A atrazina, um herbicida triazínico amplamente utilizado no controle de ervas daninhas, é um potencial contaminante ambiental, e possui como principal via de degradação uma via biológica. A linhagem Pseudomonas sp. ADP é o micro-organismo de referência no processo de degradação da atrazina em ambientes contaminados, pois contém em seu genoma os genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE e atzF, os quais codificam as enzimas responsáveis pelo processo de degradação. Bactérias gram-positivas também possuem capacidade para degradar a atrazina, mas iniciam a via de degradação através do gene trzN, análogo ao atzA. O objetivo do presente trabalho foi obter e analisar isolados bacterianos e consórcios formados por duas ou mais bactérias com capacidade para degradação completa do herbicida atrazina, como também analisar os efeitos da atrazina na comunidade bacteriana do solo. Duas bactérias gram-negativas, A01 e A02, foram isoladas de amostras de solo e foram identificadas como pertencentes aos gêneros Achromobacter e Pseudomonas, respectivamente, através do sequenciamento do gene 16S rRNA. Ambos os micro-organismos apresentaram potencial para biodegradação da atrazina em meio sólido, mas somente o isolado Pseudomonas sp. apresentou todos os genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE e atzF, que codificam as enzimas da via completa de degradação da atrazina. O isolado Achromobacter sp. apresentou somente os genes atzA, atzB e atzC, que representam a via inicial de degradação da atrazina até a formação de ácido cianúrico como metabólito. Um ensaio utilizando o método Southern Blot foi realizado para verificar se os genes atz detectados nos isolados do estudo são plasmidiais, sendo que apenas o isolado Pseudomonas sp. apresentou plasmídeo. A expressão dos genes atzA, atzB, atzC e atzD foi avaliada pelo método Northern Blot, contudo apenas o isolado Pseudomonas sp. apresentou expressão diferencial após tratamento com atrazina. Análises em HPLC/DAD e LC-MS/MS demonstraram que o isolado Pseudomonas sp. apresenta um perfil de degradação da atrazina semelhante ao perfil do micro-organismo padrão Pseudomonas sp. ADP, sendo apto a degradar 99% de atrazina in vitro em 24 horas. Já o isolado Achromobacter sp. apresentou um perfil de degradação lento, com início do processo após 24 horas. Os três metabólitos iniciais formados pela degradação da molécula de atrazina foram detectados em amostras contendo tanto o isolado Pseudomonas sp. quanto o isolado Achromobacter sp. O consórcio bacteriano composto pelos dois isolados deste estudo não apresentou eficiência de degradação superior às culturas puras. Por fim, um experimento de campo foi realizado com o objetivo de analisar os efeitos da atrazina na comunidade bacteriana do solo. O herbicida atrazina foi aplicado ao solo e amostras foram coletadas para análise através das técnicas de qPCR e Sequenciamento de Nova Geração. Foi possível observar que a abundância dos genes responsáveis pelo início da via de degradação da atrazina se altera ao longo do tempo, sendo que o aumento mais expressivo foi observado no gene trzN, comumente encontrado em bactérias gram-positivas com capacidade para degradar a atrazina. O sequenciamento do gene 16S rRNA indicou que a aplicação de atrazina ao solo não provocou mudanças significativas na comunidade bacteriana. As amostras apresentaram alta diversidade antes e após o tratamento com atrazina e a análise ii da abundância relativa mostrou pequenas diferenças na abundância de famílias após quatro e oito semanas de aplicação da atrazina ao solo. Assim, é possível sugerir que a aplicação do herbicida atrazina ao solo nas doses recomendadas não provoca danos significativos na estrutura da comunidade bacteriana do solo. / Atrazine, a triazine herbicide widely used to control broadleaf weeds, is a potential contaminant of soils, groundwater, rivers, lakes and oceans. Its main route of degradation is a biological pathway. Pseudomonas sp. ADP is a standard bacterium in the process of atrazine mineralization in contaminated environments, because it possesses a plasmid that contains the genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE and atzF, which encode the enzymes responsible for the atrazine degradation process. Gram-positive bacteria also have the ability to degrade atrazine, but the degradation starts through the trzN gene, wich is analogue to atzA. The aim of the present work was to obtain and analyze a bacterial isolate or a consortium formed by two or more bacteria