La comercialización de la fibra de alpaca es una de las principales fuentes de sustento para más de un millón de personas en el Perú, siendo de mucha importancia para su economía por ser el principal productor de fibra. Teniendo en cuenta que dos de los factores importantes en la calidad de la fibra son su diámetro y su longitud, se analizaron los ESTs de la alpaca depositados en la base de datos del NCBI para identificar los genes relacionados a la síntesis de fibra y microsatélites que tendrían una función importante relacionada a su calidad. Se analizaron 7286 ESTs de piel de una alpaca del tipo huacaya, resultando en 2428 secuencias ensambladas o unigenes, posteriormente se realizó la búsqueda de homologías y la anotación de secuencias. Se identificaron 22 genes relacionados a la síntesis de la fibra (KRT10, KRT25, KRT31, KRT14, KRT15, KRT5, KRT78, KRT81, KRT85, KRTAP3-2, KRTAP10, KRTAP11-1, TNFSF12, sFRP4, RACK1, COL1A1, COL1A2, DAB2IP, GLI1, BMP1, BMP4 y CTNNB1) donde se observó 4 de estos con una alta expresión (TNFSF12, sFRP4, COL1A1 y COL1A2) y 10 genes poseen microsatélites (COL1A1, TNFSF12, DAB2IP, GLI1, BMP4, KRT81, KRT5, KRT15, KRT85 y KRTAP3-2). El presente estudio aporta la identificación de genes relacionados a la síntesis de fibra y marcadores EST-SSR con los cuales se pueden probar en la alpaca para establecer de forma experimental si estos genes tienen una relación con el diámetro.

Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Banca: Juliana Pereira Bravo / Banca: João Nakagawa / Banca: Anderson Cleiton José / Banca: Heloisa Oliveira dos Santos / Resumo: A tolerância à dessecação (TD) em sementes ortodoxas é adquirida na fase de maturação e perdida com a germinação (protrusão radicular). Todavia, a utilização de polietileno glicol (PEG) pode restabelecer a TD em sementes germinadas. Objetivou-se neste trabalho restabelecer a tolerância à dessecação em sementes germinadas de Solanum lycocarpum e estudar o transcriptoma e os mecanismos associados a este processo. Quatro repetições de 50 sementes germinadas com comprimento de raiz primária de 1, 2, 3, 4 e 5 mm foram tratadas com PEG 8000 à -1,7 MPa e mantidas à 10 °C por 72 horas e, após esse período, as sementes germinadas foram secadas em ambiente com solução de cloreto de lítio (65% de UR e 20 °C) até atingirem a umidade de 8,7%, como a do tratamento controle, as sementes germinadas não tratadas. Em seguida, as sementes germinadas foram pré-umidificadas em atmosfera saturada com vapor d'água por 24 horas à 20 °C e, então, submetidas às condições de germinação. O RNA foi extraído e sequenciado de raízes primárias de 2 mm de comprimento tratadas com PEG e não tratadas. Foram utilizadas três repetições biológicas de 100 raízes primárias para cada biblioteca de RNA, para o sequenciamento (Paired-End 2 x 200 bp HiScan2500). Foram identificados aproximadamente 116.000 transcritos, dos quais 2896 genes tiveram expressão diferencial, 1.184 genes tiveram a expressão aumentada e 1.712 tiveram a expressão diminuída. Foram identificados genes relacionados ao restabelecimento da TD em S. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The desiccation tolerance (TD) in orthodox seeds is acquired during the maturation phase and lost with germination (root protrusion). However, the use of polyethylene glycol (PEG) can reestablish TD in germinated seeds. The aim of this research was to restore tolerance to desiccation in germinated seeds of Solanum lycocarpum and to study the transcriptome and mechanisms associated with this process. Four replicates of 50 germinated seeds with primary root length of 1, 2, 3, 4 and 5 mm were treated with PEG 8000 at -1.7 MPa and maintained at 10 °C for 72 hours and after that period the seeds germinated seeds were dried in a solution of lithium chloride solution (65% RH and 20 °C) until reaching the humidity of 8.7%, as the control treatment, the untreated germinated seeds. Then the germinated seeds were pre-humidified in an atmosphere saturated with water vapor for 24 hours at 20 °C and then submitted to the germination conditions. RNA was extracted and sequenced from 2 mm long primary roots treated with PEG and untreated. Three biological replicates of 100 primary roots were used for each RNA library for sequencing (Paired-End 2 x 200 bp HiScan2500). Approximately 116,000 transcripts were identified, of which 2896 genes had differential expression, 1,184 genes had increased expression and 1,712 had decreased expression. Genes related to the reestablishment of TD in S. lycocarpum were identified, with emphasis on oleosins, LEA14, GOLS1 and EMP1. The desiccation tolerance in S. lycocarpum is governed by a complex of interactions and molecular mechanisms, the main ones being the biological processes and pathways related to lipid metabolism and hormonal responses. / Doutor

