Made available in DSpace on 2014-09-09T12:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 21.pdf: 2527128 bytes, checksum: a04af2c4a06eeb1f926017f8e317075e (MD5) Previous issue date: 2012 / Nesse trabalho, foram desenvolvidas metodologias aplicadas ao controle de qualidade de vacinas antimeningocócicas sorogrupo B. Este desenvolvimento se deu com base na avaliação do perfil protéico das preparações vacinais. Para isso, foram desenvolvidas condições de análise para a identificação e caracterização dos antígenos vacinais por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. Muitos antígenos importantes imunologicamente foram identificados e outros antígenos com menor importância também foram caracterizados por espectrometria de massas. Para a avaliação imunológica das preparações vacinais foi produzido um anticorpo policlonal anti-OMV. Esse anticorpo foi capaz de identificar os antígenos majoritários imunologicamente presentes nas preparações. Além do conteúdo do perfil proteico, foi feita a avaliação do conteúdo de LOS em preparações vacinais por metodologia físico-química. A cadeia o-específica do LOS é formada por um oligossacarídeo formado por unidades que se repetem de um açúcar de 8 carbonos denominado KDO (ácido 2-ceto-3-deoxioctulosonico).O KDO funciona como marcador químico da estrutura do LOS e a sua dosagem foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência por troca iônica com detecção amperométrica pulsada. Essa metodologia foi validada frente aos requisitos do INMETRO, e apresentou resultados satisfatórios para método de determinação quantitativa. As metodologias desenvolvidas foram muito importantes para a garantia do direito à saúde, uma vez que é responsabilidade das autoridades sanitárias nacionais assegurarem que os imunobiológicos disponíveis no Brasil, de origem nacional ou não, sejam seguros, de qualidade e eficácia comprovadas, já que a garantia da qualidade dos imunobiológicos se deve, dentre outros motivos, ao fato de que tais produtos são aplicados em grupos de pessoas sadias e as campanhas expõem toda uma faixa etária da população ao insumo. / In this work methodologies for meningococcal serogroup B vaccines were developed. The basic analyses were the protein profile by electrophoresis. For that, spefic conditions for antigen characterization by two dimensional electrophoresis and mass spectrometry were developed. Many of the most important antigens were identified by mass spectrometry, as also some minor antigens. For a immunological evaluation of vaccine preparations, polyclonal antibodies against outer membrane vesicles (OMVs). These antibodies recognize major antigens in the preparation. The content of lipoligosaccharide (LOS) in the preparations were also evaluated. O-specific chain of LOS has a 8 carbon sugar called 2-keto-3-deoxioctolunosic acid (KDO). KDO is a chemical marker of LOS structure; KDO was analyzed using high performance anion exchange chromatography of pulsed amperometric detection. This methodology was validated using INMETRO parameters; It is suitable for quantitative analysis. All developed methodologies are important to heath warranty, since vaccines efficacy, safety and quality are under the responsibility of health authorities in Brazil. Quality in vaccines is very important, since these products are used in a healthy age group of the population.

Submitted by Raquel Birbeire (ensinoicc@fiocruz.br) on 2016-02-12T14:03:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Castro Rodrigues Lucena (final).pdf: 3260035 bytes, checksum: d0b775f25026c251662a16fbc7b5d26d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Birbeire (ensinoicc@fiocruz.br) on 2016-02-15T17:26:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Castro Rodrigues Lucena (final).pdf: 3260035 bytes, checksum: d0b775f25026c251662a16fbc7b5d26d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T17:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Castro Rodrigues Lucena (final).pdf: 3260035 bytes, checksum: d0b775f25026c251662a16fbc7b5d26d (MD5) Previous issue date: 2015 / Instituto Carlos Chagas / Durante a metaciclogênese in vitro, a forma epimastigota de Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, se diferencia em tripomastigota metacíclica após ser submetido a estresse nutricional em meio TAU, com isso, adquire a capacidade de infectar o hospedeiro vertebrado. Durante a diferenciação, os parasitas sofrem diversas adaptações que incluem a modulação de modificações pós-traducionais. Em um trabalho recente, nosso grupo delineou, sem quantificar, o perfil de fosforilação em T. cruzi durante a metaciclogênese. Neste trabalho, visando realizar a quantificação dos sítios de fosforilação, foi utilizada a metodologia SILAC, que marca proteínas durante o cultivo celular, através da incorporação de aminoácidos contendo isótopos pesados. Visando compreender a sinalização através de fosforilação que ocorre nos momentos iniciais de metaciclogênese, ou seja, durante o estresse nutricional, foram selecionados os pontos epimastigotas em crescimento exponencial (epimastigotas 3 dias, EPI-3D) e na fase estacionária (epimastigotas 5 dias – EPI-5D), bem como alguns pontos ao longo do estresse nutricional (5 e 15 minutos, 1 e 2 horas). Para cada ponto experimental, os peptídeos foram digeridos, fracionados por FR básica, então os fosfopeptídeos foram enriquecidos utilizando beads de TiO2, e analisados por LC-MS/MS. Foram identificados 5.405 grupos de proteínas, 1.679 grupos de fosfoproteínas, 3.893 grupos de sítios de fosforilação sendo 3049 em Serina, 786 em Treonina vii e, 58 em Tirosina, entre os quais cerca de 99% foram quantificados. As análises foram realizadas de duas formas: inicialmente comparando as diferentes fases de cultivo celular (exponencial e estacionária), e os diferentes pontos ao longo do estresse nutricional. Foram observadas diversas alterações no perfil de expressão das proteínas e modulação dos sítios de fosforilação, envolvidos em diversos processos como síntese de ácidos graxos, sinalização celular, locomoção, estresse oxidativo, processamento