Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal. / Recognized in 1982 as a human pathogen, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) causes bloody diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS). EHEC belonging to serotype O157:H7 are mostly important in North America, United Kingdom and Japan. Shiga toxin (Stx) is the critical factor of STEC. Stx is capable to interrupt the protein synthesis of the eukaryotic cell. Two subgroups of Stx are known, Stx1 and Stx2. Two variants of Stx1 are known (Stx1c and Stx1d), but several Stx2 variants have been described. Epidemiological studies suggest that STEC/EHEC strains carrying the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are more frequently associated to HUS. Besides the expression of Stx, EHEC O157:H7 colonize the intestinal mucosa inducing the formation of characteristic histopathological lesions denominated attaching/effacing (A/E). To the production of A/E lesions, it is necessary the presence of a pathogenicity island called LEE (locus of enterocyte effacement), composed by five operons, LEE 1 to LEE5. An outer membrane adhesin (intimin) and its receptor Tir, which is translocated by a type three secretion sytem (TTSS), are both codified in LEE5 while the secreted proteins EspA, B and D, that constitute part of the SSTT, are codified in LEE4. Cattle are the main reservoir of this pathogen and foods of bovine origin and products contamined with bovine feces are common causes of epidemic outbreaks. In Brazil, EHEC O157:H7 can be isolated from the animal reservoir . Stx2c prevails among the bovine strains, while the toxigenic profiles Stx2 or Stx2/Stx2c are found among the human strains. Concerning the bacterial interaction with human enterocytes cultivated in vitro (Caco-2) we verified that both bovine and human strains showed almost identical ability to invade and to persist in the intracellular compartment of the Caco-2 cells. However, in comparison with the human strains, the bovine strains showed a reduced capacity to produce A/E lesions according to the FAS test. A quantitative FAS test confirmed the relative inefficiency of bovine strains to induce A/E lesions. We also used qPCR to follow the transcription of three genes (eae, espA and tir) of selected bovine and human strains, during the infection of Caco-2 cells. We verified differences in the gene expression, especially for espA, between bovine and human strains and these latter showed a larger expression, in line with the findings of the actin-aggregation tests. Through cloning and expression of recombinant proteins, we purified the Eae, EspA and Tir proteins and obtained specific antibodies, employed to follow the expression of those proteins, by immunofluorescence, along the infection of Caco-2 cells. We found that all proteins are detected both in bovine and human strains, but on these protein labeling occurs early and becomes more intense with the progress of the infection. Our results indicate that EHEC O157:H7 strains isolated from the bovine reservoir in Brazil shows, in comparison to strains isolated from human disease, important differences in relation to the toxigenic profile and the ability to induce A/E lesions. Our findings concerning the ability of the microorganism to invade and to multiply inside enterocytes can explain the persistence of the pathogen in the animal reservoir and its ability of horizontal transmission.

Os compostos de origem microbiana tem readquirido interesse pela biodisponibilidade, especificidade de alvo e diversidade química, mas as vias biosintéticas permanecem crípticas em condições de cultura. Uma estratégia para expressa-las é a super-expressão de genes ativadores. O laboratório de Bio-Produtos no ICB na USP tem trabalhado com Streptomyces olindensis produtor da Cosmomicina D uma molécula com atividade antitumoral de interesse devido ao padrão de glicosilação. O genoma de S. olindensis foi sequenciado e submetido ao NCBI (JJOH00000000) e utilizando o software antiSMASH foram identificados 33 clusters envolvidos na produção de metabolitos secundários. Encontraram-se clusters gênicos para a produção de metabolitos como Melanina, Geosmina, entre outros. Além, foi realizada uma analise de genômica comparativa para caracterizar e anotar as 22 vias biossintéticas desconhecidas em S. olindensis. Finalmente, escolheram-se a via do aminociclitol e um Policetídeo Tipo I para a super-expressão de genes reguladores levando a detecção do composto sob condições de cultura. / Microbial metabolites regain interest due to its bioavailability, target specificity and chemical diversity, but the biosynthetic pathways remain silenced under culture conditions. A strategy to obtain them is the over expression of regulatory genes. Bio-products laboratory at USP has been working with Streptomyces olindensis, products of Cosmomycin D, an antitumoral molecule with a distinctive glycosylation pattern. S. olindensis genome was sequenced and submitted to NCBI (JJOH00000000) and employing antiSMASH server 33 secondary metabolite related clusters were identified. Known pathways were found such as genes for melanin production, Geosmin and others. Additionally, a comparative genomic approach was used to characterize the 22 biosynthetic unknown pathways described in S. olindensis. Subsequently, Aminocyclitol and Polyketide Type I were chosen to evaluated, over expressing the regulatory genes, leading to the compound detection in regular culture conditions.