ALVES FILHO, João Garcia. Análise transcriptomica e proteômica de sementes de cajueiro (Anacardium occidentale L.) visando aplicações biotecnológicas. 2013. 171 f. Tese (Doutor em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-23T18:20:06Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_jgalvesfilho.pdf: 9659761 bytes, checksum: 210b8d3f56c4d6d39bdfdc54615e7431 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T19:31:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_jgalvesfilho.pdf: 9659761 bytes, checksum: 210b8d3f56c4d6d39bdfdc54615e7431 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T19:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_jgalvesfilho.pdf: 9659761 bytes, checksum: 210b8d3f56c4d6d39bdfdc54615e7431 (MD5) Previous issue date: 2013 / The cashew (Anacardium occidentale L.) is an important Brazilian plant species occurring especially in the northeast region. In nature, there are basically two types of cashew, the common also known as giant, and dwarf cashew which show low size and precocity for fruit production. The fruit of the cashew (cashew-nut) is a source of lipids and proteins, it has been utilized to food in the world. However, the sub-product commercialization of cashew-nut had shown special attention by presence of allergenic proteins. Futhermore, the potentialities of the cashew use are limited due to lack of molecular data. Thus, the present study aimed to establish an overview about transcripts and proteins from cashew-nut through transcriptome and proteome analysis. For this purpose, seeds of the common and dwarf CCP 76 cashew in maturation were used to obtain messenger RNA. After sequencing by Illumina platform with 4x average coverage, we obtained sequences with Phred score above 30. The transcriptome assembly revealed 37,422 and 77,371 contigs, relative to complementary DNA fragment of seeds of the common and dwarf CCP 76 cashew, respectively. The percentage of transcriptome sequences identified by BLAST varied of 15.2 to 45.9% for CCP 76 and common cashew, respectively. The comparative analysis between the two genotypes allowed the identification of tree new polymorphic microsatellites. Additionally, the proteome analysis of seed quiescent of both common cashew and dwarf CCP 76, CCP 09, BRS 226 e BRS 275 genotypes showed presence of six different expressed proteins. In summary, transcriptome and proteome analysis contributed to addition of new molecular data for A. occidentale L., as well as allowed the identification of possible marks with high biotechnological potential. / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma importante espécie vegetal brasileira, ocorrendo especialmente na região Nordeste. Na natureza, existem basicamente dois tipos de cajueiros: o tipo comum, também conhecido como gigante, e o cajueiro anão-precoce, o qual apresenta baixo porte e precocidade na produção de frutos. O fruto do cajueiro (castanha-de-caju) é fonte de lipídeos e proteínas, sendo utilizado como alimento no mundo todo. No entanto, a comercialização de subprodutos da castanha-de-caju tem mostrado atenção especial devido à presença de proteínas alergênicas. Além disso, as potencialidades de uso do cajueiro são limitadas devida a carência de dados moleculares. Assim, o presente trabalho tem como objetivo estabelecer um panorama geral sobre transcritos e proteínas de castanhas de cajueiro por meio de análise transcriptômica e proteômica. Com esta finalidade, sementes em maturação de cajueiro comum e anão CCP 76 foram utilizadas para obtenção de RNA mensageiro. Posterior sequenciamento por plataforma Illumina com cobertura média de 4x, obtiveram-se sequências com qualidade Phred acima de 30. A montagem do transcriptoma revelou 37.422 e 77.371 sequências contíguas, relativa aos fragmentos de DNA complementares de sementes de cajueiro comum e anão CCP 76, respectivamente. O percentual de sequências do transcriptoma identificadas pelo BLAST variou de 15,2 a 45,9% para o cajueiro CCP 76 e comum, respectivamente. Análise comparativa entre os dois genótipos permitiu a identificação de três novos microssatélites polimórficos. Adicionalmente, a análise do proteoma de sementes quiescentes do cajueiro comum, juntamente com os genótipos anão-precoce CCP 76, CCP 09, BRS 226 e BRS 275 mostrou a presença de seis proteínas diferencialmente expressas. Em suma, as análises transcriptômica e proteômica realizadas no presente estudo contribuíram para a adição de novos dados moleculares para A. occidentale L., assim como permitiram a identificação de possíveis marcadores com grande potencial biotecnológico.

