Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2008.

Bakgrund: Enterohemorragisk Escherichia coli (EHEC) är en toxinproducerande bakterie somkan orsaka sporadiska fall av infektion men även ge upphov till allvarliga utbrott. Sjukdomen kan ge symtom alltifrån okomplicerad diarré, blodig diarrétill mycket allvarliga symtomsom hemolytiskt uremiskt syndrom (HUS). De flesta EHEC-falli Sverige förekommer i åldersgruppen ett till fyra år. Syfte: Studienssyfte var att undersöka värdet av en EHEC-screening hos barn under tio år genom att kartlägga förekomst av EHEC och distribution av serotypoch stx-typer. Ytterligare ett syfte var att undersöka om den kliniska bilden är beroende av serotyp och stx-typ. Därutöver undersöktes hur länge man utsöndrars tx i avföringen. Metod: I studien ingick alla barn under tio års ålder, som lämnat avföringsprov under perioden 1 maj 2003 till 30 april 2013i Jönköpingslän. Barnen delades in i de med klinisk EHEC frågeställning och de resterande som ingick i screeningen. Barnen följdes med upprepad provtagning varje vecka efter första positiva provet. Kliniska data samlades in via ett frågeformulär samt via granskning av journaler. Resultat: Totalt diagnostiserades 191 barn (87 flickor och 104 pojkar) med EHEC, av dessa var 162 indexfall och 29 hittades vid smittspårning. Prevalensen av EHEC var 1,8% i gruppen med klinisk frågeställning och 1,5% ingick i screening (p=0,5). Mediantiden för utsöndringav stx i avföringen var 20 dagar (1-256 dagar). Barnmed Stx2 producerande EHEC hade allvarligare symtom. Sju barn insjuknade i HUS, alla var smittade i Sverige. Det var vanligare med Stx2 hos barn smittade i Sverige. I fem av fallen kunde smittkällan fastställas. Konklusion: Studienvisar en lika högprevalens av EHEC i den screenade gruppen som i gruppen där EHEC var efterfrågat. Även svårighetsgraden av symtom var lika i båda grupperna.EHEC-förekomstenvar hög och de flestavarejav serotyp O157. Serotypoberoende metoder vid diagnostikär därför viktiga. Den långa utsöndringstiden utgör en risk för smittspridning. De flesta barnen med Stx2 var smittade i Sverige, vilket medför ökad risk för svår sjukdom. Studiens resultatbekräftar värdet av EHEC-screening hos barn. / Background:Enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC) is a toxin-producing bacterium responsible for sporadic cases of infection as well as serious outbreaks. Symptoms rangefrom uncomplicated or bloody diarrhea to hemolytic uremic syndrome (HUS). In Sweden, most EHEC casesoccurin 1-4-year-old children. Aims:This study aimed at investigate the value of EHEC screening in children younger than 10 years of age by evaluatingthe prevalence of EHEC and the distribution of serotypes and stxtypes. We also aimed t ocorrelate clinical symptoms with EHEC serotypes and stxtypes. Furthermore the duration of faecal shedding of stxwas investigated. Methods: The study examined stool samples collected fromall children younger than 10 years of age between1 May 2003 and April 2013 in the County of Jönköping. We divided the children into a physician-requested EHEC analysis group and ascreening group. Children who tested positive for stxwere sampled weekly after initial EHEC diagnosis. We used a questionnaire and reviewed medical records to collect clinical data. Results: Among 191 children (87 girls and 104 boys) with confirmed EHEC, 162 specimens were index cases and 29 were found by contact tracing. The EHEC prevalence was 1.8 % in the EHEC requested group and 1.5 % in the screening group (p=0.5). The median duration of stxdetection in faeces was 20 days (1-256 days). Symptoms were more severe in children with Stx2-producing EHEC, and seven children developed HUS, all infected in Sweden. We were able to determine the source of infection in five cases. Conclusions: This study showed that the EHEC prevalence and severity of symptoms where equal between the requested and screening group. HighEHEC prevalence and a high proportion of non-O157 isolates were found. Our results emphasize the need for serotype-independent methods for EHEC detection. The long duration of stxdetection in stools indicates a risk for transmission. Most children with Stx2 were infected in Sweden, suggesting a higher risk forsevere symptoms. Our results confirm the value of EHEC screening in children. / <p>ISBN 978-94-86739-92-8</p>

Shiga toxin produzierende E. coli (STEC) stellen mit einer Infektionsdosis von gerade einmal 100 Bakterien ein großes Risiko für unsere Gesundheit dar. Betroffene Patienten können milde Krankheitssymptome wie wässrigen Durchfall aufweisen, welcher sich allerdings zu blutigem Durchfall oder dem hämolytisch urämischen Syndrom (HUS) weiterentwickeln kann. Die Ursache für das Krankheitsbild ist das zytotoxische Protein Shiga-Toxin (Stx), welches von STEC Stämmen produziert wird, eukaryotischen Zellen angreift und den apoptotischen Zelltod induziert. Es konnte gezeigt werden, dass infizierte Patienten in ihrem Krankheitsverlauf stark variieren, was unter anderem auf die Zusammensetzung ihrer Mikrobiota zurückzuführen sein könnte. Diesbezüglich können zum Beispiel einige Bakterien bereits die Darmbesiedlung von