capable of completely degrade the herbicide atrazine and to analyze the effects of atrazine on the soil bacterial community. Two gram-negative microorganisms, A01 and A02, were isolated from soil samples and were identified as Achromobacter sp. and Pseudomonas sp., respectively, through the sequencing of the 16S rRNA gene. Both microorganisms showed potential to degrade atrazine on solid medium, but only the isolate Pseudomonas sp. presented the genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE and atzF that are essential for the biodegradation process. Achromobacter sp. presented only the atzA, atzB and atzC genes, which represent the initial pathway of atrazine degradation that leads to the formation of cyanuric acid. An assay using Southern Blot was performed to verify if the atz genes detected in the isolates were located on plasmid, however only Pseudomonas sp. showed a plasmid. The atz gene expression was evaluated through Northern Blot methodology, but only Pseudomonas sp. showed differential expression after atrazine induction. Analyzes in HPLC/DAD and LC-MS/MS demonstrated that the isolate Pseudomonas sp. presents an atrazine degradation profile similar to the profile of Pseudomonas sp. ADP and is capable of degrading 99% of atrazine in vitro. The strain Achromobacter sp. presented a slow degradation profile and started the degradation process after 24 hours of incubation. The three initial metabolites formed after atrazine degradation were detected in samples containing both Pseudomonas sp. and Achromobacter sp. The bacterial consortium composed of the two isolates of this study did not show higher degradation efficiency than pure cultures. Lastly, a field experiment was performed in order to study the effects of atrazine on the soil bacterial community. The herbicide atrazine was applied to the soil and samples were collected to be analysed using qPCR and Next Generation Sequencing. It was possible to observe that the abundance of the atz genes that initiate the degradation process is changed over time. A significant increase was observed on trzN, which is commonly found in gram-positive bacteria that is capable of degrading atrazine. 16S rRNA gene sequencing indicated that atrazine application to soil do not cause significant changes in the bacterial community. Soil samples presented high diversity before and after atrazine treatment and the relative abundance analysis showed slight differences in families abundance after four and eight weeks of atrazine application to soil. Therefore, the results suggest that the use of atrazine in recommended doses does not cause significant damage to the structure of the soil bacterial community.

A evolução da vida na terra foi possível graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e comportamental desses indivíduos. A retina exerce função de suma importância nesse processo através da percepção da informação fótica que possibilita o ajuste dos ritmos circadianos. Nesse tecido, o glutamato apresenta um importante papel tanto na transmissão da informação fótica direcionada ao processo de formação de imagem quanto nos ajustes dos relógios biológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar como o glutamato, aplicado por períodos diferentes (6 e 12h), é capaz de modular a expressão dos genes de relógio na retina de Gallus gallus. Através de diferentes protocolos que envolveram a administração de glutamato na concentração de 100μM por 6 e 12 horas e em diferentes repetições (1 e 3 pulsos) avaliou-se através de PCR quantitativo a expressão dos genes Clock, Per2 e Bmal1. Os diferentes genes de relógio na retina de Gallus gallus apresentam diferentes respostas frente às trocas de meio e frente ao tratamento com o glutamato. O gene Clock responde com ativação da transcrição para ambos os tratamentos, de forma dependente da repetição dos estímulos. Já para o gene Per2 o tratamento com glutamato impõe uma oscilação de expressão com um ritmo ultradiano, enquanto que as trocas de meio não determinam alterações na transcrição. A expressão do gene Bmal1 não é afetada nem por trocas de meio, nem por glutamato. Novos estudos devem ser fomentados no sentido de se elucidar as vias pelas quais o glutamato leva ao perfil de oscilação observado e qual o mecanismo pelo qual a repetição de trocas de meio atua como sinalizador para o estabelecimento da sincronização celular / The evolution of life on earth was possible thanks to the development of precise temporal mechanisms to adjust physiological processes to