ARAÚJO. I. V. Anemia falciforme: crises vaso-oclusivas parecem estar relacionadas à redução da concentração de proteínas na membrana eritrocitária. 2015. 75 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2015. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T14:39:18Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_ivaraujo.pdf: 2013061 bytes, checksum: 46f0a4a730017e6a50ea1794feb4d555 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T14:42:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_ivaraujo.pdf: 2013061 bytes, checksum: 46f0a4a730017e6a50ea1794feb4d555 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T14:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_ivaraujo.pdf: 2013061 bytes, checksum: 46f0a4a730017e6a50ea1794feb4d555 (MD5) Previous issue date: 2015 / Sickle cell anemia is a common genetic disorder resulting from a specific change in position six of the hemoglobin gene, which results in different alleles, which when transcribed, codes for hemoglobin S which leads to the formation of sickle erythrocytes. Red blood cells containing hemoglobin S acquire in hypoxic conditions, the sickle-shaped, causing vaso-occlusive crisis in patients. This study aimed to isolate erythrocyte membrane proteins of patients with sickle cell anemia (in symptomatic and asymptomatic stages) and to correlate changes identified in these periods, using High Performance Liquid Chromatography (HPLC - ion exchange), SDS-PAGE (1D and 2D) and Mass Spectrometry (MS-ESI)). Was performed proteomic analysis in erythrocyte membrane proteins obtained from peripheral blood samples from three patients, collected over two years, and separated according to the presence (PC) or absence of vaso-occlusive crisis (PSC) at the time of collection. The control group consisted of two individuals with no diagnosis of hemoglobinopathies. We identified the presence of a higher concentration of membrane proteins in sickle cell erythrocytes, particularly in CSP patients and showed that during attacks the amount of protein present in the erythrocyte membrane of patients undergoes reduction (20.7% -PC1; 34 2% - PC3 and 45.2% - PC2). Among the 159 membrane proteins extracted from sickle cell erythrocytes, 148 were identified and 11 were not identified, using as parameter the database ExPASy TagIdent. Among the proteins not identified, six were extracted from the plasma membrane of PC patients and five PSC patients. The identification of PRDX2 protein (peroxiredoxin with an apparent molecular mass of 41 kDa) with an apparent molecular weight below 30 kDa, suggesting the structural change of this protein. Failure to identify 11 proteins extracted membrane of sickle cell erythrocytes suggests quantitative changes in protein expression of these patients. Our results also suggest that the vaso-occlusive crises may be related to a reduction in total protein concentration of the erythrocyte membrane in patients. / A anemia falciforme é uma doença genética frequente, decorrente de uma modificação pontual na posição seis do gene da hemoglobina, que resulta em alelos diferentes, que quando transcrito, codifica a hemoglobina S, que leva a formação das hemácias falcêmicas. As hemácias contendo hemoglobina S adquirem, em condições de hipóxia, a forma de foice, causando crise vaso oclusiva nos portadores. O presente trabalho teve como objetivo isolar proteínas da membrana eritrocitária de pacientes com anemia falciforme (nas fases sintomática e assintomática) e correlacionar alterações identificadas nestes períodos, utilizando Cromatografia Líquida de Alta Pressão (HPLC)-Troca iônica, SDS-PAGE 1D e 2D e Espectrometria de Massa (MS). Foi realizada análise proteômica em proteínas de membrana eritrocitária obtidas de amostras de sangue periférico de três pacientes, colhidas ao longo de dois anos, e separadas de acordo com a presença (PC) ou ausência de crise vaso oclusiva (PSC) no momento da coleta. O grupo controle foi formado por dois indivíduos sem diagnóstico de hemoglobinopatia. Foi identificada a presença de maior concentração de proteínas na membrana de eritrócitos falcêmicos, em especial nos pacientes PSC e evidenciou-se que durante as crises a quantidade de proteína presente na membrana do eritrócito dos pacientes sofre redução (20,7% - PC1; 34,2% - PC3 e 45,2% - PC2). Dentre as 159 proteínas extraídas da membrana de eritrócitos falcêmicos, 148 foram identificadas, e 11 não foram identificadas, usando-se como parâmetro a base de dados TagIdent ExPASy. Dentre as proteínas não identificadas, seis foram extraídas da membrana eritrocitária de pacientes PC e cinco de pacientes PSC. A identificação da proteína PRDX2 (uma peroxirredoxina com massa molecular aparente de 41 kDa) com massa molecular aparente inferior a 30 kDa sugere a alteração estrutural desta proteína. A não identificação de 11 proteínas extraídas da membrana de eritrócitos falcêmicos sugere alteração quantitativa na expressão proteica destes pacientes. Nossos resultados sugerem ainda que as crises vaso-oclusivas podem estar relacionadas a uma redução na concentração total de proteínas da membrana eritrocitária nos pacientes.

