O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro. / Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.

O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro. / Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.

O algodoeiro sofre o ataque de diversos insetos-praga, sendo o principal o bicudodo- algodoeiro (Anthonomus grandis). Visando alternativas mais eficazes para o controle de insetos, tem-se buscado a transgenia de plantas, por meio da introdução de genes que codificam moléculas entomotóxicas. Entre as diferentes estratégias de engenharia genética utilizadas para controle de insetos-praga, a estratégia envolvendo o silenciamento gênico, pelo uso da interferência mediada por RNA (RNAi), é atualmente bastante promissora e de grande relevância. O trabalho aqui apresentado resultou na geração de uma biblioteca completa de genes expressos de A. grandis, por meio de sequenciamento completo de ESTs, obtidas a partir de diferentes estágios do desenvolvimento do inseto. O pirosequenciamento do transcritoma de A. grandis gerou mais de 500.000 reads e um banco de dados com 20.841 contigs com alta qualidade. Após a montagem e anotação das sequências foram realizadas buscas por genes essenciais do inseto, candidatos ao silenciamento por RNAi. Um desses genes, que codifica a enzima lacase2, foi selecionado e avaliado, mostrando alto potencial para o controle do bicudo do algodoeiro. Esta enzima faz parte do processo de formação e esclerotização da cutícula do inseto. Sua expressão se mostrou quantitativamente maior nas fases mais tardias do ciclo de vida do inseto. Observou-se que a expressão relativa dos transcritos de lacase2 foi altamente reduzida e o desenvolvimento do inseto foi afetado pelo silenciamento gênico. Além da validação do gene de lacase2 para potencial controle do bicudo, este trabalho disponibiliza dados para a escolha de genes de referência para experimentos de quantificação relativa de transcritos por PCR em tempo real em várias partes de larvas e adultos de A. grandis. O conjunto de dados aqui obtidos poderá contribuir enormemente para o agronegócio brasileiro e será de grande importância para a obtenção e geração de eventos de algodão transgênicos resistentes ao bicudo do algodoeiro. / Cotton plants are subjected to the attack of several insect pests. In Brazil, the cotton boll weevil Anthonomus grandis is the most important cotton pest. The use of transgenic plants by introducing genes coding for entomotoxic molecules is one of the recent efficient approaches used in plant pest control. Among those, the use of gene silencing by interference RNA (RNAi) as a technique for insect control is very promising. The work presented in the next pages shows the use of pirosequencing technique for the construction of a cDNA library formed by A. grandis expressed genes in all developmental stages of the insect. The pirosequencing of A. grandis transcriptome resulted in more than 500,000 reads and a data set of high quality 20,841 contigs. After sequence assembly and annotation, the library was screened for insect essential candidate genes for RNAi-mediated gene silencing. One gene, coding for the enzyme laccase2 was selected and has demonstrated high potential for insect control. This enzyme is involved in insect cuticle formation and sclerotization, and the gene was found to be more expressed in the insect pupa and adult developmental stages. Insect development was affected by gene silencing and the relative expression of laccase2 transcripts was highly decreased. Moreover, this work provides data for choosing reference genes to be used in qPCR experiments for several parts of boll weevil larvae and adult organism. The results provided in this work may contribute to Brazilian agribusiness by the potential important generation of genetically modified cotton plants with significant resistance to cotton boll weevil.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-11T13:02:55Z No. of bitstreams: 1 PDF - Ana Lígia Aureliano de Lima e Silva.pdf: 1102869 bytes, checksum: 1e494655ecbebce52aab0ec7be4947d8 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-03-14T18:25:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Ana Lígia Aureliano de Lima e Silva.pdf: 1102869 bytes, checksum: 1e494655ecbebce52aab0ec7be4947d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-14T18:25:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Ana Lígia Aureliano de Lima e Silva.pdf: 1102869 bytes, checksum: 1e494655ecbebce52aab0ec7be4947d8 (MD5) Previous issue date: 2015-04-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The cotton boll weevil is considered a major pest of fruit cotton structures in Brazil, due to severe economic losses occasioned if control measures are not adopted. This pest is widespread in all producing regions of the country, causing severe increases in the cost of