STEC Stämmen unterbinden, wohingegen andere die Toxin Produktion der pathogenen Stämme beeinflussen und wieder andere von den stx tragenden Phagen infiziert werden können und daraufhin selbst zu Toxin produzierenden Stämmen werden. Da die genetischen Informationen für das Toxin auf einem Prophagen im Genom der STEC Stämme kodiert ist, führt eine Antibiotika Behandlung von infizierten Patienten zwar zum Tod der Bakterien, hat allerdings auch einen Wechsel vom lysogenen zum lytischen Phagen Zyklus und damit einen enormen Anstieg an freigesetztem Stx zur Folge. In den letzten Jahrzehnten kam es immer wieder zu Epidemien mit STEC Stämmen, welche auch einige Todesopfer forderten. Die Behandlung von Patienten erfolgt auf Grund von mangelnden Behandlungsmöglichkeiten meist nur symptomatisch, weswegen neue Strategien für die Behandlung einer STEC Infektion dringend benötigt werden. Der probiotische E. coli Stamm Nissle 1917 (EcN) zählt bereits seit mehr als 100 Jahren als Medikament für Behandlungen von Darmentzündungen. In vitro und in vivo Studien mit dem probiotischen Stamm und STEC Stämmen konnten zeigen, dass EcN die Produktion von Stx unterdrückt und gleichzeitig die STEC Zellzahl reduziert. Diese Ergebnisse waren der Anlass für diese Studie in der die Auswirkungen von EcN auf STEC Stämme genauer untersucht wurden, um eine mögliche Behandlung von STEC Infektionen mit dem Probiotikum zu gewährleisten. Eines der Hauptziele dieser Studie war es, herauszufinden, ob EcN von stx-Phagen infiziert werden kann und damit selbst zu einem Toxin Produzenten wird. In diesem Falle wäre eine Behandlung mit dem E. coli Stamm ausgeschlossen, da es den Krankheitsverlauf verschlimmern könnte. Verschiedene experimentelle Ansätze in denen versucht wurde den YaeT stx-Phagen Rezeptor tragenden Stamm zu infizieren schlugen fehl. Weder mittels PCR Analysen, Phagen Plaque Assays oder der Phagen Anreicherung konnte eine Lyse oder eine Prophagen Integration nachgewiesen werden. Transkriptom Analysen konnten zeigen, dass Gene eines lambdoiden Prophagen in EcN in Anwesenheit von stx-Phagen stark reguliert sind. Auch andere E. coli Stämme, welche sich ebenfalls durch eine Resistenz gegenüber einer stx-Phagen Infektion auswiesen, wurden positiv auf lambdoide Prophagen untersucht. Einzig dem stx-Phagen sensitiven K-12 Stamm MG1655 fehlt ein kompletter lambdoider Prophage, weswegen die Vermutung nahe liegt, dass ein intakter lambdoider Prophage vor der Superinfektion mit stx-Phagen schützten kann. In weiteren Experimenten wurde der Einfluss der Mikrozin-negativen EcN Mutante SK22D auf STEC Stämme untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SK22D nicht nur die Produktion des zytotoxischen Proteins unterdrückt, sondern auch mit der Produktion der stx-Phagen von allen getesteten STEC Stämmen interferiert (O157:H7, O26:H11, O145:H25, O103:H2, O111:H- und zwei O104:H4 Isolate vom STEC Ausbruch in Deutschland im Jahr 2011). Transwell Studien konnten zeigen, dass der Faktor, welcher die Transkription des Prophagen unterdrückt, von SK22D sekretiert wird. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Präsenz von SK22D den lysogenen Zustand des Prophagen stützt und somit den lytischen Zyklus unterdrückt. Da stx-Phagen eine große Gefahr darstellen andere E. coli Stämme zu infizieren, haben wir uns in weiteren Studien dem Einfluss von EcN auf isolierte Phagen gewidmet. Die Kultivierungsexperimente von EcN mit Phagen zeigten, dass der probiotische Stamm in der Lage war die stx-Phagen in ihrer Effizienz der Lyse des K 12 Stammes MG1655 von~ 1e7 pfus/ml auf 0 pfus/ml nach einer 44 stündigen Inkubation zu inaktivieren. Diese Inaktivierung konnte auf die Aktivität eines hitzestabilen Proteins, welches in der stationären Wachstumsphase synthetisiert wird, zurückgeführt werden. Studien welche einen Anstieg der Biofilmmasse zur Folge hatten zeigten eine gesteigerte Effizienz in der Phagen Inaktivierung, weswegen Komponenten des Biofilms möglicherweise die Phagen Inaktivierung herbeiführen. Neben dem direkten Einfluss auf die Phagen wurde auch ein Schutzeffekt von SK22D gegenüber dem stx-Phagen empfänglichen K 12 Stämmen untersucht. Lysogene K 12 Stämme zeichneten sich durch eine enorme Stx und stx-Phagen Produktion aus. Die Präsenz von SK22D konnte den K 12 vermittelten Anstieg der pathogenen Faktoren unterbinden. Transwell Ergebnisse und Kinetik Studien lassen vermuten, dass SK22D eher die Phagen Infektion von K-12 Stämmen unterbindet als die Lyse von lysogenen K-12 Stämmen zu stören. Eine mögliche Erklärung für den Schutz der K-12 Stämme vor einer stx-Phagen Infektion könnte darin liegen, dass die K-12 Stämme innerhalb der SK22D Kultur wachsen und dadurch von den infektiösen Phagen abgeschirmt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass der probiotische Stamm EcN sowohl die Lyse von STEC Stämmen unterdrückt als auch die infektiösen stx-Phagen inaktiviert und sensitive E. coli Stämme vor der Phagen Infektion schützen kann. Diese Ergebnisse sollten als Grundlage für in vivo Studien herangezogen werden, um eine mögliche Behandlung von STEC infizierten Patienten mit dem Probiotikum zu gewährleisten. / Shiga toxin