ALVES FILHO, João Garcia. Análise transcriptomica e proteômica de sementes de cajueiro (Anacardium occidentale L.) visando aplicações biotecnológicas. 2013. 171 f. Tese (Doutor em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-23T18:20:06Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_jgalvesfilho.pdf: 9659761 bytes, checksum: 210b8d3f56c4d6d39bdfdc54615e7431 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-23T19:31:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_jgalvesfilho.pdf: 9659761 bytes, checksum: 210b8d3f56c4d6d39bdfdc54615e7431 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T19:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_jgalvesfilho.pdf: 9659761 bytes, checksum: 210b8d3f56c4d6d39bdfdc54615e7431 (MD5) Previous issue date: 2013 / The cashew (Anacardium occidentale L.) is an important Brazilian plant species occurring especially in the northeast region. In nature, there are basically two types of cashew, the common also known as giant, and dwarf cashew which show low size and precocity for fruit production. The fruit of the cashew (cashew-nut) is a source of lipids and proteins, it has been utilized to food in the world. However, the sub-product commercialization of cashew-nut had shown special attention by presence of allergenic proteins. Futhermore, the potentialities of the cashew use are limited due to lack of molecular data. Thus, the present study aimed to establish an overview about transcripts and proteins from cashew-nut through transcriptome and proteome analysis. For this purpose, seeds of the common and dwarf CCP 76 cashew in maturation were used to obtain messenger RNA. After sequencing by Illumina platform with 4x average coverage, we obtained sequences with Phred score above 30. The transcriptome assembly revealed 37,422 and 77,371 contigs, relative to complementary DNA fragment of seeds of the common and dwarf CCP 76 cashew, respectively. The percentage of transcriptome sequences identified by BLAST varied of 15.2 to 45.9% for CCP 76 and common cashew, respectively. The comparative analysis between the two genotypes allowed the identification of tree new polymorphic microsatellites. Additionally, the proteome analysis of seed quiescent of both common cashew and dwarf CCP 76, CCP 09, BRS 226 e BRS 275 genotypes showed presence of six different expressed proteins. In summary, transcriptome and proteome analysis contributed to addition of new molecular data for A. occidentale L., as well as allowed the identification of possible marks with high biotechnological potential. / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma importante espécie vegetal brasileira, ocorrendo especialmente na região Nordeste. Na natureza, existem basicamente dois tipos de cajueiros: o tipo comum, também conhecido como gigante, e o cajueiro anão-precoce, o qual apresenta baixo porte e precocidade na produção de frutos. O fruto do cajueiro (castanha-de-caju) é fonte de lipídeos e proteínas, sendo utilizado como alimento no mundo todo. No entanto, a comercialização de subprodutos da castanha-de-caju tem mostrado atenção especial devido à presença de proteínas alergênicas. Além disso, as potencialidades de uso do cajueiro são limitadas devida a carência de dados moleculares. Assim, o presente trabalho tem como objetivo estabelecer um panorama geral sobre transcritos e proteínas de castanhas de cajueiro por meio de análise transcriptômica e proteômica. Com esta finalidade, sementes em maturação de cajueiro comum e anão CCP 76 foram utilizadas para obtenção de RNA mensageiro. Posterior sequenciamento por plataforma Illumina com cobertura média de 4x, obtiveram-se sequências com qualidade Phred acima de 30. A montagem do transcriptoma revelou 37.422 e 77.371 sequências contíguas, relativa aos fragmentos de DNA complementares de sementes de cajueiro comum e anão CCP 76, respectivamente. O percentual de sequências do transcriptoma identificadas pelo BLAST variou de 15,2 a 45,9% para o cajueiro CCP 76 e comum, respectivamente. Análise comparativa entre os dois genótipos permitiu a identificação de três novos microssatélites polimórficos. Adicionalmente, a análise do proteoma de sementes quiescentes do cajueiro comum, juntamente com os genótipos anão-precoce CCP 76, CCP 09, BRS 226 e BRS 275 mostrou a presença de seis proteínas diferencialmente expressas. Em suma, as análises transcriptômica e proteômica realizadas no presente estudo contribuíram para a adição de novos dados moleculares para A. occidentale L., assim como permitiram a identificação de possíveis marcadores com grande potencial biotecnológico.