de RNA, entre outros. Projetos “ômicos”, assim como este, são importante para gerar listas com um número limitado de alvos para posterior caracterização. Nesse sentido, nós objetivamos caracterizar alguns dos elementos apontados visando elucidar o “gatilho” da metaciclogênese. / During metacyclogenesis in vitro, the epimastigote form of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, differentiates into metacyclic trypomastigote, after nutritional stress in TAU medium, and acquires capability to infect the vertebrate host. During differentiation, the parasites suffer several adaptations that include modulation of post-translational modulations. In a recent work, our group outlined, without quantifying, the protein phosphorylation profile of T. cruzi during metacyclogenesis. Here, in order to accomplish the quantification the phosphorylation sites, we applied the SILAC methodology, which labels proteins by incorporation of amino acids containing heavy isotopes, in culture. Aiming to understand the signaling that occurs through phosphorylation in the initial moments of metacyclogenesis, that is, during the nutritional stress, epimastigotes in exponential growth (Epimastigote 3 days, EPI-3D) and in the late log phase (Epimastigote 5 days, EPI-5D), as well as several points during the nutritional stress (5 and 15 minutes, 1 and 2 hours) were selected. For each experimental point, peptides were digested, fractionated by basic RP, then phosphopeptides were enriched with TiO2 beads, and analyzed by LC-MS/MS. In total, 5,405 proteins groups were identified, including 1,679 groups of phosphoproteins and 3,893 phosphorylation sites, being 3,049 in Serine, 786 in Threonine and, 58 in Tyrosine residues, among which around 99% were quantified. The analyzes were performed in two ways: first comparing the ix different stages of cell growth (exponential and stationary), and the different points along the nutritional stress. Several changes were observed in the expression profile of the proteins and modulation of the phosphorylation sites, involved in various processes such as fatty acid synthesis, cell signaling, mobility, oxidative stress, RNA processing, among others. Omics projects like this one are important to generate lists that have limited number of targets for further characterization. In this sense we aim to characterize some of the elements pinpointed to elucidate the trigger of metacyclogenesis.

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:46:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 carlos_silva_ioc_dout_2013.pdf: 4777903 bytes, checksum: cb3c3452a3e622064b7b274a124477ed (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / As vias aéreas são consideradas a principal porta de entrada para Mycobacterium leprae, o agente etiológico da hanseníase. Portanto, estudos sobre a interação do M. leprae com as células epiteliais são de grande relevância para a compreensão dos eventos iniciais que ocorrem durante a interação de M. leprae com o ser humano. Nesse contexto investigamos a interação in vitro de M. leprae com as células epiteliais alveolares (linhagem A549) e nasais humanas (linhagem RPMI2650). Nossos resultados mostram que M. leprae é capaz de aderir, entrar e também de sobreviver nas células epiteliais nasais e alveolares. Entretanto, M. leprae possui uma maior capacidade de aderir e invadir as células A549. Ademais, a habilidade de M. leprae de entrar em células epiteliais nasais foi confirmada através do isolamento e infecção de células epiteliais nasais primárias humanas advindas de pacientes com polipose nasal. Também demonstramos que o processo de entrada do bacilo nas células epiteliais é um processo passivo dependente de microfilamentos de actina e também de tubulina. Visto que a adesão é um evento crucial no estabelecimento da infecção, torna-se relevante a identificação de proteínas de superfície expostas em M. leprae Para atingir este objetivo, M. leprae isolado do coxim plantar de camundongo nude foi pré-incubado com biotina e em seguida as proteínas biotiniladas foram purificadas com microesferas magnéticas recobertas com estreptavidina e finalmente os peptídeos digeridos foram submetidos a LC/MS-MS. Com esta metodologia, identificamos 279 proteínas na superfície de M. leprae. Dentre este conjunto de proteínas, identificamos 12 potenciais adesinas previamente descritas e ainda confirmamos a presença da proteína semelhante à histona (Hlp) e da hemaglutinina ligante de heparina (HBHA) na superfície de M. leprae. Estudos com a Hlp e a HBHA recombinante de M. leprae mostraram que ambas proteínas são capazes de interagir com as células epiteliais alveolares. No entanto, apenas a Hlp foi capaz de se ligar às células epiteliais nasais. A inoculação de M. leprae no septo nasal de camundongos resultou na infecção de macrófagos e também de células epiteliais pulmonares. Além disso, M. leprae induziu a expressão de IL-8 nas células A549 e nas células epiteliais primárias humanas. Ainda, M. leprae foi capaz de induzir a produção de MCP-1 nas células A549. A bactéria também foi capaz de aumentar os níveis da subunidade p65 de NF-kB no extrato nuclear das células alveolares. Concluindo, nossos dados reforçam a importância da interação do M. leprae com o epitélio respiratório durante eventos iniciais da infecção / Abstract: The airways are considered the major port of entry of Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy. Therefore, studies on the M. leprae interaction with epithelial cells are of great relevance to shed light on earlier events in M. leprae-host interaction. We examined the in vitro interaction between M. leprae and human alveolar and nasal epithelial cells. It was observed that M. leprae can enter both cell types and that epithelial cells can sustain bacterial survival. However, M. leprae had a higher capacity to bind and invade alveolar epithelial cells. Additionally, bacterial ability to interact with nasal epithelial cells was confirmed through the isolation and infection of nasal primary epithelial cells. Moreover, M. leprae