producing E. coli strains (STEC) are a great concern to human health. Upon an infection with as few as 100 bacteria, humans can develop disease symptoms ranging from watery to bloody diarrhea or even develop the hemolytic uremic syndrome (HUS). The major factor contributing to the disease symptoms is Shiga toxin (Stx) which can bind to the eukaryotic cells in the intestine of the human and induce cell death via apoptosis. Based, among other things, on the microbiota composition, the impact of STEC can vary. Some bacteria of the microbiota can interfere with the colonization of STEC strains in the first place. Others cannot impair the colonization but interfere with the toxin production and there are still others which are even infected by stx encoding phages, being released from STEC strains. Those previously harmless bacteria subsequently contribute to the toxin increase and worsen the disease progression. Since the genetic information of Stx is encoded on a prophage, antibiotic treatment of patients can lead to an increased toxin and stx-phage release and is therefore not recommended. Several STEC epidemics in different countries, which even resulted in the death of some patients, demonstrated that there is an urgent need for alternative treatment strategies. The E. coli strain Nissle 1917 (EcN) has been used as a probiotic to treat gastrointestinal infections for more than 100 years. It harbors several fitness factors which contribute to the establishment of an intact intestinal barrier in the human gut. Moreover, studies with EcN unraveled that the probiotic E. coli can interfere with the colonization of STEC strains and their toxin production. This study aimed to investigate if EcN could be a possible alternative or supplementary treatment strategy for STEC infected patients, or a preventive treatment for the patient’s close contact persons. Therefore, EcN was firstly investigated for a possible stx-prophage integration into its’s genome which would eliminate it from being a potential treatment due to the possibility of disease worsening. Despite the presence of the stx-phage surface receptor YaeT, EcN demonstrated a complete resistance towards the lysis and the lysogeny by stx-phages, which was proven by PCR, phage-plaque assays and phage enrichment approaches. Transcriptome data could unravel that a lambdoid prophage in the genome of EcN is involved in the resistance towards the phage infection. Other commensal E. coli tested presented a stx-phage resistance as well and in silico analysis revealed that all of them harbor a complete lambdoid prophage besides the stx-phage susceptible K-12 strain MG1655. We assume that the resistance of EcN towards a stx-phage infection is connected to the presence of an intact lambdoid prophage which interferes with superinfection. Further experiments regarding the impact of the microcin negative EcN mutant SK22D towards STEC strains depicted that SK22D did not only interfere with the toxin production but also negatively regulated the transcription of the entire stx-prophage in coculture with all STEC strains tested (O157:H7, O26:H11, O145:H25, O103:H2, O111:H- and two O104:H4 isolates from the 2011 outbreak in Germany). This influence on the pathogenic factor production was evinced to be cell contact independent as SK22D could even interfere with the pathogenic factor production when being separated from the STEC strain EDL933 by a Transwell membrane with the pore size of 0.4 µm. From this data we concluded, that factor(s) released by SK22D interfere with the lysis of STEC strains by stabilizing the lysogenic state. Another positive aspect of EcN towards the pathogenicity of STEC strains was encountered when EcN was incubated with isolated stx-phages. The probiotic strain could reduce the infectivity of the phages towards a MG1655 lysis from ~ 1e7 pfus/ml to 0 after 44 h of incubation. Various approaches to determine the characteristics of the factor(s) of EcN which are involved in the phage inactivation depicted it to be a heat resistant stationary phase protein on the surface of EcN, which could be a component of its biofilm. Regarding the protective role of EcN we could further evince that SK22D was capable of interfering with the lysogenic K 12 mediated increase of Stx and stx phages. Lysogenic K-12 strains were characterized by a huge increase of Stx and stx-phage production. The presence of SK22D anyhow, could interfere with this K-12 mediated pathogenic factor increase. Transwell and stx phage infection kinetics led to the proposal that SK22D interfered with the stx-phage infection of K-12 strains in the first place rather than disturbing the lysis of lysogenic K 12. The protection from the phage infection could be due to the growth of K 12 strains within the SK22D culture, whereby the phage susceptible strains are masked from phage detection. Summarizing, this work could underline the beneficial attributes of EcN towards the STEC pathogenicity in vitro. These results should be considered as pioneers for future in vivo studies to enable EcN medication as a supportive STEC infection treatment strategy.

Hohenheim, Univ., Diss., 2007.

Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) strains are associated with gastrointestinal and severe systemic disease in humans. EHEC O157:H7 is the most common serotype causing human infections in North America and the UK. Human infections mainly originate from cattle, through either direct contact with infected animals or indirectly through contamination of food or water with animal faeces. From the sequencing of EHEC O157 strains, it is clear that the genomes contain multiple prophages, many of them cryptic, which define this E. coli pathotype. These regions include the locus of enterocyte effacement (LEE) which is a critical horizontally acquired pathogenicity island and encodes a type III secretion system (T3SS). The T3SS translocates effector proteins into epithelial cells that enable tight attachment to these host cells and also modify innate responses and other cellular functions to promote persistence in the animal host. The T3SS is essential for the colonisation of cattle by EHEC O157 where it is localised to the terminal rectum. The regulation of T3S is complex with many regulators and environmental factors already identified. Previous work has demonstrated marked variation in the levels of T3S among EHEC O157 strains. The aim of this research was to further investigate the regulation of T3S towards two objectives: (1) to understand the localisation of EHEC O157 at the terminal rectum of cattle; (2) to understand the strain variation in T3S. (1) In relation to rectal and mucosal colonisation, established aerobic/anaerobic regulators were investigated including arcA, fnr, narX, narQ. Briefly, arcA, fnr, narX, narQ were deleted in an E. coli O157 strain ZAP198 by lambda red recombination. Apart from the fnr mutant which showed lower levels of T3S, the remaining mutants displayed similar T3S protein levels compared to the wild type strain. In addition, no significant changes in adherence and A/E lesion formation capacity were measured for the mutants following interaction with bovine epithelial cells. (2) Strain secretion variation was approached in two ways; the first was to control expression from the LEE1 operon, required for T3S expression, in order to both induce expression and examine the importance of downstream regulation. The second was to investigate variation in T3S between different phages types of EHEC O157. While attempts to construct an inducible T3SS were not successful, intermediate strains made in the process have been useful to dissect how regulators being studied in the laboratory control T3S. The main novel insights from the research have come from examining T3S in different EHEC O157 phage types. We found that the average level of T3S in PT 21/28 strains was lower than in PT 32 strains. Interestingly, most (90%) of PT 21/28 strains contained both Stx2 and Stx2c phages. In contrast, only 28% of PT 32 strains had both phages. Taken together, this raised the possibility that Stx phage integration might have a repressive impact on T3SS regulation in E.coli O157:H7. This hypothesis was addressed using a number of different approaches. Deletions of Stx phages were constructed and these had increased levels of T3S when compared to the parental strains. This phage regulation of T3SS was confirmed in an E. coli K12 background by examining an induced LEE1 reporter in the presence and absence of a transduced Stx2 phage. In addition, it was shown that deletion of the CII phage regulator led to increased T3S and may contribute to the Stx phage repression reported above. This work demonstrates for the first time that Stx phage integration represses T3S expression. It is proposed that this control may limit immune exposure of this critical colonisation factor and that the repression actually allows activation by prophage encoded regulators, including PchA/B, that co-ordinate T3S and non LEE-encoded effector expression to promote epithelial cell colonisation.

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden. / Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are important emerging pathogens responsible for the development of diarrheal diseases, ranging from unbloody diarrhea to hemorrhagic colitis, and of life-threatening extraintestinal complications like the hemolytic-uremic syndrome. The most important virulence factors of this pathogen are the mostly phage-encoded Shiga toxins (Stx) and the factors involved in the development of so-called "attaching and effacing lesions" on gut epithelial cells. Children and the elderly are mainly affected by these infections, which often occur as outbreaks. The infections are predominantly transmitted by fecally contaminated food. The treatment of EHEC infections with some antibiotics may promote the development of extraintestinal complications. Therefore, the best way to combat this infectious agent would be the vaccination of the endangered people. Another way would be the eradication of the organism in its asymptomatic carrier animals involved in the transmission of EHEC into the human food chain. The objective of this thesis was to lay the basis for the development of a life vaccine strain for people or cattle against EHEC infections. Therefore, different strategies aiming at the attenuation of a Stx2-producing EHEC wildtype strain were followed. One strategy for the attenuation of EHEC is the direct knockout of virulence factor structural genes, like the toxin genes. Therefore, a stx2-negative mutant of the EHEC strain O157:H7 86-24 was constructed by deleting the central part of the stx2 gene cluster, leading to the fusion of the 154 N-terminal aminoacids of StxA2 with the 62 C-terminal aminoacids of StxB2. The characterisation of the mutant revealed that the toxin-converting bacteriophage was still intact, but that the fusion protein had completely lost its cytotoxic activity and that it could be detected using Stx2-specific pig antiserum. It has been concluded that the respective mutant protein had kept part of its antigenic structure and that it could potentially be used for vaccination against Stx2-specific damage. Another strategy aiming at the attenuation of EHEC-strains was the deletion of genes involved in the regulation of virulence factors in order to prevent the expression of the