production due to the applicant and abusive use of chemical insecticides. Therefore, the development of alternative technologies to the exclusive use of pesticides to control pests and diseases is one of the great challenges of sustainable agriculture and, to be adopted, such technologies should provide economic, environmental and social benefits. The objective of this research was determine the efficient dose of kaolin against the boll weevil, with more coating capacity of cotton canopy and its impact on the photosynthetic capacity of the plant. Two experiments were conducted under field conditions. The first aimed to determine the dose effective of kaolin against the cotton boll weevil and its coating capacity in different parts of the cotton plant. The experimental design was a randomized block with five treatments and four replications. Treatments consisted of spraying with kaolin suspension at doses of (1) 20 g.L -1 ; (2) 40 g.L -1 ; (3) 60 g.L e (5) 100 g.L -1 on cotton plants whenever the number of plants damaged by the weevil had 5% of punctured cotton square with oviposition. A second experiment was conducted to evaluate the physiological behavior of the cotton in response to kaolin applications under field conditions. The experimental design was a randomized block factorial 2 x 3 x 3, represented by the leaves treated with kaolin (T1 = distilled water with kaolin at a dose of 60 g/L and T2 = control, distilled water) three times of the day (H1 = 8h34min to 9h38min); H2 = 10h27min to 11h42min; H3 = 15:50 to 16:49) and three phenological stages of cotton [FF1 = flowering (01.10.14), FF2 = fruiting (10.22.14) and FF3 = production (14/11/14)]. The results obtained in this study allowed the following conclusions: (1) the most efficient kaolin doses in cotton to protect against the damage caused by the cotton boll weevil are the 60 g.L -1 -1 , 80 g.L ; (2) the best value for money is obtained in the cotton spraying with kaolin at a dose of 60 g.L and (3) the kaolin reduces leaf cotton photosynthesis, but this photosynthetic loss is offset by the reduction of canopy temperature. / O bicudo, Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae) é considerado a principal praga de estruturas frutíferas do algodoeiro no Brasil, devido aos severos prejuízos econômicos ocasionados se medidas de controle não forem adotadas. Essa praga encontra-se disseminada em todas as regiões produtoras do país, acarretando aumentos severos no custo de produção devido ao uso recorrente e abusivo de inseticidas químicos. Por isto, o desenvolvimento de tecnologias alternativas ao uso exclusivo de agrotóxicos para o controle de pragas e doenças é um dos grandes desafios da agricultura sustentável e, para que sejam adotadas, tais tecnologias devem apresentar vantagens econômicas, ambientais e sociais. Objetivou-se com esta pesquisa determinar a dose de caulim eficiente contra o bicudo, com maior capacidade de revestimento do dossel do algodoeiro e seu impacto sobre a capacidade fotossintética da planta. Foram conduzidos dois experimentos em condições de campo. O primeiro visou determinar a dose de caulim eficiente contra o bicudo e sua capacidade de revestimento em diferentes partes da planta de algodão. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso com cinco tratamentos e quatro repetições. Os tratamentos consistiram de pulverizações com suspensão de caulim nas doses de (1) 20 g.L -1 ; (2) 40 g.L -1 ; (3) 60 g.L -1 ; (4) 80 g.L -1 e (5) 100 g.L -1 algodoeiro sempre que o número de plantas danificadas pelo bicudo apresentava 5% de botões florais com orifício de oviposição. Um segundo experimento foi conduzido para se avaliar o comportamento fisiológico do algodoeiro em resposta às aplicações de caulim em condições de campo. O delineamento experimental foi de blocos ao acaso em esquema fatorial 2 x 3 x 3, representado pelas folhas tratadas ou não com caulim (T 60 g/L e T 2 1 , sobre plantas de = água destilada com caulim na dose de = testemunha, água destilada), três horários de avaliação ao dia (H 1 = 8h34 min até 9h38min); H 2 = 10h27min até 11h42min; H do algodoeiro [FF 1 3 = 15h50min até 16h49min) e três fases fenológicas = florescimento(01/10/14), FF 2 = frutificação (22/10/14) e FF3= produção (14/11/14)]. Os resultados obtidos nesta pesquisa permitiram inferir as seguintes conclusões: (1) as doses de caulim mais eficientes na proteção de algodoeiros contra os prejuízos provocados pelo bicudo são as de bicudo são as de 60 g.L -1 , 80 g.L -1 e 100 g.L benefício é obtido nas pulverizações de algodoeiros com caulim na dose de 60 g.L -1 ; (2) o melhor custo- caulim reduz a fotossíntese foliar do algodoeiro, mas essa perda fotossintética é compensada pela redução da temperatura do dossel.