A indústria de base florestal é estratégica para o Brasil devido ao seu perfil fortemente exportador. O setor responde pela segunda posição na balança comercial do agronegócio brasileiro, ficando atrás somente da soja em grão. Atualmente, a área ocupada com florestas de eucaliptos no Brasil atinge 1,9 milhões de ha. Diante da importância sócio-econômica que a silvicultura desempenha no mercado brasileiro e do aumento progressivo das áreas plantadas com florestas de Eucalyptus, o grande desafio para o melhoramento do eucalipto está na integração da biotecnologia mais avançada ao seu cultivo, o que compreende a identificação de genes controladores das características de importância econômica e ambiental e a transferência destes genes entre árvores por meio de cruzamentos controlados ou modificação direcionada. Portanto, os objetivos deste estudo foram apresentados em 3 capítulos distintos: I - a identificação de genes expressos em flores de E. grandis em processo de antese; II - o estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores de fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis; e III - seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. No capítulo I é apresentada uma breve fundamentação teórica sobre as flores de E. grandis e a importância do estudo da expressão gênica e da identificação de genes envolvidos em determinados processos metabólicos e fisiológicos das plantas. Nos resultados, apresentados juntamente com a discussão, estão apresentados o conjunto de transcritos identificados e a anotação dos mesmos conforme as bibliotecas geradas. As sequências de genes expressos estão fundamentalmente envolvidas na manutenção do órgão, na senescência e em respostas a estímulos ambientais. Também são mostrados resultados obtidos por RT-qPCR para genes selecionados a partir das anotações cujo perfil de transcrição foi avaliado para as partes da flor, folha e xilema. Ao final do capítulo, é feita uma breve descrição da metodologia e das conclusões referente a este estudo. A partir dos dados anotados dos genes expressos nas bibliotecas de flores e botões florais descritos no primeiro capítulo, foram encontradas algumas famílias de fatores de transcrição, dentre elas, a família Dof, encontrada nas bibliotecas de carpelos/receptáculos florais. Assim, um segundo capítulo foi redigido na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa. Após a fundamentação teórica sobre os fatores Dof em plantas, foram apresentados os resultados obtidos de um estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores destes fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis. Posteriormente, uma quantificação dos níveis de mRNA para alguns dos genes Dof de E. grandis a partir da técnica de RT-qPCR foi realizada. A análise foi realizada para órgãos diferentes da planta e em plântulas submetidas a estresses abióticos e sinalização por reguladores de crescimento vegetais. Os resultados e a discussão deste capítulo também são mostrados em uma única sessão, assim como a descrição da metodologia e as conclusões sobre esta etapa. O terceiro e último capítulo, também apresentado na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa, é composto de um estudo paralelo aos temas citados acima, realizado a partir da seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. Dos 50 genes selecionados e anotados, oito foram selecionados para a validação por RT-qPCR em seis espécies de Eucalyptus e em três órgãos diferentes (flor, folha e xilema). As expressões destes genes candidatos foram comparadas àquelas de sete genes normalizadores tradicionais, usados frequentemente em estudos de avaliação da expressão gênica em plantas. Como nos demais capítulos, as conclusões referentes a este estudo, bem como a metodologia empregada, são apresentadas ao final do capítulo. Na parte final desta tese, constam as conclusões gerais sobre a totalidade do trabalho conduzido. / The forest industry is strategic to Brazil due to its strong export profile. The sector accounts for the second position in the trade brazilian agribusiness balance. Currently, the area planted with Eucalyptus forests in Brazil reached 1.9 million/ha. Given the socioeconomic importance that forestry plays in the brazilian market and the gradual increase in areas planted with Eucalyptus forest, the great challenge for the Eucalyptus breeding is the integration of advanced biotechnology to cultivation, which includes the identification of economic importance genes controlling environmental effects and transfer of genes between trees through intersections controlled or directed modification. The objectives of this study were presented in three distinct chapters: I - the identification of expressed genes in E. grandis flowers in the anthesis process; II – more refined study, mining and identification of genes potentially encoding transcription factors present in the E. grandis genome and III - selection of 50 genes whose expressions