entry in epithelial cells is a passive process and actin/tubulin-dependent. Since a critical aspect for understanding the mechanisms of infection is the identification and characterization of the adhesins involved in pathogen-host cell interactions, we studied the surface proteome of nude mouse-derived M. leprae to uncover potential adhesin candidates relevant in M. lepraeepithelial cell interaction Two hundred and seventy-nine cell surface-exposed proteins were identified based on selective biotinylation, streptavidin-affinity purification and shotgun mass spectrometry. Among these proteins, the histone-like protein (Hlp) and hemaglutinin binding heparin (HBHA), two major mycobacterial adhesins, were shown to be exposed on the M. leprae surface and to mediate bacterial attachment to epithelial cells. Delivery of M. leprae to the nasal septum of mice resulted in infection of macrophages and also epithelial cells in the lung tissue. Additionally, M. leprae induces IL-8 in A549 cells but not in RPMI cells. However, human primary nasal epithelial cells secrete IL-8 during M. leprae infection. Also, alveolar epithelial cells produce monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) during M. leprae infection. Moreover, p65 NF-kB subunit levels in A549 nuclear extracts increase in response to M. leprae. Altogether, our data point to the potential of the epithelial airway mucosa as a primary site of M. leprae infection in humans

RÊGO, João Paulo Arcelino do. Proteínas do plasma seminal e das células espermáticas de touros Bos indicus das raças brahman e guzerá associadas com os parâmetros seminais. 2014. 248 f. Tese (doutorado em zootecnia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-08T19:23:44Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_jparego.pdf: 4256300 bytes, checksum: ab05da85c9d9b6cb0dae767b2a1693c2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-25T21:40:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_jparego.pdf: 4256300 bytes, checksum: ab05da85c9d9b6cb0dae767b2a1693c2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T21:40:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_jparego.pdf: 4256300 bytes, checksum: ab05da85c9d9b6cb0dae767b2a1693c2 (MD5) Previous issue date: 2014 / The aim of this work was to study seminal plasma and whole sperm proteins and their association with sperm morphology and methods of semen collection and cryopreservation in Bos indicus bulls using a proteomics approach . Seminal plasma proteins were separated by two-dimensional electrophoresis or diferential gel electrophoresis and identified by mass spectrometry gel. Firstly, we described the seminal plasma proteome of Bos indicus bulls, identified the Binder of Sperm Proteins as the more abundant proteins in seminal fluid, while the spermadhesins formed the second group with higher expression. Positive and negative associations were found between seminal plasma proteins and the percentage of morphologically normal spermatozoa constituing possible molecular markers of this characteristic. In other hand, differences were identified in ejaculate volume and seminal plasma protein profile of Bos indicus bulls subjected to different methods of semen collection (internal artificial vagina and electroejaculation). Based on the analysis of two-dimensional gels, 22 spots had larger volumes in samples collected by internal artificial vagina, corresponding to 21 proteins. In contrast, 33 spots had larger volumes of samples collected by electroejaculation corresponding to 26 differents proteins. The proteins with great volume in samples obtained by internal artificial vagina and electroejaculation had epididymal and accessory sex glands origin, respectively. In the present study, others associations have been made among protein expression in seminal plasma and sperm cells and semen parameters after cryopreservation in Bos indicus bulls. The animals had not differences between body weight, scrotal circumference and seminal parameters pre-freezing. After cryopreservation, the semen parameters were analyzed by computer system (CASA) and the animals were divided into groups of low and high freezability. In the high freezability group were more expressed three proteins of seminal plasma and five proteins of sperm. For the group of low freezability were more expressed six different seminal plasma proteins. Regression models adopted for the intensities of the spots in the seminal plasma and sperm cells, as well as analysis of protein-protein interactions, indicate that most of the proteins inversely associated with post -thaw sperm viability may be expressed as a response to an oxidative stress and/or microbial attack before the semen cryopreservation of animals with low freezability. These parameters could not be detected by conventional sperm analysis. This results obtened by applying of the proteomics approach, could serve as guideline for future researchs aimed to identifed molecular markers of reproductive processes based on the expression of proteins in seminal plasma and sperm cells of Bos indicus bulls. / O objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo sobre as proteínas do plasma seminal e dos espermatozoides e suas associações com morfologia espermática e com métodos de coleta e criopreservação de sêmen de touros Bos indicus das raças Brahman e Guzerá, utilizando uma abordagem proteômica. Foram coletadas amostras de sêmen e as proteínas do plasma seminal foram separadas através de eletroforese bidimensional ou eletroforese bidimensional em gel diferencial e identificadas por espectrometria de massa. O proteoma do plasma seminal dos touros Bos indicus foi descrito identificando as Binder of sperm proteins como as proteínas mais abundantes no fluido seminal, enquanto que as spermadhesins formaram o segundo grupo com maior expressão. Foram encontradas associações positivas e negativas entre as proteínas do plasma seminal e a porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais constituindo possíveis marcadores moleculares desta característica. Em outro aspecto, foram