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2012-10-26T12:16:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 303335.pdf: 7527707 bytes, checksum: 3905e085925065f9d8f7a15fc27cd6b8 (MD5) / O pré-condicionamento induzido por N-metil-D-aspartato (NMDA) é uma poderosa ferramenta terapêutica contra insultos neuronais posteriores, por diversas razões: administração periférica, interação específica com receptores NMDA (NMDAR) e pelo quadro de neuroproteção gerado. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na geração do pré-condicionamento por NMDA no cérebro. A descoberta do mecanismo de sinalização celular gerado é crucial para delinear novas abordagens neuroprotetoras. Por essa razão, o objetivo deste trabalho foi investigar os possíveis mecanismos envolvidos no pré-condicionamento por NMDA utilizando uma abordagem proteômica para identificar proteínas expressas entre os camundongos pré-condicionados após 24h de administração de NMDA e após 1h e 72h de indução com NMDA (não protegidos). Ao grupo controle foi administrado solução salina (0,9% NaCl) e os demais grupos foram sacrificados após 1 hora, 24 horas ou 72 horas de administração com N-metil-D-aspartato (NMDA, 75mg/Kg de animal). O hipocampo de cada animal foi removido para extração das proteínas totais. Foram aplicados 250 mg / mL de proteína para análise em gel bidimensional (pI linear 3-10, gel SDS-PAGE 12,5%). Em seguida, os géis 2-DE foram corados com Coomassie Briliant Blue G-250 e analisados no programa Image Master 7.0 Platinum. A média de intensidade dos spots foram analisados (dados em % volume) entre os diferentes tempos de indução (1h, 24h e 72h). Foram encontradas seis proteínas com expressão diferencial significante com p <0,05 com base em ANOVA duas vias e Bonferroni pós-teste, sendo que quatro proteínas indicaram níveis de expressão elevada em 24h (proteína de choque térmico 70 kDa (HSP70), creatina cinase, aspatil-tRNA sintetase e proteína de ligação a fosfatidiletanolamina) e duas mostraram expressão diminuída (proteína de choque térmico 70 kDa (HSP70) e a proteína vacuolar V-ATPase). Além disso, a identificação e caracterização por espectometria de massa (MALDI-TOF) de 22 proteínas não alteradas mostrou-se útil, uma vez que essas proteínas desempenham funções celulares cruciais e também são necessárias para a geração da neuroproteção, entre essas se destacaram duas proteínas detectadas somente nos animais protegidos após 24h de administração com NMDA: subunidades alfa e beta da proteína de choque térmico 90 kDa (HSP90) e uma subunidade de HSP70. Todos esses resultados indicam que são necessárias diversas vias intracelulares associadas para mediar o pré-condicionamento e a neuroproteção. A identificação das proteínas relacionadas ao pré-condicionamento podem ajudar a elucidar os mecanismos celulares e moleculares de prevenção bem como na descoberta de novos alvos terapêutico por meio da determinação de uma janela de tempo mais efetiva nos tratamentos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-26Bitstream added on 2014-06-13T20:50:00Z : No. of bitstreams: 1 vieira_gal_me_araiq.pdf: 2780789 bytes, checksum: 822f36edcc6ae68080d4ff7d0cca2cdf (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O protozoário hemoflagelado, Trypanosoma cruzi, transmitido principalmente pelo inseto triatomíneo, por infecção congênita ou por transfusão sanguínea, causa a tripanossomíase americana ou