Os compostos de origem microbiana tem readquirido interesse pela biodisponibilidade, especificidade de alvo e diversidade química, mas as vias biosintéticas permanecem crípticas em condições de cultura. Uma estratégia para expressa-las é a super-expressão de genes ativadores. O laboratório de Bio-Produtos no ICB na USP tem trabalhado com Streptomyces olindensis produtor da Cosmomicina D uma molécula com atividade antitumoral de interesse devido ao padrão de glicosilação. O genoma de S. olindensis foi sequenciado e submetido ao NCBI (JJOH00000000) e utilizando o software antiSMASH foram identificados 33 clusters envolvidos na produção de metabolitos secundários. Encontraram-se clusters gênicos para a produção de metabolitos como Melanina, Geosmina, entre outros. Além, foi realizada uma analise de genômica comparativa para caracterizar e anotar as 22 vias biossintéticas desconhecidas em S. olindensis. Finalmente, escolheram-se a via do aminociclitol e um Policetídeo Tipo I para a super-expressão de genes reguladores levando a detecção do composto sob condições de cultura. / Microbial metabolites regain interest due to its bioavailability, target specificity and chemical diversity, but the biosynthetic pathways remain silenced under culture conditions. A strategy to obtain them is the over expression of regulatory genes. Bio-products laboratory at USP has been working with Streptomyces olindensis, products of Cosmomycin D, an antitumoral molecule with a distinctive glycosylation pattern. S. olindensis genome was sequenced and submitted to NCBI (JJOH00000000) and employing antiSMASH server 33 secondary metabolite related clusters were identified. Known pathways were found such as genes for melanin production, Geosmin and others. Additionally, a comparative genomic approach was used to characterize the 22 biosynthetic unknown pathways described in S. olindensis. Subsequently, Aminocyclitol and Polyketide Type I were chosen to evaluated, over expressing the regulatory genes, leading to the compound detection in regular culture conditions.

Parmi les agents qui modulent la dynamique des populations, le parasitisme est important mais souvent négligé. Il est urgent non seulement d’inventorier les différentes espèces de parasites, mais aussi de comprendre la sensibilité des hôtes à l’infection (notamment des bivalves) et étudier les interactions entre les parasites et les autres facteurs environnementaux. Par conséquent, cette thèse avait comme objectif principal de caractériser et de quantifier les communautés de trématodes (les plus abondants et répandus des macroparasites de bivalves dans les eaux côtières) qui infectent Cerastoderma edule (coque) et Donax trunculus (telline), deux des bivalves les plus importants au Portugal et en France d’un point de vue écologique et économique.Dans un premier temps, la dynamique des populations de bivalves a été étudiée en tenant compte de la relation entre la température et la période de recrutement et des effets en retour du recrutement sur la biomasse adulte. Pour cela, une base de données a été analysée couvrant 17 ans d’observations mensuelles d’une population de coques dans une réserve nationale (Banc d’Arguin, Arcachon, France). Ces observations à long terme ont montré que la durabilité d’une population de coques dépend du succès du recrutement. Pour les coques, le succès du recrutement a été montré comme étant en partie, mais pas totalement, dépendant de la température. Ainsi, la durée de vie d’une cohorte pourrait être estimée plus tôt, grâce à des indices se produisant en amont du recrutement. Suite à ces résultats, le rôle du parasitisme dans la dynamique des populations de bivalves a été étudié.Premièrement, en raison de leur forte pathogénicité pour les bivalves, une attention particulière a été accordée aux parasites Bucephalus minimus et Bacciger bacciger qui utilisent C. edule et D. trunculus, respectivement, comme premier hôte intermédiaire (où se développe le stade parasitaire sporocyste). [...]Deuxièmement, cette étude s’est concentrée sur l’infection des bivalves par les métacercaires, c’est-à-dire lorsqu’ils servent de second hôte intermédiaire dans le cycle de vie du parasite. […]Enfin, la sensibilité des bivalves à l’infection parasitaire a été évaluée expérimentalement lorsqu’ils sont confrontés à des facteurs liés au changement climatique (salinité, température et pH) et à la contamination (arsenic). Les résultats ont montré que l’exposition de l’hôte à des conditions de stress liées à des scénarios de changement global peut modifier le succès de l’infection parasitaire et altérer les réponse biochimiques de l’hôte.Les résultats présentés dans cette thèse ont amélioré la connaissance des effets de différentes variables sur les bivalves, soulignant le rôle crucial du parasitisme. S’ils sont appliqués, ces nouveaux concepts peuvent promouvoir la gestion durable des bivalves, une ressource marine importante, en augmentant son potentiel de production et donc son potentiel économique. / Among population dynamics drivers, parasitism is significant but often neglected. Beyond inventory of the various parasites, it is urgent to understand