identificadas diferenças no volume do ejaculado e no perfil proteico do plasma seminal touros Bos indicus submetidos a diferentes métodos de coleta de sêmen (vagina artificial interna e eletroejaculação). Baseado nas análises dos géis bidimensionais, 22 spots tiveram volumes maiores nas amostras coletadas por vagina artificial interna, correspondendo a 21 proteínas. Em contrapartida, 33 spots correspondendo a 26 proteínas tiveram maiores volumes nos géis de amostras coletadas por eletroejaculação. As principais proteínas com maior expressão em amostras obtidas por vagina artificial interna e eletroejaculação eram de origem epididimária e das glândulas sexuais acessórias, respectivamente. No presente trabalho, ainda foram feitas associações entre a expressão de proteínas no plasma seminal e nas células espermáticas com os parâmetros do sêmen pós-criopreservação em touros Bos indicus da raça Guzerá. Os animais apresentaram, em média, peso corporal, circunferência escrotal e parâmetros seminias pré-criopreservação do sêmen sem diferença estatística. De acordo com os parâmetros espermáticos pós-criopreservação obtidos pelo sistema computadorizado de análise de sêmen os animais foram divididos em grupos de alta e baixa congelabilidade. Três proteínas do plasma seminal e cinco dos espermatozoides foram mais expressas no grupo de alta congelabilidade. Outras seis proteínas do plasma seminal foram mais expressas no grupo de baixa congelabilidade. Os modelos de regressão adotados para as intensidades dos spots do plasma seminal e das células espermáticas, bem como as análises de interações proteína-proteína indicam que a maioria das proteínas inversamente associadas com a viabilidade espermática pós-descongelação pode ser expressa como uma resposta a um estresse oxidativo e/ou ataque microbiano antes da criopreservação de sêmen de animais do grupo de baixa congelabilidade não detectado pelas análises convencionais do sêmen. Através da utilização de uma abordagem proteômica, os resultados encontrados no presente trabalho podem servir de orientação para futuras pesquisas que visem identificar marcadores moleculares de processos reprodutivos baseado na expressão de proteínas no plasma seminal e nas células espermáticas de touros Bos indicus.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8926_Tese - Juliana Brambilla Carnielli Trindade.pdf: 24757261 bytes, checksum: 0f32961de8457764e57a980e25aa13ad (MD5) Previous issue date: 2015-06-16 / Leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica, fatal se não tratada, causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania complexo donovani, o qual abriga a espécie L. (L.) chagasi. O tratamento da LV conta com poucas opções terapêuticas, incluindo os antimoniais pentavalentes, anfotericina B e a miltefosina. A miltefosina é a primeira droga de administração oral registrada para o tratamento da leishmaniose e tem sido utilizada com sucesso para o tratamento de LV na Índia. Contudo, diferenças na sensibilidade à miltefosina tem sido relatada em espécies de Leishmania clinicamente relevantes. Os mecanismos de resistência à miltefosina estão sendo elucidados em linhagens experimentais de Leishmania spp. resistentes a esta droga. Entretanto, os mecanismos de resistência natural à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania são pouco conhecidos e explorados. Nesse contexto, o presente estudo utilizou as abordagens proteômica e genômica com o objetivo de identificar diferenças a nível molecular entre isolados de L. (L.) chagasi obtidos de pacientes que apresentaram diferentes respostas ao tratamento com miltefosina, visando contribuir para o entendimento do mecanismo molecular envolvido na resistência natural a essa droga. A análise comparativa dos perfis proteicos obtidos por 2D-DIGE, detectou 46 spots proteicos diferencialmente expressos entre os isolados obtidos de um paciente que apresentou cura e de um paciente que apresentou falha ao tratamento com miltefosina. A análise por espectrometria de massas (MALDI/ToF-ToF) permitiu a identificação de 32 spots com identificação de uma única proteína, os quais correspondem a 22 proteínas não redundantes. A maioria das proteínas com expressão aumentada no proteoma do isolado resistente à miltefosina estão associadas com a homeostase do sistema redox, resposta ao stress, proteção à apoptose e translocação de drogas. A análise genômica, realizada com isolados de L. (L.) chagasi obtidos de pacientes que apresentaram cura clínica (n=14, grupo cura) ou falha ao tratamento (n=12, grupo recidiva) com miltefosina, identificou um elevado número de SNPs e InDels entre os isolados analisados. Entretanto, assim como a análise do número de cópias de cromossomos, esses não foram capazes de discriminar completamente os isolados obtidos de pacientes que apresentaram diferentes desfechos clínicos ao tratamento com miltefosina. A análise de variação estrutural do número de cópias de genes (dose), entre os grupos cura e recidiva, identificou diferenças significativas (p < 0,01) em 93 grupos ortólogos (OG5). Dentre esses, foi avaliado o envolvimento da deleção dos genes in tandem LinJ.31.2370, LinJ.31.2380, LinJ.31.2390 e LinJ.31.2400 no fenótipo de resistência de L. (L.) chagasi à miltefosina. Foi demonstrado que o processo de deleção do locus contendo esses genes in tandem ocorre por recombinação homóloga e, aparentemente não é induzido por pressão da droga miltefosina. A reexpressão individual desses genes em um isolado do grupo recidiva que não os continham, revelou que nenhum desses genes interfere no fenótipo de susceptibilidade in vitro da forma promastigota à miltefosina. Além disso, a análise de clones separados de isolados de L. (L.) chagasi (heterogêneo em relação à presença desses genes), mostrou que as formas promastigotas de clones que possuem esses genes são menos susceptíveis à miltefosina do que clones que não os possuem. Esses dados, assim como os da análise proteômica, sugerem que o mecanismo de resistência natural à miltefosina nos parasitas Leishmania spp. é complexo e multifatorial.