environmental cycles, thus promoting gains in the individual adaptive and behavioral ability. The retina plays a very important role of paramount importance in this process through the perception of photic information that allows the adjustment of circadian rhythms. In this tissue, glutamate functions in the transmission of photic information directed to both image formation and biological clock entrainment. The aim of this study was to evaluate how glutamate, applied for different periods (6 and 12h), is able to modulate the expression of the clock genes in the retina of Gallus gallus. Using different protocols involving the administration of 100μM glutamate for 6 and 12 hours and with different repetitions (1 and 3 pulses) the expression of Clock, Per2 and Bmal1 genes was evaluated by quantitative PCR. Clock gene responds with activation of transcription to both treatments depending on the repetition of the stimulus. As for Per2 gene, glutamate treatment imposes an oscillation with an ultradian expression rhythm, whereas medium changes do not affect its transcription. The expression of Bmal1 gene is not affected by either medium changes or glutamate. Further studies should be encouraged in order to elucidate the pathways by which glutamate leads to observed oscillation profile, and which mechanism triggered by the repetition of medium changes acts as signal to establish cell synchronization

Com o advento da tecnologia de microarray, uma grande quantidade de dados de expressão gênica encontra-se disponível. Após a extração das taxas de expressão dos genes, técnicas de formação de clusters são utilizadas para a análise dos dados. Diante da diversidade do conhecimento que pode ser extraído dos dados de expressão gênica, existe a necessidade de diferentes técnicas de formação de clusters. O modelo dinâmico desenvolvido em (Zhao et. al. 2003a) apresenta diversas características interessantes para o problema de formação de clusters, entre as quais podemos citar: a não necessidade de fornecer o número de cluster, a propriedade de multi-escala, serem altamente paralelos e, principalmente, permitirem a inserção de regras e mecanismos mais complexos para a formação dos clusters. Todavia, este modelo apresenta dificuldades em determinar clusters de formato e tamanho arbitrários, além de não realizar a clusterização hierárquica, sendo estas duas características desejáveis para uma técnica de clusterização. Neste trabalho, foram desenvolvidas três técnicas para superar as limitações do modelo dinâmico proposto em (Zhao et. al. 2003a). O Modelo1, o qual é uma simplificação do modelo dinâmico original, porém mais eficiente. O Modelo2, que a partir da inserção de um novo conjunto de elementos no modelo dinâmico, permite a formação de clusters de formato e tamanho arbitrário. E um algoritmo para a clusterização hierárquica que utiliza o Modelo1 como bloco de construção. Os modelos desenvolvidos foram aplicados em dados biológicos, segmentando imagens de microarray e auxiliando na análise do conjunto expressão de genes de St. Jude Leukemia. / With the advent of microarray technology, a large amount of gene expression data is now available. Clustering is the computational technique usually employed to analyze and explore the data produced by microarrays. Due to the variety of information that can be extracted from the expression data, many clustering techniques with different approaches are needed. In the work proposed by (Zhao et. al. 2003a), the dynamical model for data clustering has several interesting features to the clustering task: the number of clusters does not need to be known, the multi-scale property, high parallelism, and it is flexible to use more complex rules while clustering the data. However, two desirable features for clustering techniques are not present: the ability to detect different clusters sizes and shapes, and a hierarchical representation of the clusters. This project presents three techniques, overcoming the restrictions of the dynamical model proposed by (Zhao et. al. 2003a). The first technique, called Model1, is more effective than the original model and was obtained simplifying it. The second technique, called Model2, is capable of detecting different clusters sizes and shapes. The third technique consists in a hierarchical algorithm that uses Model1 as a building block. The techniques here developed were used with biological data. Microarray image segmentation was performed and the St. Jude Leukemia gene expression data was analyzed and explored.