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-05-04T13:42:40Z No. of bitstreams: 1 PDF - Thiele da Silva Carvalho.pdf: 511949 bytes, checksum: 0f4ebd9e36dd151268ce66e48942d5d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-25T19:30:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Thiele da Silva Carvalho.pdf: 511949 bytes, checksum: 0f4ebd9e36dd151268ce66e48942d5d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-25T19:33:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Thiele da Silva Carvalho.pdf: 511949 bytes, checksum: 0f4ebd9e36dd151268ce66e48942d5d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-25T19:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Thiele da Silva Carvalho.pdf: 511949 bytes, checksum: 0f4ebd9e36dd151268ce66e48942d5d7 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The cotton boll weevil, Anthonomusgrandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), is a very important pest for the Brazilian cotton due to the injuries caused on the squares, flowers and bolls. These injuries reduce the production and are responsible for causing great economic losses to the farmer. Among the alternatives for the management of this pest can highlight the control tactics based on plant resistance to insects. This research aimed to determine the morphophysiological mechanism involved in resistance of some primitive races of cotton against boll weevil. The work were conducted in the field, in an area infested by the bolls weevils, in the greenhouse and in the laboratory of Pathology and Molecular Biology of Insects at EmbrapaCotton, municipality of Campina Grande, state of Paraíba. Two experiments were conducted. The first experiment aimed to select the most promising lines for resistance to boll weevil among the lines TB 15, TB 41, TB 75, TB 80, TB 85, TB 87, TB 90, TB 91 originating fromprimitive races of cotton and BRS 187 8H (control).The experimental design was randomized blocks with nine treatments and 4 repetitions. The treatments were represented by lines and cultivar cited cotton. Data were submitted to analysis of variance a nd the means compared by Tukey test at 5% probability. Pearson correlation coefficients were estimated between the number of punctured squares to feed and oviposition by the boll weevil and the 2 average number of trichomes and gossypol glands per cm leaf, height and diameter of the cotton rods with 120 days old. The second experiment aimed at determining the preference for feeding and oviposition of boll weevil on the squares of the six most promising lines selected in the first experiment in test with and without chance of choice.In the choice test was used completely randomized design in a factorial scheme with six cotton lines (G1=TB 90, G2= TB87, G3= TB 80; G4= TB 75; G5= TB 41 and G6= Grandless) nine hours evaluation (15 min, 30 min, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 12 hours and 24 hours) and ten replicates. In the test no choice, the experimental design was completely randomized, with five treatments, represented by boll weevil adults fed with cotton squares of the same lines of cotton used in the test of choice except to cultivate Grandless and five replications.The average number of trichomes and 2 2 gossypol glands per cm and teeth on bracts and the gossypol glands per cm on the sepals and of the nectaries in squares of cotton lines was determined to establish a correlation with the damage caused by feeding and oviposition of boll weevil on the squares. Data from tests with and without choice were subjected to analysis of variance (ANOVA) at 5% probability and the averages compared by Tukey test at 5% probability.In the field,the less preferred cotton line for ovipositionwasTB80. In the test-choice, the cottonlinewith smaller number of the boll weevil and punctured squares by feedingwasTB41. Under no chance of choice, the cultivarsTB80andTB41 wereless preferredfor food and line TB90showedsmaller number of punctured squares by oviposition.TheMorphophysiologicalmechanismsofresistanceprimitive racetested againstthe boll weevilare related tominor amounts of glands of the gossypol andnectariespresent, respectively, in the leaves and at the base of square. / O bicudo, AnthonomusgrandisBoheman (Coleoptera: Curculionidae), é uma praga de grande importância para a cotonicultura brasileira em função das injúrias provocadas sobre os botões florais, flores e maçãs do algodoeiro. Entre as alternativas para o manejo dessa praga pode-se destacar a tática de controle baseada na resistência de plantas aos insetos. Objetivou -se determinar o mecanismo morfofisiológico envolvido na resistência de algumas raças primitiva s de algodão ao bicudo. Foram realizados dois experimentos. O primeiro experimento visou selecionar as linhagens mais promissoras quanto à resistência ao bicudo entre as linhagens TB15, TB41, TB75, TB80, TB85, TB87, TB90, TB91 oriundas de raças primitivas de algodoeiros e a cultivar BRS 187 8H (testemunha). O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, com nove tratamentos e 4 repetições. Os tratamentos foram representados pelas linhagens e a cultivar de algodoeiros citadas. O segundo experimento visou determinar a preferência para alimentação e oviposição do bicudo sobre os botões florais das seis linhagens mais promissoras selecionadas no primeiro experimento em teste com e sem chance de escolha. No teste com escolha, utilizou - se delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial com seis linhagens de algodoeiro (G1= TB90; G2= TB87; G3= TB80; G4= TB75; G5 = TB41 e G6= Grandless), nove horários de avaliação (15 min, 30 min, 1 hora, 2horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas e 24 horas) e dez repetições. No teste sem chance de escolha, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos, representados por adultos do bicudo alimentados com botões florais das mesmas linhagens de algodoeiros utilizadas no te ste de escolha, exceto a cultivar Grandless e cinco repetições.Os dados de ambos os experimentos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey(P=0,05), utilizando-se o Sistema de Análises Estatíssticas e Genéticas (SAEG) da Universidade Federal de Viçosa. Foram estimados no experimento de seleção de linhagens de algodoeiros resistentes ao bicudo, os coeficientes de correlação de Pearson entre o número de botões florais com orifício de alimentação e oviposição pelo bicudo e os números médios de tricomas e de glândulas de 2 gossipol por cm das folhas e altura e diâmetro das hastes das plantas de algodoeiro com 120 dias de idade. No ensaio de preferência de alimentação e oviposição do bicudo foram estimados os coeficientes de correlação de Pearson entre o número de botões florais com orifício de alimentação e oviposição pelo bicudo e os números médios de tricomas e de glândulas de 2 2 gossipolpor cm e dos dentes nas brácteas, de glândulas de gossipol por cm nas sépalas e o de nectários nos botões florais das linhagens de algodoeiros.No campo, a linhagem de algodoeiro menos preferida para oviposição foi TB80. No teste de chance de escolha, a linhagem de algodoeiro com menor número de bicudos e de orifícios de alimentação foi TB41. Sob condições de confinamento, as cultivares TB80 e TB41 foram menos preferidas para alimentação enquanto que a linhagem TB90 apresentou menor número de orifícios de oviposição. Os mecanismos morfofisiológicos de resistência de raças primitivas testadas contra o bicudo estão relacionados às menoresquantidades de glândulas de gossipole de nectários presentes, respectivamente, nas folhas e na base dos botões florais.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-28T16:30:21Z No. of bitstreams: 1 Roberio Carlos dos Santos Neves.pdf: 1072686 bytes, checksum: 1338298507600f310219a24b665f0946 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T16:30:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roberio Carlos dos Santos Neves.pdf: 1072686 bytes, checksum: 1338298507600f310219a24b665f0946 (MD5) Previous issue date: 2010-02-01 / According to cotton crop diagnostic in the region of Semiarid, the pest occurrence is one of the most important hold back issue for the development of this crop. Among the cotton pests, the boll weevil Anthonomus grandis Boh. (Col.: Curculionidae) is considered the most important pest of cotton in this region where is low the adoption of appropriate pest management practices. Thus, this study investigated the impact of picking up reproductive structures falling on the ground and the adoption of pruning plant terminals to discard reproductive structures on boll weevil population. The studies were conducted in two localities and using different cotton varieties. In Paudalho County, PE, was set up a field study with four cotton varieties of white and colored fibers to define the appropriate age of pruning plant top. The results show that pruning plant top when plants exhibiting 50% of mature bolls or opening the first boll did not affect the yield parameters, but pruning plants with 50% of mature bolls took out more unproductive squares than plant at age of opening bolls. In Surubim County, PE, the adoption of pruning plants with 50% of mature bolls and pickivarieties BRS 201 of white fibers and BRS Rubi of brown fibers. The adoption of these practices resulted in taking out large number of insects from the fields, but not enough to drop the boll weevil population bellow economic threshold level within the same season due to the high level of infestation in the region. In the microparcels with caged plants in the field and monitored bollng up falling reproductive structures were studied using theweevil infestation, was found that the adoption of picking falling reproductive structures, pruning plant tops and both practices together reduced boll weevil population at the end of the experiment at rate of 2.8, 2.5 and 4.8 times, respectively. Thus, the adoption of these practices simultaneously, reducing the boll weevil population at rate of 4.8 times might cause significant effects on population between seasons and, hence, on that population returning to cotton fields in the next cotton season. / De acordo com o diagnóstico realizado sobre a cotonicultura no Semi-Árido, o ataque de pragas é indicado como um dos principais entraves para o desenvolvimento da atividade na região. Entre as pragas, o bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis Boh. (Col.: Curculionidae) é considerado praga limitante ao cultivo do algodoeiro nesta região onde é baixo o índice de adoção de tecnologia apropriada para o seu controle. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a realização de poda apical e o impacto da catação de estruturas caídas ao solo e a realização da poda apical de estruturas que não abrirão capulhos na população do bicudo. Os estudos foram realizados em duas localidades e empregou diferentes variedades. Em Paudalho, PE, inicialmente, foi estabelecida a idade da planta para a realização da poda apical empregando quatro variedades de algodão, sendo uma de fibra branca e três de fibras coloridas para posteriormente, a sua aplicação. Foi definido que a poda apical nas idades: 50% de maçãs maduras prestes a abrirem os capulhos e primeiro capulhos abertos, não interferiram com a produção, mas a poda com 50% de maçãs maduras retira mais botões florais não produtivos. EmSurubim, PE, a adoção da poda apical de plantas com 50% de maçãs maduras e catação foram adotadas empregando as variedades BRS 201 de fibra branca e BRS Rubi de fibra marrom. Os resultados demonstram que embora se retire considerável número de insetos mediante a poda ecatação, estas práticas não foram suficientes para a redução da população do bicudo a níveis de infestação abaixo do nível de dano econômico durante a mesma safra, em virtude da alta pressão de infestação da praga na região. O emprego de plantas confinadas e infestação controlada do bicudo em microparcelas foi observado que a adoção da catação, poda apical e catação mais a poda apical juntas reduzem o crescimento populacional do bicudo em relação a não adoção das práticas na ordem de 2,8; 2,5 e 4,8 vezes, respectivamente. Assim, espera-se que esta redução populacional surta efeito na população do bicudo na entressafra e, conseqüentemente, recolonizando as lavouras na safra subsequente.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5158_1.pdf: 1219168 bytes, checksum: 88c2523b7802f1a2d1804b141d7f6de0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae amplamente distribuídos em todas as regiões do mundo podem ser isolados de insetos, solo e de outros substratos. Essas espécies apresentam variabilidade genética e habilidades sobre diferentes insetos-praga. Patogenicidade e virulência sobre diversos artrópodes têm sido observadas com a variação de atividades enzimáticas e características genéticas dos isolados. A ação desses agentes está relacionada com as condições climáticas, causando epizootias em população de insetos e observado o controle biológico de Coleoptera, Hemiptera, Lepdoptera, Isoptera e de outras importantes pragas no Brasil e no mundo. Este trabalho teve por objetivos avaliar a ação de patogenicidade, viabilidade e virulência das linhagens de B. bassiana, M. anisopliae var. anisopliae e M. anisopliae var. acridum sobre ovos, larvas e adultos antes e após reisoladas de Anthonomus grandis (Boheman) (Coleoptera: Curculionidae), importante praga do algodão, avaliadas em condições de laboratório, visando o desenvolvimento de estratégias para o controle biológico da praga. Os resultados apresentados neste trabalho confirmaram que B. bassiana, M. anisopliae var. anisopliae e M. anisopliae var. acridum têm ação patogênica, elevada viabilidade sobre o bicudo-do-algodoeiro e significante virulência após reisolados das diferentes fases do inseto, podendo ser usados contra o inseto adulto em programas de controle biológico, proporcionando uma importante alternativa de controle contra A. grandis

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Atualmente sÃo liberadas para comercializaÃÃo no mercado agrobiotecnolÃgico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodÃo expressando proteÃnas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistÃncia ao ataque de insetos. Contudo, essas proteÃnas sÃo ativas contra lepidÃpteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira à um coleÃptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, tÃm-se feito um grande esforÃo na busca por novas molÃculas Cry ativas contra coleÃpteros. Utilizando tÃcnicas de evoluÃÃo molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteÃna mutante Cry8Ka5, que à vÃrias vezes mais tÃxica contra o bicudo do que a proteÃna