Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Aranhas do gênero Loxosceles, são responsáveis por acidentes em todo o mundo, com grande importância clínica no Sul do Brasil. Os venenos destas aranhas são compostos por diversas toxinas, entre elas proteínas, responsáveis pelo quadro conhecido como loxoscelismo. No intuito de descrever o perfil transcricional da glândula produtora de veneno da aranha Loxosceles intermedia geramos uma biblioteca de cDNA bastante ampla e seus transcritos foram funcionalmente caracterizados. Após o processamento inicial das sequências, 1.843 ESTs (Expressed Sequence Tags) apresentavam qualidade suficiente para as análises posteriores. Estas sequências foram montadas em 538 clusters, sendo que 281 eram singletons. Após análises de similaridade, mais de 50% das ESTs demonstraram algum grau de semelhança com proteínas conhecidas. As análises de similaridade também demonstraram que os transcritos que codificavam para toxinas, perfaziam 43% de todas as sequências e abrangem uma parte significativa das ESTs. As toxinas mais frequentes foram anotadas como pertencentes à família LiTx de toxinas inseticidas. As fosfolipases-D e as metaloproteases semelhantes à astacinas perfazem, cada uma, cerca de 9% do total de transcritos. Componentes tóxicos tais como inibidores de serino-proteases, hialuronidase e proteínas alergênicas foram também identificadas, porém com menor representação. Quase 10% das ESTs codificam para proteínas envolvidas em processos celulares. O presente trabalho descreve também as etapas para clonagem, expressão heteróloga e purificação de um transcrito semelhante a um inibidor de serino-protease, identificado na biblioteca de cDNA. É sabido que proteínas desta família apresentam um grande potencial de aplicação como drogas antitrombóticas, atuando como agentes terapêuticos que influenciam a atividade de fatores de coagulação. Esses dados fornecem uma visão global do perfil de expressão da glândula de veneno de L. intermedia, revelam diferenças significantes entre venenos de aranhas do gênero Loxosceles e descrevem a produção de uma nova toxina recombinante. / Loxosceles genus spiders are responsible for accidents all over the world and have clinical importance in the South of Brazil. The venom of these spiders is made up of several toxins, including proteins, which are responsible for the clinical pattern called loxoscelism. To describe the transcriptional profile of the L. intermedia venom gland, we generated a wide cDNA library, and its transcripts were functionally and structurally analyzed. After initial analyses, 1,843 ESTs produced readable sequences that were grouped into 538 clusters, 281 of which were singletons. Nine hundred eighty-five reads (53% of total ESTs) matched to known proteins. Similarity searches showed that toxinencoding transcripts totalize 43% of the total library and comprise a great number of ESTs. The most frequent toxins were from the LiTx family, which are known for their insecticidal activity. Both phospholipase-D and astacin-like metalloproteases toxins account for approximately 9% of total transcripts. Toxins components such as serine proteases, hyaluronidases and venom allergens were also found but with minor representation. Almost 10% of the ESTs encode for proteins involved in cellular processes. This work also describes the stages for cloning, heterologous expression and purification of a cDNA similar to a protease inhibitor identified in the cDNA library. It is known that proteins belonging to this family have an application potential as antithrombotic drugs, acting as therapeutic agents that influences the activity of coagulation factors. These data provide an important overview of the L. intermedia venom gland expression scenario, revealed significant differences from profiles of other spiders from the Loxosceles genus and describe the production of a novel recombinant toxin. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alinemargraf.pdf: 7420254 bytes, checksum: 591624049aa55aa68ad2d024197a427a (MD5) Previous issue date: 2009-09-30 / Loxosceles intermedia is a poisonous species widely distributed in the region of Curitiba and Campos Gerais of the Paraná State. There are descriptions in the literature concerning the reproductive behavior of this species and, more recently, studies have been carried out in order to describe the post-embryonic development of the female reproductive system. The adult male reproductive system is composed by two testicles connected to the vas deferens by two structures, a duct and an ampulla, not yet described for other spider species. Then in this work were described the morphological aspects of the development of the male reproductive system, the morphology of the duct and ampulla in the adult male and discussed possible functional and evolutionary implications of this segments on reproduction of L. intermedia. For the analysis in light microcopy, male animals at different stages of the development were etherized and sacrificed. Their abdomens were removed and fixed in 4% paraformaldehyde/ 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, and embedded in historesin (Leica). Subsequently, the serial 5 Tm sections were submitted to HE staining and PAS reaction. For the analysis in SEM, adult male animals were dissected and their whole testis-duct-ampulla was removed and fixed in 0.2 M sodium cacodilate, 2.5% glutaraldehyde and 2% paraformaldehyde, pH 