doença de Chagas, como é mais conhecida. Essa é uma séria doença parasitária que ocorre na América Latina, com considerável impacto social e econômico. Dois fármacos, nifurtimox e benzonidazol, são indicados no tratamento de pessoas infectadas, mas são pouco eficientes na fase aguda e praticamente ineficientes na fase crônica da doença. Devido a esses fatores, é de extrema importância que se encontre agentes quimioterápicos e/ou quimiopreventivos mais eficientes e eficazes. O presente trabalhou objetivou avaliar a influência no proteoma de T. cruzi de três substâncias extraídas de plantas da família Piperaceae, peperobtusina A e B de Peperomia obtusifolia e piplartina de Piper tuberculatum, através da eletroforese bidimensional (2D) – DIGE (Difference Gel Electrophoresis - GE Healthcare) associada à espectrometria de massas. O tratamento realizado com peperobtusina A de Peperomia obtusifolia em cepa Y de T. cruzi identificou proteínas de interesse, como proteína do bastão paraflagelar e triparedoxina peroxidase, importantes na composição flagelar e proteção natural do parasito ao estresse oxidativo, respectivamente. Os resultados obtidos com peperobtusina B de Peperomia obtusifolia na mesma cepa de T. cruzi mostraram proteínas que podem servir como interessantes alvos potenciais para futuro desenvolvimento de fármacos. São elas: calmodulina, tirosina aminotransferase e arginina quinase. Os resultados obtidos com o tratamento das cepas Y e Bol de T. cruzi pela piplartina de Piper tuberculatum demonstraram que apesar das diferenças de suscetibilidade dessas cepas em relação ao benzonidazol... / The protozoa hemoflagelate, Trypanosoma cruzi, transmitted mainly for the triatomíneo insect, congenital infection or sanguineous transfusion, cause American tripanosomiasis or Chagas disease, as more it is known. This is a serious parasitic illness that occurs in Latin America, with considerable social and economic impact. Two drugs, nifurtimox and benznidazol, are indicated in the treatment of infected people, but they are little efficient in the acute phase and practically inefficient in the chronic phase of the illness. Because of these factors, it is of extreme importance find efficient chemopreventive and/or chemotherapic agents. This work aims to evaluate the T. cruzi proteome influence of three substances extracted of plants belonging to Piperaceae family, being peperobtusine A and B of Peperomia obtusifolia and piplartine of Piper tuberculatum, through two dimensional electrophoresis (2D) - DIGE (Difference Gel Electrophoresis - GE Healthcare) and mass spectrometry. The treatment carried with peperobtusine A of P. obtusifolia in Y strain of T. cruzi identified interest proteins, as paraflagelar rod protein and triparedoxin peroxidase, important in the flagella composition and natural protection of oxidative stress, respectively. The results using peperobtusine B of the P. obtusifolia in Y strain of T. cruzi showed proteins that can be interesting potential targets for future development of drug. They are: calmodulin, tyrosine aminotransferase and arginine kinase. The results with the treatment of Y and Bol strains of T. cruzi with piplartine of P. tuberculatum demonstrated that although to the differences of susceptibility of these strains related to benznidazol, the piplartine was active for both strains as a similar way and modified the expression of enzymes involved in the protection of the parasitic to the... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-30T18:09:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Nojosa Oliveira - 2014.pdf: 3496210 bytes, checksum: ee39300fc3e6a76f167fcc74a33b646f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-30T18:10:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Nojosa Oliveira - 2014.pdf: 3496210 bytes, checksum: ee39300fc3e6a76f167fcc74a33b646f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-30T18:10:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Nojosa Oliveira - 2014.pdf: 3496210 bytes, checksum: ee39300fc3e6a76f167fcc74a33b646f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-08-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic disease in Latin America caused by fungi of the genus Paracoccidioides which is composed of two species P. lutzii e P. brasiliensis. The fungus grows as mycelium in saprophytic environment, and as yeast in host. Paracoccidioides spp present multinucleated yeast cells. The characterization of the nuclear proteome an important step to understand the biology of the fungus, and contributes to future studies of possible pharmacological targets. In this study we aimed to characterize the profile of the nuclear proteome of Paracoccidioides species in yeast form. A total of 570 proteins were identified and classified as nuclear, using a combination of method sample enrichment, proteomic of high accuracy technique, NanoUPLC-MS E , and bioinformatic filters. The results revealed important proteins related to DNA maintenance, regulation and gene expression, synthesis and processing of messenger and ribosomal RNA and nuclear-cytoplasmic traffic. Uncharacterized proteins and proteins commonly known as cytoplasmic were identified in fraction enriched nuclear and require further studies to demonstrate its nuclear roles. This is the first descriptive nuclear proteome of Paracoccidioides spp. and opens the way for new researches. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença endêmica da América Latina causada pelos fungos do gênero Paracoccidioides contituído de duas espécies P. lutzii e P.brasiliensis. O fungo cresce como micélio no ambiente saprofítico, e como levedura no hospdeiro. As células leveduriformes de Paracoccidioides spp. apresentam-se multinucleadas. Caracterizar o perfil protéico nuclear é um importante passo para compreender a biologia do fungo, e contribui para estudos futuros de possíveis alvos farmacológicos. Neste trabalho objetivamos caracterizar o perfil do proteoma nuclear das espécies de Paracoccidioides nas formas leveduriformes. Um total de 570 proteínas foram identificadas e classificadas como nucleares utilizando a combinação de um método de enriquecimento da amostra, uma técnica proteômica de alta acurácia, NanoUPLC-MS E , e a aplicação de filtros de bioinformática. Os resultados revelaram importantes proteínas relacionadas à manutenção do DNA, regulação e expressão gênica, síntese e processamento de RNA mensageiro e ribossomal e transporte núcleo-citoplasma. Proteínas não caracterizadas e proteínas comumente conhecidas como citoplasmáticas foram identificadas na fração enriquecida nuclear e necessitam de estudos adicionais para elucidar seus papéis nucleares. Esse é o primeiro trabalho proteômico descritivo do núcleo de Paracoccidioides spp., onde demonstra novas moléculas para estudos futuros.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os componentes da parede celular sao os principais responsaveis pela interacao fungo-hospedeiro. A tese apresentada mostra a caracterizacao proteica e lipidica da parede celular dos isolados Pb3 e Pb18 de P. brasiliensis, que pertencem a grupos filogeneticos diferentes e provocam um perfil distinto de infeccao em modelo murino. Proteinas plasmaticas aderidas a parede celular do isolado Pb3, menos virulento,tambem foram identificadas, sendo que aquelas relacionadas com transporte, ativacao/regulacao do sistema complemento e coagulacao foram as mais abundantes. A interacao de muitas delas com componentes fungicos, como por exemplo clusterina, hemopexina, transtiretina, ceruloplasmina, alfa-1-antitripsina, apolipoproteina A-1 e apolipoproteina B-100, foi relatada pela primeira vez. A incubacao de leveduras com plasma aumentou sua internalizacao em ensaio de fagocitose in vitro, ressaltando a importancia do plasma na relacao patogeno-hospedeiro. A analise dos componentes lipidicos da parede celular foi realizada em leveduras de Pb3 e Pb18 cultivadas na presenca ou ausencia de plasma humano. Foram identificadas 49 (Pb3) e 38 (Pb18)especies de