Porphyromonas gingivalis é um bacilo anaeróbio Gram negativo envolvido com o início e progressão de doenças periodontais. É considerado um colonizador tardio ou secundário do biofilme oral capaz de aderir a células de Streptococcus gordonii, um colonizador inicial do biofilme dental. Este estudo se propôs a comparar a expressão de genes de amostras de P. gingivalis isoladas de diferentes condições periodontais usando Differential Display (DD) Reverse Transcription PCR, durante a formação de biofilme misto com S. gordonii. O perfil de expressão gênica de células em biofilme (saúde e periodontite) foi comparado, assim como com células planctônicas pareadas. Bandas diferencialmente expressas nas diferentes condições foram clonadas e seqüenciadas, seguida de identificação dos genes em bancos de dados. A confirmação da expressão diferencial dos genes detectados foi realizada através de PCR em Tempo Real. Desses genes, alguns se relacionam com fatores de virulência, outros com obtenção de energia além de genes relacionados com proteínas de membrana e de transporte. / Porphyromonas gingivalis is a Gram negative anaerobic rod involved with the beginning and progression of periodontal diseases P. gingivalis is a late or secondary colonizer of oral biofilms and adhere to cells of Streptococcus gordonii, an early colonizer of dental plaque. This study aim to compare the gene expression of P. gingivalis strains isolated from different periodontal conditions using Differential Display (DD) Reverse Transcription PCR, in a mixed biofilm with S. gordonii. The gene expression profile was determined with biofilm cells (health and disease) and also with their planktonic samples partners. Bands differentially expressed were cloned, sequenciated and analyzed in gene data bank. Differential expression was confirmed by Real Time PCR. Some of the confirmed genes are related to virulence factors, energy metabolism and transport and membrane proteins.

Submitted by Paula Castanho Borges (paulacastanhob@gmail.com) on 2018-07-18T19:31:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Paula DEFINITIVO.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-19T11:07:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 borges_pc_me_jabo.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-19T11:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 borges_pc_me_jabo.pdf: 1146833 bytes, checksum: 55c91711131bc963e10c31421e433060 (MD5) Previous issue date: 2018-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inseticida das proteínas Cry1Ia10 e Cry8 contra larvas de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), buscando por potencial sinérgico. Para tanto, o gene cry8 foi amplificado por PCR a partir de um clone previamente construído, obtendo-se um fragmento de aproximadamente 3531 pb e subclonado no vetor de expressão pET-SUMO. Para a expressão dos genes cry1Ia10 e cry8, os DNAs recombinantes foram inseridos em células de Escherichia coli BL21 (DE3) e induzidos por isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), resultando em proteínas de 94 kDa e 143 kDa, respectivamente, visualizadas em SDS-PAGE. As proteínas foram quantificadas através do software ImageQuant TL 8.1” (GE Healthcare), para que fosse possível a realização dos cálculos de diluição nas respectivas concentrações incorporadas à dieta artificial, a fim de estimar a CL50 e CL90 das duas proteínas testadas sozinhas e em conjunto. Com base na sequência de aminoácidos de proteínas da classe Cry8, análises filogenéticas foram realizadas para investigar proximidade evolutiva da proteína Cry8 utilizada neste trabalho com as demais proteínas na mesma classe. Através dessas análises, sugerimos que a proteína em questão pertence à subclasse Cry8Pa devido a elevada proximidade filogenética e similaridade com a proteína Cry8Pa2. Observou-se que as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 apresentaram ação inseticida contra larvas neonatas de A. grandis, obtendo-se as CL50 de 7,232 µg ml-1 e 4,422 µg ml-1 para Cry1Ia10 e Cry8 respectivamente. Quando combinadas as proteínas a CL50 é reduzida para 2,664 µg ml-1 e CL90 para 13,535 µg ml-1 apresentaram sinergismo, potencializando a ação inseticida das mesmas. Este estudo conclui que larvas de A. grandis são suscetíveis as proteínas Cry1Ia10 e Cry8 e que a combinação entre elas aumenta a eficiência de controle, sugerindo que plantas piramidadas com estes genes são de interesse agronômico para o controle de A. grandis possibilitando o retardo do desenvolvimento de insetos resistentes. / The objective of this work was to evaluate the insecticidal effect of Cry1Ia10 and Cry8 proteins against Anthonomus grandis Boheman larvae (Coleoptera: Curculionidae), searching for synergistic potential. To do so, the cry8 gene was amplified by PCR from a previously constructed clone, obtaining a fragment of approximately 3531 bp and subcloned into the pET-SUMO expression vector. For the expression of the cry1Ia10 and cry8 genes, the recombinant DNAs were inserted into Escherichia coli BL21 (DE3) and isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside (IPTG) cells, resulting in 94 kDa and 143 kDa proteins, respectively, visualized on SDS-PAGE. The proteins were quantified using ImageQuant TL 8.1 software (GE Healthcare) to allow the calculation of dilution in the respective concentrations incorporated into the artificial diet in order to estimate the LC50 and CL90 of the two proteins tested alone and together. Based on the amino acid sequence of Cry8 class proteins, phylogenetic analyzes were performed to investigate evolutionary proximity of the Cry8 protein used in this work with the other proteins in the same class. Through these analyzes, we suggest that the protein in question belongs to the subclass Cry8Pa due to its high phylogenetic proximity and similarity to the Cry8Pa2 protein. It was observed that the proteins Cry1Ia10 and Cry8 showed insecticidal action against neonatal larvae of A. grandis, obtaining the LC50 of 7.232 μg ml-1 and 4.422 μg ml-1 for Cry1Ia10 and Cry8 respectively. When combined the proteins at LC50 is reduced to 2,664 μg ml-1 and CL90 to 13,535 μg ml1 showed synergism, potentiating the insecticidal action of the same. This study concludes that A. grandis larvae are susceptible to Cry1Ia10 and Cry8 proteins and that the combination between them increases control efficiency, suggesting that pyramidal plants with these genes are of agronomic interest for the control of A. grandis, allowing the development of resistant insects.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1195_1.pdf: 502946 bytes, checksum: 05de27e9cfcaa96d9a0be29bebb8ff1d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Cascavéis mantidas em cativeiro sob estresse térmico apresentam redução na velocidade da digestão, alterações quantitativa e qualitativa da peçonha, o que sugere a modulação de genes relacionados à aclimatação a baixas temperaturas. O presente trabalho visou clonar uma fosfolipase e avaliar a expressão de genes relacionados a estresse em glândulas de peçonha de cascavéis da espécie Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) submetidas a estresse térmico. Para tanto, a clonagem do cDNA de uma nova PLA2 foi realizada a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de Cdcasca. A seqüência de aminoácidos deduzida dessa PLA2 indica que essa se enquadra no grupo das PLA2s ácidas, da classe II, cujos membros apresentam atividade enzimática. A fim de verificar o padrão de expressão após estresse térmico, os cDNA de glândulas de três cascavéis, provenientes da mesma ninhada, submetidas a extração da peçonha e, posteriormente, a temperaturas de 18°C (frio), 28 °C (controle) e 40° C (calor), por três dias, foram preparados e os transcritos de PLA2 e de proteínas de choque térmico (HSP70, HSP90, e HSF1) quantificados por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que os níveis de transcritos de PLA2 foram 5,24 vezes mais altos nas glândulas de peçonha da serpente mantida no frio em relação ao controle, enquanto os transcritos de PLA2 das glândulas da serpente mantida no calor não apresentaram diferenças significativas. Os níveis de transcritos das HSPs e seu fator de transcrição (HSF1) não variaram de maneira apreciável na amostras. Os resultados provaram, pela primeira vez, influência da baixa temperatura na expressão de uma toxina na glândula de peçonha de C. d. cascavella, sugerindo que essas serpentes podem adaptar a composição da peçonha à condição de estresse térmico