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: Maurício Bacci Junior / Resumo: O protozoário hemoflagelado, Trypanosoma cruzi, transmitido principalmente pelo inseto triatomíneo, por infecção congênita ou por transfusão sanguínea, causa a tripanossomíase americana ou doença de Chagas, como é mais conhecida. Essa é uma séria doença parasitária que ocorre na América Latina, com considerável impacto social e econômico. Dois fármacos, nifurtimox e benzonidazol, são indicados no tratamento de pessoas infectadas, mas são pouco eficientes na fase aguda e praticamente ineficientes na fase crônica da doença. Devido a esses fatores, é de extrema importância que se encontre agentes quimioterápicos e/ou quimiopreventivos mais eficientes e eficazes. O presente trabalhou objetivou avaliar a influência no proteoma de T. cruzi de três substâncias extraídas de plantas da família Piperaceae, peperobtusina A e B de Peperomia obtusifolia e piplartina de Piper tuberculatum, através da eletroforese bidimensional (2D) - DIGE (Difference Gel Electrophoresis - GE Healthcare) associada à espectrometria de massas. O tratamento realizado com peperobtusina A de Peperomia obtusifolia em cepa Y de T. cruzi identificou proteínas de interesse, como proteína do bastão paraflagelar e triparedoxina peroxidase, importantes na composição flagelar e proteção natural do parasito ao estresse oxidativo, respectivamente. Os resultados obtidos com peperobtusina B de Peperomia obtusifolia na mesma cepa de T. cruzi mostraram proteínas que podem servir como interessantes alvos potenciais para futuro desenvolvimento de fármacos. São elas: calmodulina, tirosina aminotransferase e arginina quinase. Os resultados obtidos com o tratamento das cepas Y e Bol de T. cruzi pela piplartina de Piper tuberculatum demonstraram que apesar das diferenças de suscetibilidade dessas cepas em relação ao benzonidazol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The protozoa hemoflagelate, Trypanosoma cruzi, transmitted mainly for the triatomíneo insect, congenital infection or sanguineous transfusion, cause American tripanosomiasis or Chagas disease, as more it is known. This is a serious parasitic illness that occurs in Latin America, with considerable social and economic impact. Two drugs, nifurtimox and benznidazol, are indicated in the treatment of infected people, but they are little efficient in the acute phase and practically inefficient in the chronic phase of the illness. Because of these factors, it is of extreme importance find efficient chemopreventive and/or chemotherapic agents. This work aims to evaluate the T. cruzi proteome influence of three substances extracted of plants belonging to Piperaceae family, being peperobtusine A and B of Peperomia obtusifolia and piplartine of Piper tuberculatum, through two dimensional electrophoresis (2D) - DIGE (Difference Gel Electrophoresis - GE Healthcare) and mass spectrometry. The treatment carried with peperobtusine A of P. obtusifolia in Y strain of T. cruzi identified interest proteins, as paraflagelar rod protein and triparedoxin peroxidase, important in the flagella composition and natural protection of oxidative stress, respectively. The results using peperobtusine B of the P. obtusifolia in Y strain of T. cruzi showed proteins that can be interesting potential targets for future development of drug. They are: calmodulin, tyrosine aminotransferase and arginine kinase. The results with the treatment of Y and Bol strains of T. cruzi with piplartine of P. tuberculatum demonstrated that although to the differences of susceptibility of these strains related to benznidazol, the piplartine was active for both strains as a similar way and modified the expression of enzymes involved in the protection of the parasitic to the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-08T13:19:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4149329 bytes, checksum: c3cfb7e4f8632c910c1c375a4e9a0f54 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T13:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4149329 bytes, checksum: c3cfb7e4f8632c910c1c375a4e9a0f54 (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho consiste de quatro manuscritos desenvolvidos usando os mesmos animais. O objetivo do primeiro estudo foi avaliar o efeito de castração sobre as características de carcaça e qualidade da carne de Nelore abatidos em diferentes pesos corporais (PC). Trinta e seis bezerros Nelore (Bos taurus indicus) com média inicial de 256,1 ± 3,05 kg de PC e 8,2 ± 0,07 meses de idade foram utilizados, sendo que a metade foi aleatoriamente selecionada para a castração cirúrgica uma semana antes do desmame. Os bezerros desmamados foram confinados recebendo uma mesma dieta, e seis bezerros de cada condição sexual foram distribuídos aleatoriamente para serem abatidos quando a média do PC atingisse 280, 380 e 480 kg. Portanto, este estudo foi realizado seguindo delineamento inteiramente casualizado com tratamentos arranchados em esquema fatorial com 2 condições sexuais (castrado vs. inteiro) e 3 pesos de abate (280, 380, e 480 kg). As características de qualidade da carne foram avaliadas aos 1, 7 e 14 dias postmortem. O efeito de interação foi encontrado (P <0,01) para a gordura intramuscular e para a gordura renal, pélvica e cardíaca. A carcaça de boi inteiro foi mais pesada (P <0,05) do que de castrados. A carcaça do boi inteiro teve maior (P <0,05) espessura de cobertura. Castração reduziu a força de cisalhamento e aumentou o índice de fragmentação miofibrilar aos 14 dias postmortem. As carcaças do abate aos 480 kg apresentaram um resfriamento mais lento, um sarcômero mais longo e uma menor força de cisalhamento quando avaliada a 1 dia postmortem. A redução na força de cisalhamento de 1 para 14 dias post-mortem foi reduzida (P <0,05) à medida que se aumentou o peso corporal ao abate. Conclui-se que, excetuando a gordura da carcaça, a castração e o peso corporal na colheita afetam as características de carcaça e carne independentemente. O segundo estudo teve como objetivo avaliar a sensibilidade à glicose de bovinos Nelore castrados e inteiros ao longo do desenvolvimento corporal. Além disso, foram avaliadas a expressão gênica de biomarcadores relacionados ao metabolismo da glicose, crescimento muscular e tal, enquanto o