original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleÃpteros, Cry8Ka5 està sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodÃo Bt, bem como de outras culturas Bt de importÃncia econÃmica. No entanto, como parte das exigÃncias legais para a liberaÃÃo comercial de uma planta transgÃnica, essa proteÃna recombinante deve ser testada quanto a sua biosseguranÃa alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergÃnicos, tÃxicos e/ou antimetabÃlicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliaÃÃo de BA da proteÃna mutante Cry8Ka5 e da proteÃna Cry1Ac, jà incorporada em vÃrias culturas Bt comercializadas. A Ãltima foi utilizada como proteÃna controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seÃÃo do trabalho. Nesse Ãmbito, a avaliaÃÃo de BA proposta cobriu desde as exigÃncias legais atà a execuÃÃo de metodologias, atà entÃo, nunca propostas para avaliaÃÃo de seguranÃa de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capÃtulos. O CapÃtulo 1 objetivou realizar uma revisÃo da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteÃnas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislaÃÃo vigente em BA de plantas GM. Jà o CapÃtulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 atravÃs do mÃtodo de duas etapas baseado em pesos de evidÃncia que, por sua vez, atende a todas as recomendaÃÃes da CTNBio. Neste caso, a proteÃna Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares jà foram realizadas com essa molÃcula. Baseando-se nos mÃtodos oficiais, à possÃvel concluir que nÃo à esperado qualquer risco associado ao consumo da proteÃna Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histÃrico de uso seguro; 2. A proteÃna Cry8Ka5 nÃo mostrou similaridade significativa de sua sequÃncia de aminoÃcidos primÃria com proteÃnas alergÃnicas, tÃxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteÃnas Cry mostraram possuir modo de aÃÃo bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptÃvel à digestÃo em fluÃdo gÃstrico simulado; 5. A proteÃna Cry8Ka5 nÃo causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteÃna/Kg de peso corpÃreo, via oral, dose Ãnica). Por sua vez, o CapÃtulo 3 objetivou avaliar a proteÃna Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotÃxicos em uma sÃrie de testes clÃssicos e alternativos, alÃm de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteÃnas nÃo causaram efeitos cito- ou genotÃxicos em linfÃcitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 Âg/mL em todos os testes), nÃo promoveram hemÃlise em suspensÃes de eritrÃcitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 Âg/mL para todas as espÃcies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alteraÃÃes na topografia de membrana celular de eritrÃcitos humanos do tipo O, na concentraÃÃo de 1.000 Âg/mL, detectadas via microscopia de forÃa atÃmica. AlÃm disso, as proteÃnas Cry8Ka5 e Cry1Ac nÃo apresentaram citotoxicidade elevada contra naÃplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 Âg/mL, respectivamente) e nÃo inibiram o crescimento de quatro cepas de bactÃrias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 Âg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o CapÃtulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteÃnas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um âpoolâ de peptÃdeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestÃo sequencial in vitro, sobre o perfil de expressÃo gÃnica de cÃlulas de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cÃlon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alteraÃÃes no perfil de expressÃo gÃnica das cÃlulas Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitÃlio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentraÃÃo (100 Âg/mL). Nos testes de exposiÃÃo com cÃlulas MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteÃna Cry1Ac causou alteraÃÃes significativas no padrÃo de expressÃo gÃnica. Contudo, esse efeito nÃo foi detectado apÃs tratamento dessas cÃlulas com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condiÃÃes reais de exposiÃÃo Ãs molÃculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos trÃs Ãltimos capÃtulos mostraram-se bastante Ãteis e, apÃs tudo que foi exposto, foi possÃvel confirmar o carÃter inÃcuo da proteÃna Cry1Ac, bem como concluir que a proteÃna Cry8Ka5 à uma ferramenta biotecnolÃgica segura para o desenvolvimento de plantas de algodÃo Bt para conferir resistÃncia ao ataque do bicudo-do-algodoeiro. / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 Âg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 Âg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 Âg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 Âg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 Âg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 Âg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 Âg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack.