A evolução da vida na terra foi possível graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e comportamental desses indivíduos. A retina exerce função de suma importância nesse processo através da percepção da informação fótica que possibilita o ajuste dos ritmos circadianos. Nesse tecido, o glutamato apresenta um importante papel tanto na transmissão da informação fótica direcionada ao processo de formação de imagem quanto nos ajustes dos relógios biológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar como o glutamato, aplicado por períodos diferentes (6 e 12h), é capaz de modular a expressão dos genes de relógio na retina de Gallus gallus. Através de diferentes protocolos que envolveram a administração de glutamato na concentração de 100μM por 6 e 12 horas e em diferentes repetições (1 e 3 pulsos) avaliou-se através de PCR quantitativo a expressão dos genes Clock, Per2 e Bmal1. Os diferentes genes de relógio na retina de Gallus gallus apresentam diferentes respostas frente às trocas de meio e frente ao tratamento com o glutamato. O gene Clock responde com ativação da transcrição para ambos os tratamentos, de forma dependente da repetição dos estímulos. Já para o gene Per2 o tratamento com glutamato impõe uma oscilação de expressão com um ritmo ultradiano, enquanto que as trocas de meio não determinam alterações na transcrição. A expressão do gene Bmal1 não é afetada nem por trocas de meio, nem por glutamato. Novos estudos devem ser fomentados no sentido de se elucidar as vias pelas quais o glutamato leva ao perfil de oscilação observado e qual o mecanismo pelo qual a repetição de trocas de meio atua como sinalizador para o estabelecimento da sincronização celular / The evolution of life on earth was possible thanks to the development of precise temporal mechanisms to adjust physiological processes to environmental cycles, thus promoting gains in the individual adaptive and behavioral ability. The retina plays a very important role of paramount importance in this process through the perception of photic information that allows the adjustment of circadian rhythms. In this tissue, glutamate functions in the transmission of photic information directed to both image formation and biological clock entrainment. The aim of this study was to evaluate how glutamate, applied for different periods (6 and 12h), is able to modulate the expression of the clock genes in the retina of Gallus gallus. Using different protocols involving the administration of 100μM glutamate for 6 and 12 hours and with different repetitions (1 and 3 pulses) the expression of Clock, Per2 and Bmal1 genes was evaluated by quantitative PCR. Clock gene responds with activation of transcription to both treatments depending on the repetition of the stimulus. As for Per2 gene, glutamate treatment imposes an oscillation with an ultradian expression rhythm, whereas medium changes do not affect its transcription. The expression of Bmal1 gene is not affected by either medium changes or glutamate. Further studies should be encouraged in order to elucidate the pathways by which glutamate leads to observed oscillation profile, and which mechanism triggered by the repetition of medium changes acts as signal to establish cell synchronization

Porphyromonas gingivalis é um bacilo anaeróbio Gram negativo envolvido com o início e progressão de doenças periodontais. É considerado um colonizador tardio ou secundário do biofilme oral capaz de aderir a células de Streptococcus gordonii, um colonizador inicial do biofilme dental. Este estudo se propôs a comparar a expressão de genes de amostras de P. gingivalis isoladas de diferentes condições periodontais usando Differential Display (DD) Reverse Transcription PCR, durante a formação de biofilme misto com S. gordonii. O perfil de expressão gênica de células em biofilme (saúde e periodontite) foi comparado, assim como com células planctônicas pareadas. Bandas diferencialmente expressas nas diferentes condições foram clonadas e seqüenciadas, seguida de identificação dos genes em bancos de dados. A confirmação da expressão diferencial dos genes detectados foi realizada através de PCR em Tempo Real. Desses genes, alguns se relacionam com fatores de virulência, outros com obtenção de energia além de genes relacionados com proteínas de membrana e de transporte. / Porphyromonas gingivalis is a Gram negative anaerobic rod involved with the beginning and progression of periodontal diseases P. gingivalis is a late or secondary colonizer of oral biofilms and adhere to cells of Streptococcus gordonii, an early colonizer of dental plaque. This study aim to compare the gene expression of P. gingivalis strains isolated from different periodontal conditions using Differential Display (DD) Reverse Transcription PCR, in a mixed biofilm with S. gordonii. The gene expression profile was determined with biofilm cells (health and disease) and also with their planktonic samples partners. Bands differentially expressed were cloned, sequenciated and analyzed in gene data bank. Differential expression was confirmed by Real Time PCR. Some of the confirmed genes are related to virulence factors, energy metabolism and transport and membrane proteins.