7.4. The tissues were dehydrated and dried in alcohol series and critical point, respectively. Subsequently, the tissues were coated with gold and analyzed by SEM. Considering the fact that the organs of the male reproductive system of L. intermedia are tiny and fragile, which makes them difficult to dissect for observation in SEM by the usual methods, in this work was also evaluated some protocols, using paraffin, paraplast or PEG (for short and long time of infiltration) as infiltration medium, for obtaining serial sections, as well as three adherence substances to slides (5.5% albumin, 0.1% gelatin and 1% gelatin, the tissues samples were submitted of infiltration and 20 Tm sections were obtained, placed on glass slides, washed with solvent or water, dried at room temperature, coated with gold and analyzed in SEM. Infiltration with PEG for a short time and adhesion with 1% gelatin was found to be the best protocol resulting in the maintenance of the cell shape and tissue characteristics. Following the development of the male reproductive system of the brown spider it was observed that the maturation of the testis is the first event to take place. After the appearance of synspermium inside the testicles, the differentiation of the duct, ampulla and vas deferens is observed, and finally the external modification of the palps in copulatory organs occurs. In adult male, the tissue of the duct is composed of a non-secretory epithelium, without a defined lumen. The function of the duct is probably the selection of viable sperm cells. The ampulla wall is composed of a secretory epithelium whose glycoprotein secretion involves the synspermium. The secretion released by the ampulla could be involved in distinct aspects of the functionality of the gametes. The ampulla secretion could also be related to mechanisms of sexual selection, not yet established for this species of spider. In conclusion, this morphological novelty in L. intermedia male reproductive system appears to constitute an important evolutionary event on spider reproduction. / Loxosceles intermedia é uma espécie de aranha venenosa amplamente distribuída na região de Curitiba e Campos Gerais do Paraná. Há descrições na literatura sobre o comportamento reprodutivo dessa espécie e, mais recentemente, estudos têm sido realizados a fim de descrever o desenvolvimento pós-embrionário do sistema reprodutor masculino. O sistema reprodutor masculino adulto é composto por dois testículos, ligado ao vas deferens por duas estruturas, um ducto e uma ampola, ainda não descritas para outras espécies de aranhas. Neste trabalho foram descritos os aspectos morfológicos do desenvolvimento do sistema reprodutor masculino, a morfologia do ducto e da ampola no macho adulto e discutidas as possíveis implicações funcionais e evolutivas destes segmentos sobre a reprodução de L. intermedia. Para a análise em microscopia óptica, os machos em diferentes fases do desenvolvimento foram anestesiados e sacrificados. Seus abdomens foram removidos e fixados em 4% paraformaldeído / tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, e incorporado em historesina (Leica). Posteriormente, os cortes seriados a 5 Tm foram submetidos à coloração HE e reação PAS. Para a análise em MEV, machos adultos foram dissecados e o conjunto testículo-ducto-ampola foi removido e fixado em cacodilato de sódio 0,2 M, glutaraldeído 2,5% e paraformaldeído 2%, pH 7,4. Os tecidos foram desidratados e secos em série alcoólica e ponto crítico. Posteriormente, os tecidos foram cobertos com ouro e analisadas por MEV. Considerando-se o fato de que os órgãos do sistema reprodutor masculino de L. intermedia são pequenos e frágeis, o que torna difícil a dissecção para observação em MEV pelos métodos usuais, neste trabalho também foram avaliados alguns protocolos de infiltração, utilizando parafina, paraplast e PEG (por tempo curto e longo prazo de infiltração), para a obtenção de cortes seriados, bem como testou-se três substâncias de adesão às lamínulas (albumina 5,5%, gelatina 0,1% e gelatina 1%), as amostras de tecidos foram submetidos a infiltração e cortes a 20 μm foram obtidos. Estes foram colocados em lâminas de vidro, lavados com solvente ou água, secos à temperatura ambiente, revestidos com ouro e analisados em MEV. Infiltração com PEG por um tempo curto e aderência com gelatina 1% foi o melhor protocolo resultando na manutenção da forma das células e das características do tecido. No desenvolvimento do sistema reprodutor masculino da aranha marrom foi observado que a maturação do testículo é o primeiro evento a acontecer. Após o aparecimento da synspermium dentro dos testículos, a diferenciação do ducto, ampola e vas deferens é observada e, finalmente, a modificação externa do palpos em órgãos copulatórios ocorre. No macho adulto, o tecido do ducto é composto de um epitélio não secretor, sem uma luz definida. A função do ducto é, provavelmente, a seleção de espermatozóides viáveis. A parede da ampola é composta por um epitélio secretor, cuja secreção glicoproteíca envolve o synspermium. A secreção liberada pelo ampola pode esta envolvida em aspectos distintos da funcionalidade dos gametas, bem como pode também estar relacionada a mecanismos de seleção sexual, ainda não definidos para esta espécie de aranha. Conclui-se que, esta novidade morfológica no sistema reprodutor masculino de L. intermedia parece constituir um importante evento evolutivo na reprodução de aranha.

Made available in DSpace on 2017-07-21T20:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Murilo Delgobo.pdf: 2288840 bytes, checksum: d9ce3a086e9ee92b92ac76ac76264e04 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Brown-Spider’s venom (Loxosceles sp.) is presented as a complex mixture of toxins, able to induce skin necrosis with gravitational spreading, intense inflammatory response, edema induction and increase in vascular permeability in vivo. Recently, the biotechnological potential of the toxins was explored by its use in clinical test, in the study of inflammatory response, as a research tool in cell biology, as a biopesticide and in immunotherapy, through the production of antiserum. In this context, immunotherapy is broadly spread through the production of vaccines, available for the treatment of deleterious reactions developed in accidents. In the present work, we investigated if immunological tolerance induction to dermonecrotic recombinant toxin (LiRecDT1) and its mutated form (LiRecDT1 H12A), through its oral administration, could modulate inflammatory and deleterious responses triggered by dermonecrotic toxin. For this purpose, an oral tolerance protocol was designed, consisting in the administration of 10 μg of LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A three times in a week, for three weeks. Adult Swiss mice were further immunized, and oral tolerance induction was observed by reduction in serum levels of IgG antibody anti-toxin when compared with control group. It was observed that mice tolerant to LiRecDT1 H12A present a reduction in paw edema, caused by the injection of 6 μg of dermonecrotic toxin in plantar surface hind paw. Mice tolerized with LiRecDT1 and challenged with 50 μg of dermonecrotic toxin, exhibited higher survival, when compared to control group. This effect was not observed in mice tolerized to LiRecDT1 H12A. The present findings suggested that oral tolerance induction to LiRecDT1 H12A was able to alleviate inflammatory responses triggered by dermonecrotic toxin in paw edema and oral tolerance to LiRecDT1 increase survivability in challenge. The results shown that LiRecDT1 and LiRecDT1 H12A can be explored as a tool in the induction and study of oral tolerance phenomena. The generation of T regulatory cells (Tregs) and following involvement of immunosuppressive cytokines might take part in the modulation of immune response. / O veneno de aranha-marrom (Loxosceles sp.) apresenta-se como uma mistura complexa de toxina, capazes de causar necrose com espalhamento local, intensa resposta inflamatória, indução de edema e aumento da permeabilidade vascular in vivo. Recentemente, o potencial biotecnológico das toxinas foi explorado através de seu uso em análises clínicas, no estudo da resposta inflamatória, como ferramenta de pesquisa na biologia celular, como biopesticidas e na imunoterapia, através da produção de anti-soro. No presente trabalho, foi investigado se a indução de tolerância imunológica à toxina dermonecrótica recombinante (LiRecDT1) e sua forma mutada (LiRecDT1 H12A), através de sua administração oral, poderia modular as respostas inflamatórias e deletérias causadas pela toxina dermonecrótica. Para tal, foi desenvolvido um protocolo para indução de tolerância oral, consistindo na administração de 10 μg de LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A três vezes por semana, durante três semanas. Camundongos Swiss fêmeas adultas foram posteriormente imunizadas, e a indução de tolerância foi confirmada pela diminuição nos níveis de anticorpos IgG anti-toxina em relação ao grupo controle, resultado que aponta a obtenção de sucesso na indução de tolerância imunológica. Observou-se que animais tolerantes a LiRecDT1 H12A apresentaram uma diminuição no edema desenvolvida na pata, causado pela aplicação de 6 μg de LiRecDT1 na superfície plantar traseira. Animais tolerizados com LiRecDT1 e desafiados com 50 μg intraperitoneal de toxina dermonecrótica apresentaram maior índice de sobrevivência, quando comparados ao grupo controle. Esse efeito não foi observado em animais tolerizados com LiRecDT1 H12A. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que a indução de tolerância oral à LiRecDT1 H12A é capaz de atenuar o desenvolvimento da resposta inflamatória no edema de pata, enquanto a tolerância oral a LiRecDT1 foi capaz de aumentar a sobrevivência em animais desafiados com LiRecDT1. Os resultados demonstram que as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1 H12A podem ser exploradas como ferramenta na indução e estudo da tolerância oral. A geração de células T regulatórias (Tregs) e subsequente participação de citocinas imunossupressoras devem estar envolvidas na modulação da resposta imune.