respective factors. Firstly, the identification and characterisation of a formerly postulated bacteriophage-encoded toxin-specific regulator which had the capability to induce the expression of a stx2-specific reporter gene after induction of the phage was attempted. A transposon-mutagenesis of the Stx2-converting phage 933W yielded a variety of phage mutants with altered expression of the reporter gene upon phage induction. Toxin production as well as the capability to produce phage particles did not correlate well with the reporter gene phenotypes. The transposon of the mutant with the lowest induction of the reporter gene was inserted into ORF L0065 located immediately upstream of the phage's int/xis genes. The cloned wildtype ORF was not able to trans-complement the transposon mutant. It was concluded that the mutant's phenotype was due to a reduced excision of the phage genome caused by a polar effect of the transposon on int/xis and therefore reduced phage induction leading to reduced reporter gene induction. Neely et al. (1998) identified the phage antiterminator Q as a possible candidate for the postulated phage-encoded stx2 regulator. The specific deletion of this general phage regulator might help to attenuate EHEC by disturbing regular phage functions. Secondly, recA-negative mutants of the EHEC-strains O157:H7 86-24 and EDL933 were examined in different mouse models as part of a project of Dr. I. Muehldorfer. It was demonstrated that the deletion of recA brought about a massive virulence loss due to a drastic reduction of toxin production, which was indirectly caused by the lack of recA. Thus, the deletion of recA attenuates pathogenic EHEC strains in the mouse model. In contrast, the deletion of recA in UPEC strain O6:K15:H31 536 did not alter the virulence of this strain. The analysis of the revealed virulence data was performed as part of this thesis. In addition, the deletion of recA is an important safety measurement for preventing the integration of foreign DNA into attenuated strains and thus, it helps preventing reversion of the vaccine to pathogenicity. Thirdly, the consequences of a deletion of the gene leuX coding for the minor Leucin specific tRNA5Leu on the expression of virulence factors in EHEC were examined by the construction and characterisation of an EHEC O157:H7 86-24 leuX-deletion mutant. In UPEC strain 536, the deletion of this tRNA lead to an attenuation of this strain due to reduced expression of diverse virulence factors. It was demonstrated that in EHEC, like in UPEC, the production of flagella and enterobactin was reduced. In addition, Hemin utilisation was impaired. The deletion of leuX also diminished the expression of various proteins of the outer and inner membrane as well as of an antigen cross-reacting with serum specific for type 1-fimbriae. In contrast, it did not influence the production of Stx2 as well as the in vivo pathogenicity of the strain in mice. Enterohaemolysis and the expression of Intimin were enhanced. Thus, it was demonstrated that the typical EHEC virulence factors were not reduced in the leuX mutant. In addition, it became obvious that the impact of leuX on the expression of the respective genes is not only based on a translational reduction due to a lack of tRNA availability but seems to involve further mechanisms. We concluded that apparently, an attenuation of EHEC is not possible by the deletion of leuX.

E. coli Nissle 1917 (EcN) zählt durch seine fast hundertjährige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung während der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt. Der enteroaggregative – hämorrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland für den bisher größten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven Möglichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend benötigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adhäsion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen Stämme untersucht. Zusätzlich wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen. Zunächst wurde die Adhäsionseffizienz der verschiedenen E. coli Stämme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adhärierende Stamm war EcN. Dies ist insofern überraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adhärieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adhäsion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enterohämorrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier für einen Teil des beobachteten anti-adhäsiven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli Stämme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli Stämme beeinflusst, identifiziert. Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC Stämmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am häufigsten auftretenden EHEC Stämme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt. Auffällig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abhängig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abhängigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabhängige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgeführt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Moleküls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat führte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt. Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als möglicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch bestätigt werden muss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend benötigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen können. / Due to extensive studies in the last decades and its centennial application as a pharmaceutical, E. coli Nissle 1917 (EcN) is among the best characterized probiotics. EcN is used as remedy for remission maintenance of ulcerative colitis, chronic obstipation and diarrhea in children. The enteroaggregative – haemorrhagic - E. coli (EAHEC) strain O104:H4 was responisible for one of the biggest outbreaks of EHEC recorded so far, that took place in Germany in 2011. Currently, there is no effective prophylaxis or treatment available for EHEC infections in humans. Therefore, alternative therapeutics are desperately needed. The antagonistic effects of EcN on pathogenic E. coli strains like the EHEC O157:H7 