pesodeposição de lipídios. Para tanto, os mesmos animais do primeiro estudo foram utilizados, e este estudo foi realizado seguindo delineamento inteiramente casualizado com tratamentos arranchados em esquema fatorial com 2 condições sexuais (castrado vs. inteiro) e 3 pesos de abate (280, 380, e 480 kg). Dois testes de tolerância à glicose (TTG) foram realizados aos 380 e 480 kg de PC. Longissimus dorsi (LD) foi amostrado logo após a sangria para a expressão gênica. A composição da carcaça e o desempenho animal foram avaliados. Animais não castrados tiveram maior PC final (P = 0,02) e tendência para aumentar a eficiência alimentar (P = 0,08) em relação aos castrados. Os bovinos inteiros tiveram maior rendimento de carne magra (P = 0,02) e proteína (P = 0,01) do que os castrados. Efeito de interação foi encontrado para o ganho de gordura de carcaça (P = 0,01), e os castrados ganharam mais gordura de carcaça do que os inteiros apenas de 380 a 480 kg de PC. A taxa fracional de acumulação de proteína da carcaça (FAR) diminuiu à medida que os bovinos aumentaram o PC (P <0,01). Nem o nível basal da glicose nem a área sob a curva (AUC) pós-infusão foram afetados pela castração ou PC dos bovinos (P > 0,05). A expressão de genes relacionados ao metabolismo da glicose no LD não foi afetada pela castração ou PC dos bovinos (P> 0,05). Foi observada uma tendência de aumento na expressão de LD de acetil-CoA carboxilase alfa (ACACA) pela castração (P = 0,086). Efeitos de interação (P <0,05) foram encontrados para a expressão do receptor de IGF-1 (IGF1R) e da proteína F-box 32 (FBXO32) no LD, e para ambos os genes, os novilhos apresentaram a maior abundância de mRNA aos 380 kg de PC, enquanto os inteiros tiveram a maior abundância aos 480 kg de PC. A expressão de serpin A3-6 no LD tendeu (P = 0,08) a reduzir com aumento do PC de 280 para 480 kg. Em conclusão, apesar do aumento na gordura da carcaça pela castração e aumento do PC, a sensibilidade corporal de bovinos Nelore à glicose não muda. Para o terceiro estudo, as amostras de LD coletadas no momento do abate foram utilizadas para comparar o proteoma e o fosfoproteoma de bovinos Nelore castrados ou não durante os diferentes estádios de crescimento. A proteína muscular extraída foi separada em 2D-PAGE e corada sequencialmente com Pro-Q Diamond e Coomassie coloidal. Posteriormente, realizou-se uma análise comparativa do perfil protéico, e os spots diferencialmente abundantes foram excisados para identificação de proteínas por MALDI-TOF/TOF. A castração afetou (P <0,05) a abundância de 6 fosfoproteínas e 10 spots de proteína total, enquanto o peso corporal afetou (P <0,05) abundância de 34 fosfoproteínas e 29 spots de proteína total. A castração diminuiu (P <0,05) a abundância de duas enzimas glicolíticas da fase de produção de energia, sugerindo que o aumentou na via da glicólise promove síntese de glicerol-3P para dar suporte a uma maior deposição de gordura em novilhos. Em relação ao estágio de crescimento, além das proteínas estruturais da cadeia leve reguladora de miosina 2 (MYLPF) e da actina alfa 1 (ACTA1), a maioria das proteínas identificadas estão relacionada ao metabolismo energético, incluindo o metabolismo do glicogênio, glicólise, fosforilação oxidativa, metabolismo da creatina-fosfato, e metabolismo citosólico de NADH. Esses resultados sugerem que a diminuição da taxa de crescimento muscular reduz a glicólise e a geração de ATP no músculo. No quarto estudo utilizou-se apenas os doze bovinos Nelore abatidos aos 480 kg de PC. O objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças no proteoma e fosfoproteoma entre bovinos Nelore castrados e inteiros durante a conversão do músculo em carne, bem como após 14 dias de maturação. Foram utilizados 12 bezerros machos Nelore (247 kg e 8 meses) e seis bezerros foram selecionados aleatoriamente para a castração cirúrgica uma semana antes do desmame. Os bezerros desmamados foram alimentados com a mesma dieta e foram abatidos após 230 dias de confinamento. O músculo Longissimus foi amostrado logo após a sangria (0d pós- morte), na desossa (1d pós-morte) e após a maturação (14d pós-morte) para análise de proteoma. As características de carcaça foram avaliadas na desossa e a força de cisalhamento da carne foi medida ao 1, 7 e 14 dias postmortem. O extrato de proteína muscular foi separado por 2D-PAGE e corado sequencialmente para fosfoproteína (Pro- Q Diamond) e para proteína total (Coomassie coloidal). Os spots diferencialmente abundantes entre a condição sexual ou entre os tempo pós-morte foram excisados para identificação de proteínas por MALDI-TOF/TOF. A castração aumentou (P <0,05) a abundância de enzimas glicolíticas, enquanto que a proteína da fosforilação oxidativa ATP5B foi reduzida (P <0,05). Além disso, a abundância de troposina T isoforma rápida (TNNT3) foi aumentada pela castração (P <0,05), enquanto a isoforma lenta (TNNT1) tendeu a diminuir (P <0,10). A creatina quinase tipo-M foi marcadamente fragmentada no postmortem. A abundância de PGM1 fosforilada aumentou durante as primeiras 24 horas pós-morte e foi altamente correlacionada com o pH da carcaça. A abundância de uma proteína de choque termico 71 kDa (HSC70) aumentou marcadamente após a maturação. Além disso, a abundância das proteínas miofibrilares fosforiladas ACTA1 e MYLPF foram positivamente correlacionadas com o encurtamento do sarcômero. Em conclusão, nossos dados demonstraram que a abundância e a fosforilação das enzimas glicolíticas afetam a qualidade da carne durante a conversão do músculo em carne. No geral, a castração aumentou acentuadamente a gordura da carcaça e a gordura intramuscular, enquanto que a sensibilidade corporal à glicose e a conversão do músculo na carne parecem ser semelhantes entre bovinos castrados e não castrados. / The current work consists of four manuscripts developed using the same animals.The objective of the first study aimed to evaluate the castration effect on carcass and meat traits of Nellore cattle harvested at different body weights (BW). Thirty-six Nellore (Bos taurus indicus) calves averaging 256.1 ± 3.05 kg of BW and 8.2 ± 0.07 months old were used, within then half was randomly selected for surgical castration one-week prior weaning. Weaned calves were fed with the same diet, and then six calves from each sex