fosfolipideos de diversas classes. Os acidos graxos C18:1 e C18:2 foram mais abundantes, e C18:2 predominou em Pb18 em relacao a Pb3. Brassicasterol foi o esterol predominante em ambos os isolados, e a presenca de plasma no meio de cultura aumentou sua abundancia, principalmente em Pb3. Hex-C18:0-OH/dC19:2-Cer foi a principal monohexosilceramida identificada em ambos os isolados. A composicao proteica da parede celular de Pb3 e Pb18 em ambas as fases morfologicas foi analisada por cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) e 208 (Pb3 micelio), 164 (Pb3 levedura), 148 (Pb18 micelio), e 239 (Pb18 levedura) proteinas foram identificadas e classificadas em categorias funcionais. Entre as 132 proteinas identificadas somente na fase leveduriforme, 92 tambem foram exclusivas de Pb18, muitas delas com potencial papel na interacao parasita-hospedeiro. 80% das proteinas foram classificadas como secretadas e 60% apresentaram ortologos em vesiculas extracelulares de fungos, sugerindo a participacao dessas estruturas na composicao da parede celular. Adicionalmente, uma mini-revisao e um capitulo de livro foram escritos agrupando as informacoes existentes sobre a parede celular de P. brasiliensis. Acreditamos que esta analise comparativa entre dois isolados de P. brasiliensis com perfis de virulencia distintos ajudara a esclarecer o papel das proteinas plasmaticas e dos componentes proteicos e lipidicos da parede celular na interacao fungo-hospedeiro / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_4754_.pdf: 2849281 bytes, checksum: c3db49853a54a0d93c32aa4621d48f0d (MD5) Previous issue date: 2011-04-05 / Leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica, fatal se não tratada, causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania complexo donovani, o qual abriga a espécie L. chagasi. O tratamento da LV conta com poucas opções terapêuticas, incluindo os antimoniais petnavalentes, anfotericina B e a miltefosina. A miltefosina foi recentemente aprovada como a primeira droga de administração oral para o tratamento da LV. Os mecanismos de resistência à miltefosina estão sendo elucidados em linhagens experimentais de Leishmania spp. resistentes a esta droga. Entretanto, os mecnaismos de resistência à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania são poucos conhecidos. Neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese bidimensional acoplada à espectrometria de massas com o objetivo de destacar e identificar proteínas que são diferencialmente experessas entre formas promastigotas de isolados clínicos de L. chagasi sensíveis (S: S1 e S2) e resistentes (R: R1 e R2) Pa miltefosina, obtidos de pacientes com LV que participaram de um estudo clínico realizado no Brasil para avaliar a eficácia dessa droga. Os perfis protéicos obtidos dos isolados clínicos apresentaram em média 459 "spots" correpondendo a 5,7% dos produtos gênicos prditos para Leishmania spp. A análise comparativa entre os perfis protéicos dos isolados clínicos S e R permitiu a detecção de 80 "spots" diferencialmente expressos. Desses 18 "spots" foram encontrados exclusivamente no perfil do grupo S e apenas 1 no grupo R, enquanto 48 "spots" apresentaram diferença quantitativa na expressão protéica entre os grupos. Os demais "spots" foram encontrados em um único isolado (7 em S1, 3 em S2 e 2 em R1) ou em três isolados simultaneamente (1 em S1, S2 e R1). A análise deses "spots" por expectrometria de massas em sistema MALDI/TOF-TOF identificou 49 "spots" (61,3%), os quais correspondem a 32 proteínas distintas e 7 proteínas hipotéticas. Entre proteínas identificadas, a peroxirredoxina (expressão aumentada em R) e uma cistéino peptidase semelhante à calpaína (exclusica do grupo S) forma destacadas por indicar que os isolados resistentes são menos susceptíveis ao processo de morte celular programada. Estes dados sugerem que estas proteínas podem estar relacionadas com o fenótipo resistência à miltefosina. PALAVRAS CHAVES: Leishmania chagasi, miltefosina, resistência, proteoma.