were shown to be constitutive in E. grandis xylem and leaves and E. globulus xylem, by DNA microarray hybridization tecnique. In Chapter I, we present a brief theoretical background on the E. grandis flowers and the importance of studying gene expression and identifying genes involved in metabolic and physiological processes of plants. The results, presented transcripts sets identified and annotation the libraries generated. The sequences of expressed genes are mainly involved in organ maintaining, senescence and in responses to environmental stimuli. Also shown are results obtained by RT-qPCR for selected genes from the notes whose transcription profile was assessed for part of the flower, leaf and xylem. At the end of the chapter is a brief description of the methodology and conclusions about this study. From the data recorded in the libraries of genes expressed in flowers and flower buds described in the first chapter, we found some families of transcription factors, among them, the Dof family, found in the libraries of carpel/floral receptacles. Thus, a second chapter was drafted as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology. After the theoretical DOF on the factors in plants, we presented the results of a more refined mining and identification of genes potentially encoding these transcription factors present in the E. grandis genome. Subsequently, a quantification of mRNA levels for some of E. grandis Dof genes from the RT-qPCR was performed. The analysis was performed for different plant organs and in seedlings subjected to abiotic stress signaling and plant growth regulators. The results and discussion of this chapter are also shown in a single session, as well as a description of the methodology and conclusions about this step. The third and final chapter, also presented as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology, is composed of a parallel study to the subjects mentioned above, performed by the selection of 50 genes whose expression showed is constitutive of E. grandis leaves and xylem and E.globulus xylem, by the DNA microarray hybridization tecnique. Of the 50 selected genes and annoted, eight were selected for validation by RT-qPCR in six Eucalyptus species and three different organs (flower, leaf and xylem). The expression of these candidate genes were compared to those of traditional standard-seven genes, often used in evaluation studies of gene expression in plants. As in other chapters, the findings of this study and the methodology employed, are included at the end of the chapter. In the final part of this thesis, contains the general conclusions about the totality of the work conducted.

O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro. / Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.

O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro. / Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.

A indústria de base florestal é estratégica para o Brasil devido ao seu perfil fortemente exportador. O setor responde pela segunda posição na balança comercial do agronegócio brasileiro, ficando atrás somente da soja em grão. Atualmente, a área ocupada com florestas de eucaliptos no Brasil atinge 1,9 milhões de ha. Diante da importância sócio-econômica que a silvicultura desempenha no mercado brasileiro e do aumento progressivo das áreas plantadas com florestas de Eucalyptus, o grande desafio para o melhoramento do eucalipto está na integração da biotecnologia mais avançada ao seu cultivo, o que compreende a identificação de genes controladores das características de importância econômica e ambiental e a transferência destes genes entre árvores por meio de cruzamentos controlados ou modificação direcionada. Portanto, os objetivos deste estudo foram apresentados em 3 capítulos distintos: I - a identificação de genes expressos em flores de E. grandis em processo de antese; II - o estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores de fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis; e III - seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. No capítulo I é apresentada uma breve fundamentação teórica sobre as flores de E. grandis e a importância do estudo da expressão gênica e da identificação de genes envolvidos em determinados processos metabólicos e fisiológicos das plantas. Nos resultados, apresentados juntamente com a discussão, estão apresentados o conjunto de transcritos identificados e a anotação dos mesmos conforme as bibliotecas geradas. As sequências de genes expressos estão fundamentalmente envolvidas na manutenção do órgão, na senescência e em respostas a estímulos ambientais. Também são mostrados resultados obtidos por RT-qPCR para genes selecionados a partir das anotações cujo perfil de transcrição foi avaliado para as partes da flor, folha e xilema. Ao final do capítulo, é feita uma breve descrição da metodologia e das conclusões referente a este estudo. A partir dos dados anotados dos