strain EDL933 or clinical isolates of EAHEC O104:H4 were investigated in this study. The influence of EcN on adhesion to human epithelial cell lines, the growth and the Shiga toxin production of pathogenic strains were analysed. Furthermore, the resistence of EcN against Shiga toxin phages was proven. Initially, the adhesion efficiency of EcN and pathogenic E. coli strains were determined in monocultures. EcN showed the lowest number of adhering bacteria to Caco-2 and LS-174T cells. This was insofar surprising, since probiotics are expected to adhere more efficiently to epithelial cells than pathogens. Regardless of this fact, it could be shown that EcN is inhibiting the adhesion of two EAHEC O104:H4 isolates, the closely related EAEC strain 55989 and the EHEC O157:H7 strain EDL933 to both cell lines. The microzins M and H47, which are produced by EcN, can be held responsible for a fraction of the observed anti-adhesive effect of EcN. The Microzins were also identified as the only substance that was influencing the growth of the pathogenic E. coli strains. One of the most important virulence factors of EHEC and EAHEC strains is Shiga toxin. In this study could be shown, that EcN is inhibiting the Shiga toxin production of the most common EHEC strains (big five: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) and two clinical isolates of EAHEC O104:H4 in the cell culture medium DMEM. Interesingly, the Shiga toxin 1 production of EHEC O103:H2 and O111:H- was not only reduced by EcN, but also the E. coli K-12 strain MG1655. In contrast, the Stx2 production of the serotypes O104:H4, O26:H11, O145:H25 was only blocked by EcN. The reduction of the Shiga toxin production in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, as well as EHEC O26:H11 was partly dependent on the microcin production of EcN. No influence of microzins on the Stx production of EHEC O157:H7 EDL933 and EHEC O145:H25 was detected. When using LB-medium instead of DMEM-medium, no influence of microzin on the Shiga toxin production of neither EAHEC TY3730 and TY3456, nor EHEC EDL933 could be shown. Experiments with SCEM-medium also resulted in an EcN-dose-dependent inhibition of Shiga toxin production of pathogenic E. coli strains in co-culture with EcN. In order to investigate the mechanism responsible for the observed effects, the EcN mutant EcN::luxS was used in co-culture experiments. However, the deletion of the quorum sensing molecule AI-2 in EcN::luxS had no influence on the Stx production. Using acetate in the experiments did not, in contrast to published results, lead to a reduction of Shiga toxin production. In addition, an influence of EcN on lysis of EHEC strains or the secretion of Shiga toxin could be ruled out. To study the Shiga toxin expression an assay with a bioluminescent C-P (chromosome-plasmid) reporter system was successfully established. Here, Shiga toxin expression could be monitored in real time with the strain background EHEC EDL933. Moreover, a reduction of Shiga toxin expression in co-culture with EcN could be detected. In further experiments could be shown, that EcN is not only reducing the Shiga toxin production in uninduced bacteria, but also in the Mitomycin C induced EAHEC O104:H4 strain TY3730. An important safety issue, in order to use EcN as a pharmaceutical against EHEC strains, is the resistance of EcN against Shiga toxin phages. The infection of bacteria was here investigated with phage plaque assay, stx-PCR, Stx-ELISA and K+-efflux assay. With these different methods could be successfully shown, that EcN is not infected by the tested Shiga toxin phages. A mutation in the phage receptor LamB could be a possible, but still unconfirmed, phage resistance mechanism of EcN. In summary, this study showed important antagonistic effects of EcN against pathogenic E. coli strains, which could be the foundation of new and desperately needed treatment options of EHEC infections.

Summary The group of E. coli strains is a highly heterogeneous group of strains, including pathogenic and non-pathogenic strains. The classification of these strains is made upon specific virulence factors of these bacteria. Some of these pathogenic strains are not capable to cross over the intestinal border and are responsible for intestinal disorders associated with diarrhoea. Other strains can cross the intestinal border and produce septicaemia and other complications depending on the infected organs. These pathogenic strains of E. coli interact with the host in a typical manner and produce specific lesions. These specific interactions are observed after the colonisation of the gut by pathogenic bacteria and are the results of the presence of specific virulence factors. The colonisation of the gut is mediated by specific adhesins, which are specific for each group of pathogenic E. coli. It seems that these adhesins are not only responsible to initiate the interaction between the pathogen and the host but are also responsible for the host specificity shown by some pathogenic strains. Its for that that a better understanding of these adhesins would permit a better understanding of the host specificity and a better evaluation of the zoonotic potential of these strains. The aim of this work was to identify bacterial structures involved in the intestinal adhesion step and in the intestinal colonisation of the enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC) and verotoxigenic E. coli (VTEC) bovine isolates, focusing mainly (but not exclusively) on strains of serogroup O26. In order to achieve this objective, two different approaches have been followed: i) the immunologic approach and ii) the genetic approach. The immunologic approach is using the benefits of the 2F3 monoclonal antibody (MAb), which was obtained against an outer membrane protein extract from a human O26 EHEC strain. The work on this approach focused on the study of this MAb as epidemiological tool and on the identification of the epitope recognised by this antibody and of its genetic basis. The work on the genetic approach involves the screening by PCR and by colony hybridization of a collection of EHEC, VTEC and EPEC of human and bovine isolates for the presence of homologues for gene clusters coding for fimbriae of type