condition were randomly assigned to be harvested when the average BW of both sex conditions reaches 280, 380, and 480 kg. Therefore, this study was carried out as a complete randomized design following a 2 (sex condition) by 3 (weight at harvest) factorial arrangement of treatments. Beef traits were evaluated at 1, 7, and 14 d postmortem. Interaction effect was found (P < 0.01) for intramuscular fat and for kidney, pelvic and heart fat. Bull carcass was heavier (P < 0.05) than steer. Steer carcass had greater (P < 0.05) backfat thickness. Castration reduced shear force and increased myofibrillar fragmentation index at 14 d postmortem. Carcasses from cattle harvested at 480 kg had slower chilling, longer sarcomere, and lower shear force at 1 d postmortem. Shear force change from 1 d to 14 d postmortem reduced (P < 0.05) as harvest body weight increased. In conclusion, despite of carcass fatness, castration and body weight at harvest affect carcass and meat traits independently. The second study aimed to evaluate the glucose sensitivity of bulls and steers throughout body development. In addition, it was evaluated gene expression of biomarkers related to glucose metabolism, muscle growth and lipid deposition. Therefore, the same animals from the first study were used, and this study was carried out as a complete randomized design following a 2 (sex condition) by 3 (weight at harvest) factorial arrangement of treatments. Two glucose tolerance tests (GTT) were performed at 380 and 480 kg. Longissimus dorsi (LD) was sampled just after stunning for gene expression. Carcass composition and animal performance were evaluated. Bulls had greater final BW (P = 0.02) and tended to increase G:F ratio (P = 0.08) compared with steers. Bulls had greater carcass yield of lean (P = 0.02) and protein (P = 0.01) than steers. An interaction effect was found for carcass fat gain (P = 0.01), and steers gained more carcass fat than bulls only from 380 to 480 kg of BW. Carcass protein fractional accretion rate (FAR) decreased as cattle BW increased (P < 0.01). Neither glucose basal level nor area under the curve (AUC) post-infusion were affected by castration or cattle BW (P > 0.05). Expression of genes related to glucose metabolism in the LD were not affected by castration or cattle BW (P > 0.05). Castration tended (P = 0.086) to upregulate LD expression of Acetyl-CoA carboxylase alpha (ACACA). Interaction effects (P < 0.05) were found for LD expression of IGF-1 receptor (IGF1R) and F-box protein 32 (FBXO32), and for both genes steers had the greatest mRNA abundance at 380 kg while bulls had the greatest abundance at 480 kg of BW. The LD expression of serpin A3-6 tended (P = 0.08) to be downregulated as cattle BW increased from 280 to 480 kg. In conclusion, despite of the carcass fatness enhancement by castration and increasing BW, Nellore cattle whole-body sensitivity to glucose does not change. For the third study, the LD sampled at the harvest were used to compare the proteome and phosphoproteome of Nellore bulls and steers during different growth stages. Extracted muscle protein was separated in a 2D-PAGE and stained sequentially with Pro- Q Diamond and Colloidal Coomassie. Afterward, a comparative analysis of protein profile was performed, and differentially abundant protein spots were excised for protein identification by MALDI-TOF/TOF. Castration affected (P < 0.05) abundance of 6 phosphoproteins and 10 protein spots, while body weight affected (P < 0.05) abundance of 34 phosphoproteins and 29 protein spots. Castration decreased (P < 0.05) the abundance of two glycolytic enzymes of the energy-yielding phase, suggesting that glycolysis pathway enhanced glycerol-3P supply for a greater fat deposition on steers. Regarding the growth stage, despite the structural proteins myosin regulatory light chain 2 (MYLPF), and actin alpha 1 (ACTA1), most of identified proteins were related to energy metabolism, including glycogen metabolism, glycolysis, oxidative phosphorylation, creatine- phosphate metabolism, and cytosolic NADH metabolism. These results suggest that decreasing muscle growth rate decreases muscle glycolysis and ATP generation. The fourth study used only the twelve Nellore cattle harvested at 480 kg of BW. The aim of this study was to evaluate the differential proteome and phosphoproteome between bulls and steers during conversion of muscle to meat, as well as after 14 d of aging. Twelve male Nellore calves were used (247 kg, and 8 months old) and six calves were randomly selected for surgical castration one week before weaning. Post-weaning calves were fed the same diet and were harvested after 230 d on feeding. Longissimus muscle was sampled just after stunning (0d postmortem), at deboning (1d postmortem) and after aging (14d postmortem) for proteome analysis. The carcass traits were evaluated at deboning and meat shear force was measured at 1, 7, and 14 d postmortem. Muscle protein extract was separated by 2D-PAGE and stained sequentially for phosphoprotein (Pro-Q Diamond) and for total protein (Colloidal Coomassie). Differentially abundant protein spots between sex condition or across postmortem time were excised for protein identification by MALDI- TOF/TOF. Castration upregulated (P < 0.05) the abundance of glycolytic enzymes, while the oxidative phosphorylation protein ATP5B was downregulated (P < 0.05). In addition, abundance of troponin T fast isoform (TNNT3) was upregulated by castration (P < 0.05), while the slow isoform (TNNT1) tended to decrease (P < 0.10) abundance. The creatine kinase M-type was markedly fragmented postmortem. Abundance of phosphorylated PGM1 increased during the first 24 h postmortem and was highly correlated with carcass pH. The abundance of one spot of heat shock cognate 71 kDa protein (HSC70) markedly increased after aging. Further, abundance of the phosphorylated myofibrillar proteins ACTA1 and MYLPF were positively correlated with sarcomere shortening. In conclusion, our finds demonstrated that abundance and phosphorylation of glycolytic enzymes affect meat quality during conversion of muscle to meat. Overall, castration markedly increased carcass fatness and intramuscular fat, whereas whole body glucose sensitivity and conversion of muscle to meat seems to be similar between bulls and steers.