FARIAS, D. F. Biossegurança alimentar de proteínas Cry: dos métodos clássicos à era ômica. 2013. 242 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T21:13:54Z No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 µg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 µg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 µg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 µg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 µg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 µg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 µg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack. / Atualmente são liberadas para comercialização no mercado agrobiotecnológico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodão expressando proteínas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistência ao ataque de insetos. Contudo, essas proteínas são ativas contra lepidópteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira é um coleóptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, têm-se feito um grande esforço na busca por novas moléculas Cry ativas contra coleópteros. Utilizando técnicas de evolução molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteína mutante Cry8Ka5, que é várias vezes mais tóxica contra o bicudo do que a proteína original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleópteros, Cry8Ka5 está sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodão Bt, bem como de outras culturas Bt de importância econômica. No entanto, como parte das exigências legais para a liberação comercial de uma planta transgênica, essa proteína recombinante deve ser testada quanto a sua biossegurança alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergênicos, tóxicos e/ou antimetabólicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliação de BA da proteína mutante Cry8Ka5 e da proteína Cry1Ac, já incorporada em várias culturas Bt comercializadas. A última foi utilizada como proteína controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seção do trabalho. Nesse âmbito, a avaliação de BA proposta cobriu desde as exigências legais até a execução de metodologias, até então, nunca propostas para avaliação de segurança de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capítulos. O Capítulo 1 objetivou realizar uma revisão da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteínas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislação vigente em BA de plantas GM. Já o Capítulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 através do método de duas etapas baseado em pesos de evidência que, por sua vez, atende a todas as recomendações da CTNBio. Neste caso, a proteína Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares já foram realizadas com essa molécula. Baseando-se nos métodos oficiais, é possível concluir que não é esperado qualquer risco associado ao consumo da proteína Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histórico de uso seguro; 2. A proteína Cry8Ka5 não mostrou similaridade significativa de sua sequência de aminoácidos primária com proteínas alergênicas, tóxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteínas Cry mostraram possuir modo de ação bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptível à digestão em fluído gástrico simulado; 5. A proteína Cry8Ka5 não causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteína/Kg de peso corpóreo, via oral, dose única). Por sua vez, o Capítulo 3 objetivou avaliar a proteína Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotóxicos em uma série de testes clássicos e alternativos, além de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteínas não causaram efeitos cito- ou genotóxicos em linfócitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL em todos os testes), não promoveram hemólise em suspensões de eritrócitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL para todas as espécies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alterações na topografia de membrana celular de eritrócitos humanos do tipo O, na concentração de 1.000 µg/mL, detectadas via microscopia de força atômica. Além disso, as proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac não apresentaram citotoxicidade elevada contra naúplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 µg/mL, respectivamente) e não inibiram o crescimento de quatro cepas de bactérias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 µg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o Capítulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um “pool” de peptídeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestão sequencial in vitro, sobre o perfil de expressão gênica de células de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cólon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alterações no perfil de expressão gênica das células Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitélio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentração (100 µg/mL). Nos testes de exposição com células MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteína Cry1Ac causou alterações significativas no padrão de expressão gênica. Contudo, esse efeito não foi detectado após tratamento dessas células com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condições reais de exposição às moléculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos três últimos capítulos mostraram-se bastante úteis e, após tudo que foi exposto, foi possível confirmar o caráter inócuo da proteína Cry1Ac, bem como concluir que a proteína Cry8Ka5 é uma ferramenta biotecnológica segura para o desenvolvimento de plantas de algodão Bt para conferir resistência ao ataque do bicudo-do-algodoeiro.