I, II, III and IV: (i) putative adhesins of human EPEC and EHEC strains like LifA, Iha, LpfA, BfpA; (ii) fimbriaires adhesins (CS31A et F17) and afimbriaire adhesins of Afa family (Afa III, Afa VII, Afa VIII and F1845) described for other groups of bovine pathogenic E. coli. The accomplished work allowed, first of all, to confirm that the 2F3 MAb is specific for the O26 EPEC and O26 EHEC strains without being capable to distinguish between human and animal isolates, that means without being capable to distinguish them depending on theirs host. Moreover, it has been shown that: i) the epitope recognised by the 2F3 MAb is component of the O antigen from the O26 EPEC and O26 EHEC strains; ii) the genetic basis of this epitope is located inside the O antigen gene cluster of O26 EPEC and O26 EHEC strains; and iii) the 2F3 + and O26 + characters are two characters that can be dissociated by random insertional mutagenesis in a bovine EHEC strain. Nevertheless, the results of this work not allowed us to explain the specificity of the 2F3 MAb for the O26 EPEC and O26 EHEC strains. Actually, by sequencing the O-antigen gene cluster (the rfb locus) of an O26 non-EPEC and non-EHEC strain and comparing the obtained sequence with the already published sequence of the O-antigen gene cluster of an O26 EHEC strain no major differences (which could explain the specificity of the 2F3 MAb for the O26 EPEC or EHEC strains) were observed. The obtained results in the genetic approach have been shown that: i) all O145 and O157 EPEC and EHEC strains were positive for the LpfA probe (lpfA gene is coding for the type IV pili) and all other human and bovine strains belonging to other serogroups (O5, O26, O103, O111 and O118) have no homologue sequences for this probe; ii) a big majority of EPEC and EHEC strains belonging to O5, O26, O103, O111 or O118 serogroups were positives for the LifA probe (the lifA gene is involved in the synthesis of adhesins not very well characterised) but none of those belonging to the O145 et O157 serogroups; iii) different proportions of these strains belonging to various serogroups were positives for the Iha probe (the iha gene is involved in the synthesis of an adhesin not very well characterised); and iv) ten out of twelve bovine O26 EPEC strains were positive for the ClpE probe and all other strains (human EPEC and EHEC strains and bovines EHEC strains) were negative for the ClpE probe. The clpE gene is involved in the synthesis of the chaperon protein of the CS31A fimbria, which was described for the enterotoxigenic and septicaemic bovine and porcine E. coli isolates. Since the O145 and O157 EHEC strains show the same pathotype, it looks like that the presence of the lpfA gene and the absence of the lifA gene is linked more to a specific pathotype than to a specific serotype. Concerning the results obtained results with the ClpE probe for the O26 EPEC strains, it is possible that these strains have not an entire clp gene cluster since all the strains positive for the ClpE probe were negative for the ClpG (clpG gene is involved in the biosynthesis of the major unit of the CS31A fimbriae). Nevertheless, it is possible that the clpE-like gene of these strains belongs to an entire gene cluster for which the major unit is different from the ClpG. Finally, the screening of a collection of O8 and O20 VTEC bovine isolates for the presence of sequences homologues to the genes involved in the biosynthesis of adhesins of the Afa family (Afa III, Afa VII, Afa VIII and F1845), adhésines produced mainly by human uropathogenic isolates and by some septicaemic strains isolated from animals, allowed the identification of two O8 VTEC bovine strains harbouring the afa-VIII D/afa-VIII E genes and expressing the Afa VIII E adhesin. During this work, a lot of progresses, that could be useful for a better understanding of the pathogenesis of the EPEC, EHEC and VTEC strains, have been done. Despite that, the general objective of this project description of new factors involved in the initial adhesion stage and/or in the intestinal colonisation by the EPEC, EHEC and VTEC bovine strains in order to allow an easy and reliable diagnostic of these strains have been not accomplished. In perspective of this work, complementary works should focus: i) to identify the epitope recognised by the 2F3 MAb; and ii) to investigate which is the role of the adhesins, for which homologues sequences have been described in the human or bovine EPEC and EHEC isolates of different serogroups, in the adhesion to eukaryotic cells like bovine and human enterocytes. Résumé Lespèce Escherichia coli (E. coli) est hétérogène, contenant des souches pathogènes et des souches inoffensives. La classification des différentes souches pathogènes est basée sur leurs propriétés spécifiques de virulence. Les souches pathogènes dE. coli sont en effet associées à des pathologies variées. Certaines souches ne franchisent pas la barrière intestinale produisant des lésions dentérite, associées à de la diarrhée et dautres souches pathogènes dE. coli peuvent franchir la barrière intestinale, produisant de la septicémie, avec des complications variables selon les organes infectés. Ces souches interagissent avec lhôte dune manière particulière produisant des lésions typiques au niveau cellulaire et tissulaire. Ces interactions spécifiques sont dues aux propriétés de virulence spécifiques après la colonisation de lintestin. Létape de colonisation de lintestin se fait grâce à des adhésines particulières, spécifiques pour chaque groupe de souches pathogènes dE. coli. Il semble que ces adhésines nont pas seulement le rôle dinitialiser linteraction entre lhôte et le pathogène mais quelles soient responsables aussi de la spécificité dhôte présentée par certaines souches pathogènes. Ainsi la connaissance de ces adhésines permet la reconnaissance de la véritable spécificité dhôte de ces souches et lévaluation de leur potentiel zoonotique. Lobjectif général du travail était didentifier des structures bactériennes impliquées dans ladhérence aux entérocytes et, donc, dans la colonisation intestinale par des souches entérohémorragiques (EHEC), entéropathogènes (EPEC) et vérotoxinogènes (VTEC) bovines, et qui représenteraient une base de la spécificité