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Este trabalho teve como objetivo principal realizar um estudo proteômico diferencial aplicado à amostra Bradyrizobium elkanii (SEMIA 587). Isso se fez através da identificação de proteínas diferencialmente expressas nesta importante bactéria fixadora de nitrogênio quando cultivada em laboratório (in vitro) e quando inoculada em plantas de soja (in vivo). A caracterização das proteínas foi feita com a poderosa técnica de espectrometria de massas, e a análise proteômica com expressão diferencial foi comparada por meio de duas estratégias diferentes: MudPIT e Maldi-QToF. A avaliação das imagens dos géis bidimensionais permitiu verificar que a amostra de bactéria apresentou um número maior de proteínas expressas em relação ao bacterióide. Se comparada ao microrganismo na condição in vitro (bactéria), a espécie fixadora de nitrogênio (bacterióide) apresentou 19 proteínas induzidas e 230 reprimidas. O aumento de expressão observado para as proteínas do bacterióide foi pelo menos duas vezes maior do que o volume normalizado para 17 proteínas e, caiu pela metade (ou mais), para outras 26 proteinas em relação a bactéria. Através de ambas as técnicas (Maldi-QToF e ESI-QToF) empregadas na identificação das proteínas observou-se, comprovando a complementariedade existente entre as metodologias, que os padrões metabólicos tanto em bactéria como bacterióide foram mantidos. Ou seja, bactérias cultivadas em meio YML apresentaram um metabolismo voltado para a síntese celular, denotada pela produção de macromoléculas e metabolismo energético, ao passo que bacterióides, endosimbiontes isolados de nódulos de plantas de soja, apresentaram um metabolismo especialmente dedicado à fixação simbiótica do nitrogênio. / The main goal of this project was to perform a differential proteomic analysis of Bradyrizobium elkanii (SEMIA 587). It was made by the identification of differentially expressed proteins in this important nitrogen fixing bacteria grown under different conditions: in laboratory culture (in vitro) and symbiotically associated with soybean plants (in vivo). The characterization of proteins differentially expressed was done by the powerful technique of mass spectrometry, applying two different strategies: MudPIT and Maldi-QToF. It was possible, after computerized image analysis of 2D gels, to verify that bacteria had more expressed proteins than bacteroids. In vivo bacteria showed 19 proteins induced and 230 suppressed. The increase in expression observed for bacteroids macromolecules was at least two times greater than normalized volume for 17 proteins of the bacteria and two times smaller than 26 bacteria proteins. It was also observed, through Maldi-QToF and ESI-QToF techniques applied to protein identification, that bacteria and bacteroid main metabolic activities were maintained. This fact confirms that the techniques were complementary. The data showed that bacteria cultivated in YML medium had a metabolism direct to cellular synthesis, characterized by production of macromolecules and energetic metabolism. Endosimbiont bacteroids isolated from soyabean nodules showed a metabolism specially dedicated to nitrogen fixation. The results were in agreement with the ambient that each microorganism was originated. The fact that the identified proteins in bacteria were related to translation and aminoacids biosynthesis shows the need that heterotrophic microorganisms have to synthesize its own proteins and enzymes useful for their metabolism. On other hand, since the bacteroids are symbiotically associated with soybean reducing atmospheric nitrogen in an extremely energy-intense process, it is expected that its proteins should be mainly related to biological nitrogen fixation and energetic metabolism.

A expressão aumentada de GSK3b em pacientes da doença de Alzheimer (DA), aparentemente está relacionada com a formação de placas senis e emaranhados neurofibrilares. Utilizamos qPCR para avaliar os efeitos do lítio sobre os níveis do mRNA de GSK3a e GSK3b em culturas primárias de neurônios corticais e hipocampais de rato tratados com lítio. Nossos resultados, sugeriram que lítio é capaz de reduzir os níveis de mRNA de Gsk3b hipocampal de modo específico e dose-dependente. Estes dados foram subsequentemente comprovados in vivo em amostras cerebrais de ratos tratados com LiCl. Utilizamos hibridização subtrativa de cDNA e eletroforese bidimensional de culturas de neurônios hipocampais tratados com o lítio. Nossos estudos sugeriram a expressão diferencial de 88 genes, além de oito proteínas com cerca de 50% de alteração de expressão. Estas observações sugerem novos efeitos regulatórios do lítio sobre GSK3b e fornecem potenciais alvos da ação do lítio. / The increased systemic expression of active GSK3b in Alzheimers disease (AD) patients apparently is associated with the formation of senile plaques and neurofibrillary tangles, the hallmarks of this disease. In this study we used qPCR to evaluate the transcriptional regulation of GSK3a and GSK3b in lithium-treated primary cultures of rat cortical and hippocampal neurons. We found a significant and dose-dependent reduction in the mRNA levels of GSK3b, which was specific to hippocampus. This same effect was further confirmed in vivo by measuring GSK3 expression in different brain regions of adult rats treated with lithium. We used subtractive hybridizations and two-dimensional electrophoresis patterns of culture of hippocampus neurons treated with lithium. Our study suggested 88 genes differently expressed besides 8 proteins identified with variation expression. These observations suggest new regulatory effects of lithium over GSK3b and suggesting new potential lithium action targets.