Este trabalho teve como objetivo principal realizar um estudo proteômico diferencial aplicado à amostra Bradyrizobium elkanii (SEMIA 587). Isso se fez através da identificação de proteínas diferencialmente expressas nesta importante bactéria fixadora de nitrogênio quando cultivada em laboratório (in vitro) e quando inoculada em plantas de soja (in vivo). A caracterização das proteínas foi feita com a poderosa técnica de espectrometria de massas, e a análise proteômica com expressão diferencial foi comparada por meio de duas estratégias diferentes: MudPIT e Maldi-QToF. A avaliação das imagens dos géis bidimensionais permitiu verificar que a amostra de bactéria apresentou um número maior de proteínas expressas em relação ao bacterióide. Se comparada ao microrganismo na condição in vitro (bactéria), a espécie fixadora de nitrogênio (bacterióide) apresentou 19 proteínas induzidas e 230 reprimidas. O aumento de expressão observado para as proteínas do bacterióide foi pelo menos duas vezes maior do que o volume normalizado para 17 proteínas e, caiu pela metade (ou mais), para outras 26 proteinas em relação a bactéria. Através de ambas as técnicas (Maldi-QToF e ESI-QToF) empregadas na identificação das proteínas observou-se, comprovando a complementariedade existente entre as metodologias, que os padrões metabólicos tanto em bactéria como bacterióide foram mantidos. Ou seja, bactérias cultivadas em meio YML apresentaram um metabolismo voltado para a síntese celular, denotada pela produção de macromoléculas e metabolismo energético, ao passo que bacterióides, endosimbiontes isolados de nódulos de plantas de soja, apresentaram um metabolismo especialmente dedicado à fixação simbiótica do nitrogênio. / The main goal of this project was to perform a differential proteomic analysis of Bradyrizobium elkanii (SEMIA 587). It was made by the identification of differentially expressed proteins in this important nitrogen fixing bacteria grown under different conditions: in laboratory culture (in vitro) and symbiotically associated with soybean plants (in vivo). The characterization of proteins differentially expressed was done by the powerful technique of mass spectrometry, applying two different strategies: MudPIT and Maldi-QToF. It was possible, after computerized image analysis of 2D gels, to verify that bacteria had more expressed proteins than bacteroids. In vivo bacteria showed 19 proteins induced and 230 suppressed. The increase in expression observed for bacteroids macromolecules was at least two times greater than normalized volume for 17 proteins of the bacteria and two times smaller than 26 bacteria proteins. It was also observed, through Maldi-QToF and ESI-QToF techniques applied to protein identification, that bacteria and bacteroid main metabolic activities were maintained. This fact confirms that the techniques were complementary. The data showed that bacteria cultivated in YML medium had a metabolism direct to cellular synthesis, characterized by production of macromolecules and energetic metabolism. Endosimbiont bacteroids isolated from soyabean nodules showed a metabolism specially dedicated to nitrogen fixation. The results were in agreement with the ambient that each microorganism was originated. The fact that the identified proteins in bacteria were related to translation and aminoacids biosynthesis shows the need that heterotrophic microorganisms have to synthesize its own proteins and enzymes useful for their metabolism. On other hand, since the bacteroids are symbiotically associated with soybean reducing atmospheric nitrogen in an extremely energy-intense process, it is expected that its proteins should be mainly related to biological nitrogen fixation and energetic metabolism.