Com o advento da tecnologia de microarray, uma grande quantidade de dados de expressão gênica encontra-se disponível. Após a extração das taxas de expressão dos genes, técnicas de formação de clusters são utilizadas para a análise dos dados. Diante da diversidade do conhecimento que pode ser extraído dos dados de expressão gênica, existe a necessidade de diferentes técnicas de formação de clusters. O modelo dinâmico desenvolvido em (Zhao et. al. 2003a) apresenta diversas características interessantes para o problema de formação de clusters, entre as quais podemos citar: a não necessidade de fornecer o número de cluster, a propriedade de multi-escala, serem altamente paralelos e, principalmente, permitirem a inserção de regras e mecanismos mais complexos para a formação dos clusters. Todavia, este modelo apresenta dificuldades em determinar clusters de formato e tamanho arbitrários, além de não realizar a clusterização hierárquica, sendo estas duas características desejáveis para uma técnica de clusterização. Neste trabalho, foram desenvolvidas três técnicas para superar as limitações do modelo dinâmico proposto em (Zhao et. al. 2003a). O Modelo1, o qual é uma simplificação do modelo dinâmico original, porém mais eficiente. O Modelo2, que a partir da inserção de um novo conjunto de elementos no modelo dinâmico, permite a formação de clusters de formato e tamanho arbitrário. E um algoritmo para a clusterização hierárquica que utiliza o Modelo1 como bloco de construção. Os modelos desenvolvidos foram aplicados em dados biológicos, segmentando imagens de microarray e auxiliando na análise do conjunto expressão de genes de St. Jude Leukemia. / With the advent of microarray technology, a large amount of gene expression data is now available. Clustering is the computational technique usually employed to analyze and explore the data produced by microarrays. Due to the variety of information that can be extracted from the expression data, many clustering techniques with different approaches are needed. In the work proposed by (Zhao et. al. 2003a), the dynamical model for data clustering has several interesting features to the clustering task: the number of clusters does not need to be known, the multi-scale property, high parallelism, and it is flexible to use more complex rules while clustering the data. However, two desirable features for clustering techniques are not present: the ability to detect different clusters sizes and shapes, and a hierarchical representation of the clusters. This project presents three techniques, overcoming the restrictions of the dynamical model proposed by (Zhao et. al. 2003a). The first technique, called Model1, is more effective than the original model and was obtained simplifying it. The second technique, called Model2, is capable of detecting different clusters sizes and shapes. The third technique consists in a hierarchical algorithm that uses Model1 as a building block. The techniques here developed were used with biological data. Microarray image segmentation was performed and the St. Jude Leukemia gene expression data was analyzed and explored.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal. / Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated attaching/effacing (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains. Concerning the bacterial interaction with human enterocytes cultivated in vitro (Caco-2) we verified that both bovine and human strains showed almost identical ability to invade and to persist in the intracellular compartment of the Caco-2 cells. However, in comparison with the human strains, the bovine strains showed a reduced capacity to produce A/E lesions according to the FAS test. A quantitative FAS test confirmed the relative inefficiency of bovine strains to induce A/E lesions. We also used qPCR to follow the transcription of three genes (eae, espA and tir) of selected bovine and human strains, during the infection of Caco-2 cells. We verified differences in the gene expression, especially for espA, between bovine and human strains and these latter showed a larger expression, in line with the findings of the actin-aggregation tests. Through cloning and expression of recombinant proteins, we purified the Eae, EspA and Tir proteins and obtained specific antibodies, employed to follow the expression of those proteins, by immunofluorescence, along the infection of Caco-2 cells. We found that all proteins are detected both in bovine and human strains, but on these protein labeling occurs early and becomes more intense with the progress of the infection. Our results indicate that EHEC O157:H7 strains isolated from the bovine reservoir in Brazil shows, in comparison to strains isolated from human disease, important differences in relation to the toxigenic profile and the ability to induce A/E lesions. Our findings concerning the ability of the microorganism to invade and to multiply inside enterocytes can explain the persistence of the pathogen in the animal reservoir and its ability of horizontal transmission.