genes expressos nas bibliotecas de flores e botões florais descritos no primeiro capítulo, foram encontradas algumas famílias de fatores de transcrição, dentre elas, a família Dof, encontrada nas bibliotecas de carpelos/receptáculos florais. Assim, um segundo capítulo foi redigido na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa. Após a fundamentação teórica sobre os fatores Dof em plantas, foram apresentados os resultados obtidos de um estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores destes fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis. Posteriormente, uma quantificação dos níveis de mRNA para alguns dos genes Dof de E. grandis a partir da técnica de RT-qPCR foi realizada. A análise foi realizada para órgãos diferentes da planta e em plântulas submetidas a estresses abióticos e sinalização por reguladores de crescimento vegetais. Os resultados e a discussão deste capítulo também são mostrados em uma única sessão, assim como a descrição da metodologia e as conclusões sobre esta etapa. O terceiro e último capítulo, também apresentado na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa, é composto de um estudo paralelo aos temas citados acima, realizado a partir da seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. Dos 50 genes selecionados e anotados, oito foram selecionados para a validação por RT-qPCR em seis espécies de Eucalyptus e em três órgãos diferentes (flor, folha e xilema). As expressões destes genes candidatos foram comparadas àquelas de sete genes normalizadores tradicionais, usados frequentemente em estudos de avaliação da expressão gênica em plantas. Como nos demais capítulos, as conclusões referentes a este estudo, bem como a metodologia empregada, são apresentadas ao final do capítulo. Na parte final desta tese, constam as conclusões gerais sobre a totalidade do trabalho conduzido. / The forest industry is strategic to Brazil due to its strong export profile. The sector accounts for the second position in the trade brazilian agribusiness balance. Currently, the area planted with Eucalyptus forests in Brazil reached 1.9 million/ha. Given the socioeconomic importance that forestry plays in the brazilian market and the gradual increase in areas planted with Eucalyptus forest, the great challenge for the Eucalyptus breeding is the integration of advanced biotechnology to cultivation, which includes the identification of economic importance genes controlling environmental effects and transfer of genes between trees through intersections controlled or directed modification. The objectives of this study were presented in three distinct chapters: I - the identification of expressed genes in E. grandis flowers in the anthesis process; II – more refined study, mining and identification of genes potentially encoding transcription factors present in the E. grandis genome and III - selection of 50 genes whose expressions were shown to be constitutive in E. grandis xylem and leaves and E. globulus xylem, by DNA microarray hybridization tecnique. In Chapter I, we present a brief theoretical background on the E. grandis flowers and the importance of studying gene expression and identifying genes involved in metabolic and physiological processes of plants. The results, presented transcripts sets identified and annotation the libraries generated. The sequences of expressed genes are mainly involved in organ maintaining, senescence and in responses to environmental stimuli. Also shown are results obtained by RT-qPCR for selected genes from the notes whose transcription profile was assessed for part of the flower, leaf and xylem. At the end of the chapter is a brief description of the methodology and conclusions about this study. From the data recorded in the libraries of genes expressed in flowers and flower buds described in the first chapter, we found some families of transcription factors, among them, the Dof family, found in the libraries of carpel/floral receptacles. Thus, a second chapter was drafted as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology. After the theoretical DOF on the factors in plants, we presented the results of a more refined mining and identification of genes potentially encoding these transcription factors present in the E. grandis genome. Subsequently, a quantification of mRNA levels for some of E. grandis Dof genes from the RT-qPCR was performed. The analysis was performed for different plant organs and in seedlings subjected to abiotic stress signaling and plant growth regulators. The results and discussion of this chapter are also shown in a single session, as well as a description of the methodology and conclusions about this step. The third and final chapter, also presented as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology, is composed of a parallel study to the subjects mentioned above, performed by the selection of 50 genes whose expression showed is constitutive of E. grandis leaves and xylem and E.globulus xylem, by the DNA microarray hybridization tecnique. Of the 50 selected genes and annoted, eight were selected for validation by RT-qPCR in six Eucalyptus species and three different organs (flower, leaf and xylem). The expression of these candidate genes were compared to those of traditional standard-seven genes, often used in evaluation studies of gene expression in plants. As in other chapters, the findings of this study and the methodology employed, are included at the end of the chapter. In the final part of this thesis, contains the general conclusions about the totality of the work conducted.