the susceptibility of hosts, namely bivalves, to infection, and to investigate the interaction among parasites and other environmental conditions.In this way, the present study aimed to characterize and quantify the trematode macroparasites, the most abundant and prevalent in coastal waters, infecting Cerastoderma edule and Donax trunculus, which are among the most ecologically important and economically explored bivalve species in Portugal and France.The first step was to study bivalve population dynamics, evaluating the relationship between temperature and recruitment timing and the reciprocal effects of recruitment on adult biomass. For this, a large database spanning 17 years of monthly observations of a cockle population inhabiting a national protected area (Banc d’Arguin, Arcachon, France) was analysed. Long-term observations showed that the sustainability of a cockle population is recruitment-success dependent. In cockles, recruitment success showed to be partly, but not only, dependent on temperature. Hence, the sustainability of a cohort could be set earlier, i.e. by processes happening before recruitment. Following this clue, the role of parasitism on the bivalve host population dynamics was explored.Firstly, due to high pathogenicity for bivalves, special attention was given to the parasites Bucephalus minimus and Bacciger bacciger which use C. edule and D. trunculus, respectively, as first intermediate hosts (where their sporocysts parasitic stage develops). […]Then, the study focused on metacercariae infection in its bivalve second intermediate host, a relationship that is usually reported as less deleterious. […]Lastly, the susceptibility of bivalves to parasites infection when challenged by climate change related factors (salinity, temperature and pH) and contamination (Arsenic) was experimentally assessed. Main results showed that hosts exposure to stressful conditions related to global change scenarios can modify the parasite infection success and induced host biochemical response alterations.The findings presented in this thesis improved the knowledge on the effects of different constraints on bivalves, highlighting the crucial role of parasitism. If applied, these new insights can promote the sustainable management of bivalves, such an important marine resource, with greater production and economic potential. / Entre os agentes que modulam a dinâmica populacional, o parasitismo é significativo masmuitas vezes negligenciado. É urgente não só inventariar as várias espécies de parasitas, bem comocompreender a suscetibilidade dos hospedeiros à infeção (nomeadamente os bivalves) e investigar ainteração entre os parasitas e outras condições ambientais. Pelo que, esta tese teve como objetivoprincipal caracterizar e quantificar os macroparasitas trematodes (os mais abundantes e prevalentesem águas costeiras) que infetam Cerastoderma edule (berbigão) e Donax trunculus (conquilha), doisdos bivalves mais importantes em Portugal e França tanto do ponto de vista ecológico comoeconómico.Primeiramente, a dinâmica populacional dos bivalves foi estudada, tendo em conta a relaçãoentre a temperatura e o período de recrutamento e os efeitos recíprocos do recrutamento nabiomassa de adultos. Para isso, foi analisada uma base de dados abrangendo 17 anos deobservações mensais de uma população de berbigões que habitam uma área nacional protegida(Banc d’Arguin, Arcachon, França). Estas observações de longa duração mostraram que asustentabilidade de uma população de berbigão é dependente do sucesso do recrutamento. Emberbigões, o sucesso do recrutamento mostrou ser em parte, mas não totalmente, dependente datemperatura. Por esta razão, a sustentabilidade de uma coorte pode estar a ser estabelecida maiscedo, isto é, por processos que acontecem antes do recrutamento. Seguindo esta pista, o verdadeiropapel do parasitismo na dinâmica populacional dos bivalves foi mais explorado.De seguida e devido à elevada patogenicidade para os bivalves, foi dada especial atençãoaos parasitas Bucephalus minimus e Bacciger bacciger que usam C. edule e D. trunculus,respetivamente, como primeiros hospedeiros intermediários (onde o estádio parasítico esporocisto sedesenvolve). […].Depois, este estudo focou-se na infeção dos bivalves por metacercariae, ou seja, quandoservem de segundos hospedeiros intermediários no ciclo de vida do parasita. […]Por fim, foi experimentalmente avaliada a suscetibilidade dos bivalves à infeção por parasitasquando desafiados por fatores relacionados com as alterações climáticas (salinidade, temperatura epH) e contaminação (Arsénio). Os resultados mostraram que a exposição dos hospedeiros acondições de stress relacionadas com cenários de alterações globais podem modificar o sucesso dainfeção parasitária e induzir alterações na resposta bioquímica do hospedeiro.As descobertas apresentadas nesta tese melhoraram o conhecimento dos efeitos dediferentes variáveis nos bivalves, salientando o papel crucial do parasitismo. Se aplicados, estesnovos pontos de vista podem promover a gestão sustentável dos bivalves, um recurso marinho tãoimportante, aumentando o seu potencial de produção e económico.