Submitted by Paula Castanho Borges (paulacastanhob@gmail.com) on 2018-07-18T19:31:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Paula DEFINITIVO.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-19T11:07:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 borges_pc_me_jabo.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 borges_pc_me_jabo.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) Previous issue date: 2018-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida das proteínas Cry1Ia10 e Cry8 contra larvas de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), buscando por potencial sinérgico. Para tanto, o gene cry8 foi amplificado por PCR a partir de um clone previamente construído, obtendo-se um fragmento de aproximadamente 3531 pb e subclonado no vetor de expressão pET-SUMO. Para a expressão dos genes cry1Ia10 e cry8, os DNAs recombinantes foram inseridos em células de Escherichia coli BL21 (DE3) e induzidos por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), resultando em proteínas de 94 kDa e 143 kDa, respectivamente, visualizadas em SDS-PAGE. As proteínas foram quantificadas através do software ImageQuant TL 8.1” (GE Healthcare), para que fosse possível a realização dos cálculos de diluição nas respectivas concentrações incorporadas à dieta artificial, a fim de estimar a CL50 e CL90 das duas proteínas testadas sozinhas e em conjunto. Com base na sequência de aminoácidos de proteínas da classe Cry8, análises filogenéticas foram realizadas para investigar proximidade evolutiva da proteína Cry8 utilizada neste trabalho com as demais proteínas na mesma classe. Através dessas análises, sugerimos que a proteína em questão pertence à subclasse Cry8Pa devido a elevada proximidade filogenética e similaridade com a proteína Cry8Pa2. Observou-se que as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 apresentaram ação inseticida contra larvas neonatas de A. grandis, obtendo-se as CL50 de 7,232 µg ml-1 e 4,422 µg ml-1 para Cry1Ia10 e Cry8 respectivamente. Quando combinadas as proteínas a CL50 é reduzida para 2,664 µg ml-1 e CL90 para 13,535 µg ml-1 apresentaram sinergismo, potencializando a ação inseticida das mesmas. Este estudo conclui que larvas de A. grandis são suscetíveis as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 e que a combinação entre elas aumenta a eficiência de controle, sugerindo que plantas piramidadas com estes genes são de interesse agronômico para o controle de A. grandis possibilitando o retardo do desenvolvimento de insetos resistentes. / The objective of this work was to evaluate the insecticidal effect of Cry1Ia10 and Cry8 proteins against Anthonomus grandis Boheman larvae (Coleoptera: Curculionidae), searching for synergistic potential. To do so, the cry8 gene was amplified by PCR from a previously constructed clone, obtaining a fragment of approximately 3531 bp and subcloned into the pET-SUMO expression vector. For the expression of the cry1Ia10 and cry8 genes, the recombinant DNAs were inserted into Escherichia coli BL21 (DE3) and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) cells, resulting in 94 kDa and 143 kDa proteins, respectively, visualized on SDS-PAGE. The proteins were quantified using ImageQuant TL 8.1 software (GE Healthcare) to allow the calculation of dilution in the respective concentrations incorporated into the artificial diet in order to estimate the LC50 and CL90 of the two proteins tested alone and together. Based on the amino acid sequence of Cry8 class proteins, phylogenetic analyzes were performed to investigate evolutionary proximity of the Cry8 protein used in this work with the other proteins in the same class. Through these analyzes, we suggest that the protein in question belongs to the subclass Cry8Pa due to its high phylogenetic proximity and similarity to the Cry8Pa2 protein. It was observed that the proteins Cry1Ia10 and Cry8 showed insecticidal action against neonatal larvae of A. grandis, obtaining the LC50 of 7.232 μg ml-1 and 4.422 μg ml-1 for Cry1Ia10 and Cry8 respectively. When combined the proteins at LC50 is reduced to 2,664 μg ml-1 and CL90 to 13,535 μg ml1 showed synergism, potentiating the insecticidal action of the same. This study concludes that A. grandis larvae are susceptible to Cry1Ia10 and Cry8 proteins and that the combination between them increases control efficiency, suggesting that pyramidal plants with these genes are of agronomic interest for the control of A. grandis, allowing the development of resistant insects.