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-12T16:32:11Z No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-07T15:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Luciano Procopio da Silva.pdf: 1768563 bytes, checksum: 6f7f3caa7029a384719b7ffd5c5d69a3 (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo patogênico e dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América do Sul. O fungo ocorre na natureza na forma de micélio, na temperatura de 26ºC, e na forma de levedura, na temperatura de 37ºC in vitro, sendo esta a forma encontrada nos tecidos de hospedeiros. A transição dimórfica da forma miceliana para a de levedura parece ser essencial para a patogênese, como também observado para outros fungos patogênicos e dimórficos. O projeto "Genoma Funcional e Diferencial do Fungo P. brasiliensis", realizado sob coordenação de nosso laboratório, foi empreendido a partir do seqüenciamento de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura cultivadas in vitro. No contexto desse trabalho, foi construída uma biblioteca de cDNA a partir do RNA total de P. brasiliensis obtido após seis horas de co-cultivo com células de macrófagos peritoneais murinos, sem qualquer cultivo adicional do fungo in vitro. A análise do perfil transcricional desse fungo a partir dessa biblioteca de cDNA, denominada PbY-MF, visa melhor compreender o padrão de expressão de genes potencialmente importantes para a adaptação e sobrevivência de P. brasiliensis no modelo de infecção. Nesse sentido, esse trabalho iniciou a caracterização do transcriptoma de P. brasiliensis recuperado de macrófagos, pelo seqüenciamento de cDNAs da biblioteca PbY-MF. A partir da submissão das seqüências ao pipeline de análise, um total de 474 ESTs de qualidade (PHRED ³ 20 e tamanho ³ 100 nt), foram geradas e analisadas. Após agrupamento pelo CAP3, essas ESTs foram agrupadas em 16 contigs e 99 singlets. Análises de similaridades empregando os bancos de dados do projeto transcriptoma de P. brasiliensis, GeneBank nr e dbEST, utilizando as ferramentas Blastn e Blastx, foram realizadas. Os resultados dessa análise revelam que 355 ESTs, agrupadas em 4 contigs e 16 singlets, apresentaram similaridades com seqüências já descritas para o fungo P. brasiliensis, sendo a maioria relacionada com genes da maquinaria traducional mitocondrial. Cinco contigs e sete singlets, ainda não descritos em P. brasiliensis, apresentaram similaridades com seqüências de outros organismos, sendo que a maioria também mostrava similaridade com genes mitocondriais que codificam proteínas da cadeia de transporte de elétrons. Das 474 ESTs analisadas no contexto desse trabalho, seis contigs e 63 singlets não apresentaram similaridades com nenhuma seqüência descrita nos bancos de dados empregados nessa análise, correspondendo a genes novos potencialmente específicos de P. brasiliensis. Em adição, nesse trabalho também foi realizada a análise de quatro contigs que apresentam similaridades com o gene de isocitrato liase (icl), o qual codifica uma proteína chave do ciclo do glioxilato, que mostra-se ativado em diferentes modelos de células de mamíferos infectadas por patógenos intracelulares facultativos. Essas contigs foram identificadas no transcriptoma de P. brasiliensis cultivado in vitro. Nesse sentido, foram realizados o seqüenciamento adicional de clones de cDNAs relacionados a essas contigs, análises de similaridade dessas seqüências e experimentos de Southern blot. Os resultados sugerem que três contigs, apresentando similaridade com uma mesma seqüência de isocitrato liase do fungo Coccidioides immitis, representam provavelmente um mesmo transcrito de P. brasiliensis, enquanto a quarta contig apresenta maior similaridade com o gene metilisocitrato liase do fungo Emericella nidulans. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracocidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Dimorphic transition is triggered by a temperature shift from the environmental 26 ºC, in which the fungus is found as a free-living mycelium, to the 37 ºC of the human host, when it changes to the pathogenic yeast form. The dimorphic transition is believed to play an essential role in pathogenesis, as described for other dimorphic pathogenic fungi. The project "Functional and Differential Genomics of the P. brasiliensis fungus", coordinated by our laboratory, has performed the sequencing of cDNA libraries from in vitro grown yeast and mycelium cells, resulting in 19,718 expressed sequence tags (ESTs) from in vitro cultivated yeast (9,941 ESTs) and mycelium (9,777 ESTs). The CAP3 clusterization software has assembled these raw sequence data into 2,655 contigs and 3,367 singlets. In order to better understand the expression of genes potentially involved in P. brasiliensis adaptation and survival in an infection model, in this work we describe the construction of a cDNA library using as template mRNA extracted from a six-hour co-culture of P. brasiliensis yeast cells and murine peritoneal macrophages, named PbY-MΦ. The sequencing of the PbY-MΦ library generated 474 ESTs that suited inclusion criteria of PHRED ≥ 20 and size greater than 100 nucleotides, which were clustered into 16 contigs and 99 singlets. BLAST-analysis against the P. brasiliensis transcritpome project, nr and dbEST databases, grouped 355 ESTs into four contigs and 16 singlets similar to previously described P. brasiliensis sequences, most of them corresponding to components of the mitochondrial translation apparatus. Five contigs and seven singlets, which were not described in P. brasiliensis, were found to be similar to sequences described in other organisms, with most of them implicated in the mitochondrial electron transport chain. Six contigs and 63 singlets were unique in that they had no homology to known sequences. In addition, we have performed a better characterization of four contigs described in the in vitro transcriptome, which were similar to the isocitrate lyase gene (icl), an enzyme of the glyoxylate cycle. Sequencing, similarity analysis and southern blotting experiments of these contigs suggest that three of them correspond to the isocitrate lyase from Coccidioides immitis, while the fourth is related to a methyl-isocitrate lyase gene from Emericella nidulans.

A indústria de base florestal é estratégica para o Brasil devido ao seu perfil fortemente exportador. O setor responde pela segunda posição na balança comercial do agronegócio brasileiro, ficando atrás somente da soja em grão. Atualmente, a área ocupada com florestas de eucaliptos no Brasil atinge 1,9 milhões de ha. Diante da importância sócio-econômica que a silvicultura desempenha no mercado brasileiro e do aumento progressivo das áreas plantadas com florestas de Eucalyptus, o grande desafio para o melhoramento do eucalipto está na integração da biotecnologia mais avançada ao seu cultivo, o que compreende a identificação de genes controladores das características de importância econômica e ambiental e a transferência destes genes entre árvores por meio de cruzamentos controlados ou modificação direcionada. Portanto, os objetivos deste estudo foram apresentados em 3 capítulos distintos: I - a identificação de genes expressos em flores de E. grandis em processo de antese; II - o estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores de fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis; e III - seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. No capítulo I é apresentada uma breve fundamentação teórica sobre as flores de E. grandis e a importância do estudo da expressão gênica e da identificação de genes envolvidos em determinados processos metabólicos e fisiológicos das plantas. Nos resultados, apresentados juntamente com a discussão, estão apresentados o conjunto de transcritos identificados e a anotação dos mesmos conforme as bibliotecas geradas. As sequências de genes expressos estão fundamentalmente envolvidas na manutenção do órgão, na senescência e em respostas a estímulos ambientais. Também são mostrados resultados obtidos por RT-qPCR para genes selecionados a partir das anotações cujo perfil de transcrição foi avaliado para as partes da flor, folha e xilema. Ao final do capítulo, é feita uma breve descrição da metodologia e das conclusões referente a este estudo. A partir dos dados anotados dos genes expressos nas bibliotecas de flores e botões florais descritos no primeiro capítulo, foram encontradas algumas famílias de fatores de transcrição, dentre elas, a família Dof, encontrada nas bibliotecas de carpelos/receptáculos florais. Assim, um segundo capítulo foi redigido na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa. Após a fundamentação teórica sobre os fatores Dof em plantas, foram apresentados os resultados obtidos de um estudo mais refinado de mineração e identificação de genes potencialmente codificadores destes fatores de transcrição presentes no genoma de E. grandis. Posteriormente, uma quantificação dos níveis de mRNA para alguns dos genes Dof de E. grandis a partir da técnica de RT-qPCR foi realizada. A análise foi realizada para órgãos diferentes da planta e em plântulas submetidas a estresses abióticos e sinalização por reguladores de crescimento vegetais. Os resultados e a discussão deste capítulo também são mostrados em uma