Mycoplasma genitalium es un patógeno humano asociado con algunas enfermedades de transmisión sexual. Las técnicas proteómicas, además de otras técnicas en análisis de la expresión génica, tienen un papel muy importante en el entendimiento de los mecanismo(s) de patogénesis y fisiología bacteriana. El proteoma de Mycoplasma genitalium, modelo de célula mínima, ha sido extendido utilizando diferentes tecnologías y aproximaciones. El proteoma total de este microorganismo ha sido analizado mediante diferentes metodologías que ofrece la proteómica, gracias a las cuales se ha conseguido la identificación del 85.3% de los ORFs predichos. Además, se ha desarrollado el análisis del subproteoma de membrana. En este sentido, la fracción soluble en TX-114 ha sido analizada así como las proteínas de superficie celular utilizando el marcaje de proteínas de superficie mediante CyDye. Finalmente, la respuesta serológica frente a Mycoplasma genitalium de pacientes infectados y de donantes sanos ha sido analizada para conocer que proteínas bacterianas promueven la respuesta inmune. Por consiguiente, no solo se presenta el análisis proteómico más extenso de Mycoplasma genitalium, sino también el análisis proteico más completo de la membrana de Mycoplasma genitalium además de la respuesta serológica en humanos. / Mycoplasma genitalium is a human pathogen associated with several sexually transmitted diseases. Proteomic technologies, along with other methods for global gene expression analysis, play a key role in understanding the mechanisms of bacterial pathogenesis and physiology. The proteome of M. genitalium, model of a minimal cell, has been extended using a combination of different proteomic approaches and technologies. The total proteome of this microorganism has been analyzed using gel‐based and gel‐free approaches achieving the identification of 85.3% of the predicted ORFs. In addition, a comprehensive analysis of membrane subproteome has been performed. For this purpose, the TX‐114 soluble fraction has been analyzed as well as the surface proteins, using cell surface protein labeling with CyDye. Finally, the serological response of M. genitalium infected patients and healthy donors has been analyzed to identify proteins that trigger immunological response. Here we present the most extensive M. genitalium proteome analysis (85.3% of predicted ORFs) , a comprehensive M. genitalium membrane analysis, and a study of the human serological response to M. genitalium.

Orientador: Ricardo de Oliveira Orsi / Resumo: A geléia real é um alimento exclusivo da abelha rainha que é sintetizado e secretado por abelhas nutrizes. Pouco se sabe sobre a funcionalidade e os componentes proteicos totais da geleia real, e sua associação a diferentes moléculas (ligação metal-proteina, por exemplo). O objetivo do trabalho foi analisar o teor proteico e número de spots da geleia real coletada ao longo do ano, assim como identificar as proteínas dos spots contendo zinco (Zn) e/ou ferro (Fe). A geleia real foi coletada quinzenalmente durante o período de janeiro a dezembro de 2015, de quatro colmeias mini-recria. A determinação dos minerais foi realizada por meio de espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS) e a identificação das proteínas por ESI MS/MS. Os dados obtidos foram avaliados por ANOVA, seguido do teste de Tukey para verificar diferenças entre as médias (P<0,05). Observamos que houve variação tanto no teor proteico como no número de spots da geleia real coletada ao longo do ano. O Zn foi encontrado em maior quantidade de spots analisados em comparação ao Fe ao longo do ano e, nos meses de fevereiro a junho e setembro, estes minerais foram observados simultaneamente em alguns spots. Dentre as proteínas identificadas, destacam-se as Major royal jelly protein - MRJPs, sendo a mais abundante neste trabalho a MRJP2 seguida respectivamente da MRJP3 e MRJP1 (importantes por desempenharem funções nutricionais); além destas proteínas principais também foram identificadas as MRJP5, MRJP6, MRJP7 e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor