evento evolutivo na reprodução de aranha.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-02-15T16:51:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tamara Nascimento Ferreira.pdf: 2375661 bytes, checksum: 1a03fafd92daf583c5befdc68482ada8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-15T16:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Tamara Nascimento Ferreira.pdf: 2375661 bytes, checksum: 1a03fafd92daf583c5befdc68482ada8 (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / A tolerância oral é definida como uma supressão a respostas imunológicas específicas após imunização com um antígeno que foi previamente administrado por via oral. Esse método tem sido estudado, nas últimas décadas, como uma ferramenta na redução de respostas imunes humorais e celulares envolvidas em doenças autoimunes e alergias e parece ser uma alternativa para reduzir ou retardar a rejeição de transplantes. Neste estudo investigamos o potencial das toxinas dermonecróticas recombinantes do veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia em induzir estado de tolerância de mucosas em modelo animal, avaliando os mecanismos celulares envolvidos e a resposta imune do animal tolerante frente a estímulos imunológicos específicos e inespecíficos. As toxinas recombinantes utilizadas para indução da tolerância oral foram a LiRecDT1 (com atividade dermonecrótica) e sua forma mutada, LiRecDT1H12A, (com atividade dermonecrótica residual). Para indução de tolerância oral foi utilizado protocolo com baixas doses de antígeno, onde foram tolerizados camundongos adultos Swiss, tratados oralmente com as toxinas recombinantes durante 21 dias, num total de 90g por animal. Para investigar possíveis mecanismos envolvidos na tolerância oral, foi avaliada a expressão fator de transcrição Foxp3 e da citocina TGF-β. Após o protocolo de tolerização os linfonodos mesentéricos foram processados para ensaio de western blotting e a expressão do fator de transcrição Foxp3 e da citocina TGF-β foram avaliados. Os grupos tolerizados com ambas as toxinas mostraram um aumento na expressão dos dois componentes, demonstrando que um dos mecanismos de tolerância oral no nosso modelo pode envolver aumento na população de linfócitos T regulatórios. Esse resultado pode ser reforçado pela dimimuição de edema de pata em camundongos naive que receberam, via intravenosa, esplenócitos de animais tolerizados com a toxina LiRecDT1 H12A (transferência adotiva). Além disso, pudemos observar que a tolerância induzida pela toxina LiRecDT1 H12A se estendeu a antígenos não relacionados (tolerância cruzada) com diminuição na produção de anticorpos IgG específicos e edema de pata em animais desafiados com veneno da vespa Polybia paulista. A tolerância oral induzida pela toxina LiRecDT1 H12A também permitiu aparente redução da resposta imunológica do animal tolerante frente ao enxerto alogênico de camundongos C57BL/6. Considerando os resultados obtidos é possível concluir que a tolerância oral induzida pelas toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A pode envolver aumento na população de linfóticos T regulatórios cuja produção de citocinas anti-inflamatórias, pelo menos na tolerância induzida pela toxina LiRecDT1 H12A, pode reduzir a resposta imune a antígenos específicos e inespecíficos na tolerância cruzada e na redução de rejeição a transplantes. / Oral tolerance refers to physiologic induction of immunosuppression that occurs in mucosal induced by oral administration of an antigen. This method has been used to induce reduction of humoral and cellular responses involved in autoimmune diseases, allergies and may be an alternative to reduce transplant rejection. We investigated potential of dermonecrotic recombinant toxins of brown spider Loxosceles intermedia specie to induce a state of mucosal tolerance in a animal model. We did this by assessing the cellular mechanisms involved and the immune response of tolerant animals against specific and nonspecific immune stimulation. Dermonecrotic toxin LiRecDT1 and its mutated form, LiRecDT1 H12A (with residual dermonecrotic activity), has been used. Mice were treated with recombinant toxins, orally, for 21 days, with a total of 90g per animal. After oral tolerance protocol, mesenteric lymph nodes were processed for western blotting and the expression of nuclear transcription factor Foxp3 and cytokine Tgf-β were analyzed. LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A tolerant groups showed an increase in expression of both proteins, which could be related to a increase in regulatory T-cells population. Adoptive transfer of splenocytes to naive mice from LiRecDT1 H12A tolerated group induced paw edema reduction, with supports this theory (adoptive transfer). Our results also demonstrated a bystander tolerance when LiRecDT1 H12A tolerated mice showed a decrease in IgG production and paw edema induction by Polybia paulista wasp venom. LiRecDT1 H12A tolerance also showed an apparent reduction in skin allograft rejection using C57BL/6 mice as donor and tolerated Swiss mice as receptor. Considering the results we concluded that oral tolerance induced by LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A toxins could be involve increase in Tregs and non-inflammatory cytokines, and LiRecDT1 H12A tolerance can reduce specific and non specific immunology responses and allografts transplants rejection.