única sessão, assim como a descrição da metodologia e as conclusões sobre esta etapa. O terceiro e último capítulo, também apresentado na forma de manuscrito de artigo científico a ser submetido ao periódico BMC Plant Biology, em língua inglesa, é composto de um estudo paralelo aos temas citados acima, realizado a partir da seleção de 50 genes cujas expressões mostraram-se constitutivas entre folhas e xilemas de E. grandis e xilema de E. globulus, pela técnica de hibridização de microarranjos de DNA. Dos 50 genes selecionados e anotados, oito foram selecionados para a validação por RT-qPCR em seis espécies de Eucalyptus e em três órgãos diferentes (flor, folha e xilema). As expressões destes genes candidatos foram comparadas àquelas de sete genes normalizadores tradicionais, usados frequentemente em estudos de avaliação da expressão gênica em plantas. Como nos demais capítulos, as conclusões referentes a este estudo, bem como a metodologia empregada, são apresentadas ao final do capítulo. Na parte final desta tese, constam as conclusões gerais sobre a totalidade do trabalho conduzido. / The forest industry is strategic to Brazil due to its strong export profile. The sector accounts for the second position in the trade brazilian agribusiness balance. Currently, the area planted with Eucalyptus forests in Brazil reached 1.9 million/ha. Given the socioeconomic importance that forestry plays in the brazilian market and the gradual increase in areas planted with Eucalyptus forest, the great challenge for the Eucalyptus breeding is the integration of advanced biotechnology to cultivation, which includes the identification of economic importance genes controlling environmental effects and transfer of genes between trees through intersections controlled or directed modification. The objectives of this study were presented in three distinct chapters: I - the identification of expressed genes in E. grandis flowers in the anthesis process; II – more refined study, mining and identification of genes potentially encoding transcription factors present in the E. grandis genome and III - selection of 50 genes whose expressions were shown to be constitutive in E. grandis xylem and leaves and E. globulus xylem, by DNA microarray hybridization tecnique. In Chapter I, we present a brief theoretical background on the E. grandis flowers and the importance of studying gene expression and identifying genes involved in metabolic and physiological processes of plants. The results, presented transcripts sets identified and annotation the libraries generated. The sequences of expressed genes are mainly involved in organ maintaining, senescence and in responses to environmental stimuli. Also shown are results obtained by RT-qPCR for selected genes from the notes whose transcription profile was assessed for part of the flower, leaf and xylem. At the end of the chapter is a brief description of the methodology and conclusions about this study. From the data recorded in the libraries of genes expressed in flowers and flower buds described in the first chapter, we found some families of transcription factors, among them, the Dof family, found in the libraries of carpel/floral receptacles. Thus, a second chapter was drafted as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology. After the theoretical DOF on the factors in plants, we presented the results of a more refined mining and identification of genes potentially encoding these transcription factors present in the E. grandis genome. Subsequently, a quantification of mRNA levels for some of E. grandis Dof genes from the RT-qPCR was performed. The analysis was performed for different plant organs and in seedlings subjected to abiotic stress signaling and plant growth regulators. The results and discussion of this chapter are also shown in a single session, as well as a description of the methodology and conclusions about this step. The third and final chapter, also presented as a manuscript of a scientific paper to be submitted to the journal BMC Plant Biology, is composed of a parallel study to the subjects mentioned above, performed by the selection of 50 genes whose expression showed is constitutive of E. grandis leaves and xylem and E.globulus xylem, by the DNA microarray hybridization tecnique. Of the 50 selected genes and annoted, eight were selected for validation by RT-qPCR in six Eucalyptus species and three different organs (flower, leaf and xylem). The expression of these candidate genes were compared to those of traditional standard-seven genes, often used in evaluation studies of gene expression in plants. As in other chapters, the findings of this study and the methodology employed, are included at the end of the chapter. In the final part of this thesis, contains the general conclusions about the totality of the work conducted.

O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro. / Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.