dhôte de ces souches, en ciblant plus particulièrement le sérogroupe somatique O26. Pour accomplir lobjectif de ce travail, deux approches ont été suivies : immunologique et génétique. Lapproche immunologique a utilisé lanticorps monoclonal 2F3 qui a été dérivé contre des extraits protéiques de membrane dune souche EPEC humaine du sérogroupe O26. Le travail a consisté à identifier l'antigène reconnu par l'anticorps monoclonal 2F3, à déterminer sa base génétique et à lutiliser en tant qu'outil d'épidémiologie moléculaire. Le travail dans lapproche génétique a consisté à rechercher, par des épreuves de PCR et d'hybridation sur colonies sur une collection de souches EHEC, EPEC et VTEC bovines et humaines, la présence de gènes dopérons qui codent pour différents fimbriae de type I, II, III et IV : (i) des adhésines potentielles des souches EHEC et EPEC humaines, telle que LifA, Iha, LpfA, BfpA; (ii) des adhésines fimbriaires (CS31A et F17) et afimbriaires la famille Afa (Afa III, Afa VII, Afa VIII et F1845) présentes chez dautres catégories de souches dE. coli pathogènes pour le bovin. Les travaux effectués ont tout dabord permis de confirmer que lanticorps monoclonal 2F3 est spécifique pour les souches EPEC et EHEC du sérogroupe O26 et ne reconnaît pas les souches non-EHEC non-EPEC, sans cependant quil puisse faire la différence entre les souches EHEC et EPEC dorigine humaine et animale, cest-à-dire en fonction de leur hôte. Dans la partie des recherches consacrée à létude de cet anticorps, il a été aussi démontré que : i) lépitope reconnu par lanticorps monoclonal 2F3 est une composante du lipopolysaccharide (LPS) des souches EPEC et EHEC du sérogroupe O26 ; ii) la base génétique de cet épitope est situé dans lopéron codant pour lantigène O26 ; et iii) le caractère 2F3+ peut néanmoins être dissocié du caractère O26+ par mutagenèse par transposition aléatoire dans une souche EHEC bovine. Néanmoins, les résultats de ces travaux nont pas permis dexpliquer la raison pour laquelle lanticorps monoclonal 2F3 reconnaît les souches EPEC et EHEC O26, mais non les souches non-EPEC et non-EHEC O26. En effet, le séquençage de lopéron codant pour lantigène O26 (locus rfb) dune souche non-EHEC non-EPEC et sa comparaison avec la séquence publiée de lopéron rfb dune souche O26 EHEC na pas permis de reconnaître une différence pouvant expliquer la reconnaissance par lanticorps 2F3. Les résultats obtenus dans le cadre des travaux selon lapproche génétique ont montré que : i) toutes les souches EHEC bovines et humaines appartenant aux sérogroupes O145 et O157 étaient positives pour la sonde LpfA (les gènes lpfA codent pour des pili de type IV), mais aucune souche appartenant aux autres sérogroupes (O5, O26, O103, O111 et O118); ii) une grande majorité des souches EHEC et EPEC bovines et humaines aux sérogroupes O5, O26, O103, O111 et O118 étaient positives pour la sonde LifA (les gènes lifA codent pour des adhésines encore peu caractérisées), mais pas celles appartenant aux sérogroupes O145 et O157; iii) des proportions variables de souches appartenant à ces différents sérogroupes étaient positives pour la sonde Iha (les gènes iha codent aussi pour des adhésines peu caractérisées); et iv) dix souches EPEC bovines O26 sur les douze étudiées étaient positives pour la sonde ClpE (dérivée du gène codant pour la protéine chaperone du fimbria CS31A produit par des souches entérotoxinogènes et septicémiques bovines et porcines dE. coli), alors que les souches EHEC bovines et humaines du même sérogroupe, ainsi que toutes les souches des autres sérogroupes, étaient négatives pour cette sonde. Comme les souches EHEC O157 et O145 présentent le même pathotype, il semblerait que la présence des gènes lpfA et labsence des gènes lifA soient associées plus à un pathotype particulier quà un, ou quelques sérogroupes. En ce qui concerne les résultats avec la sonde ClpE sur les souches EPEC bovines O26, il est possible que ces souches ne possèdent pas lopéron clp complet puisque toutes les souches étaient négatives pour la sonde clpG (codant pour la sous-unité majeure du fimbria CS31A). Il est cependant aussi possible que le gène clpE-like de ces souches appartienne à un opéron complet dont la sous-unité majeure soit différente de ClpG. Enfin, la recherche des gènes intervenant dans la biosynthèse dadhésines de la famille Afa (Afa III, Afa VII, Afa VIII and F1845), surtout produites par des souches uropathogènes humaines et sur certaines souches septicémiques animales, dans la collection des souches VTEC dorigine bovine de sérogroupe O8 et O20 a permis la mise en évidence de deux souches VTEC de sérogroupe O8 qui possèdent les gènes afa-8D/afa-8E et qui expriment ladhésine Afa 8E. Au cours de nos travaux une série de résultats, qui pourront amener à une meilleure compréhension des mécanismes de pathogénicité et des souches EPEC, EHEC et VTEC ont été réalisés. Cependant, lobjectif général du projet - la description de facteurs spécifiques de lhôte impliqués dans le processus dadhérence initiale des souches EPEC, EHEC et VTEC bovines permettant la colonisation intestinale, afin de pouvoir les diagnostiquer et de les typer de manière spécifique - na pas été atteint. A court terme, les compléments de travaux à envisager sont la poursuite des essais didentification de lépitope reconnu par lanticorps monoclonal 2F3 et le rôle dans ladhérence aux cellules eucaryotes, comme les entérocytes bovines et humains, des adhésines dont les gènes ont été détectés dans les souches EHEC et EPEC bovines et humaines appartenant à différentes sérogroupes.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2009.

Shigatoxin-producing Escherichia coli (STEC) can cause infections in humans which can beserious and sometimes fatal. There is a great need for methods that are able to detect differentserogroups of STEC. In this project, conventional and real-time PCR assays for detection ofSTEC O104:H4 and O121, as recommended by the European Union Reference Laboratory(EU-RL) for STEC, were validated. The specificity, limit of detection, repeatability,efficiency and robustness were determined for three real-time PCR assays. The validationshowed that the real-time PCR reactions were specific and sensitive although some additionaltests are required.