Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Banca: Maurício Bacci Junior / Resumo: O protozoário hemoflagelado, Trypanosoma cruzi, transmitido principalmente pelo inseto triatomíneo, por infecção congênita ou por transfusão sanguínea, causa a tripanossomíase americana ou doença de Chagas, como é mais conhecida. Essa é uma séria doença parasitária que ocorre na América Latina, com considerável impacto social e econômico. Dois fármacos, nifurtimox e benzonidazol, são indicados no tratamento de pessoas infectadas, mas são pouco eficientes na fase aguda e praticamente ineficientes na fase crônica da doença. Devido a esses fatores, é de extrema importância que se encontre agentes quimioterápicos e/ou quimiopreventivos mais eficientes e eficazes. O presente trabalhou objetivou avaliar a influência no proteoma de T. cruzi de três substâncias extraídas de plantas da família Piperaceae, peperobtusina A e B de Peperomia obtusifolia e piplartina de Piper tuberculatum, através da eletroforese bidimensional (2D) - DIGE (Difference Gel Electrophoresis - GE Healthcare) associada à espectrometria de massas. O tratamento realizado com peperobtusina A de Peperomia obtusifolia em cepa Y de T. cruzi identificou proteínas de interesse, como proteína do bastão paraflagelar e triparedoxina peroxidase, importantes na composição flagelar e proteção natural do parasito ao estresse oxidativo, respectivamente. Os resultados obtidos com peperobtusina B de Peperomia obtusifolia na mesma cepa de T. cruzi mostraram proteínas que podem servir como interessantes alvos potenciais para futuro desenvolvimento de fármacos. São elas: calmodulina, tirosina aminotransferase e arginina quinase. Os resultados obtidos com o tratamento das cepas Y e Bol de T. cruzi pela piplartina de Piper tuberculatum demonstraram que apesar das diferenças de suscetibilidade dessas cepas em relação ao benzonidazol... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The protozoa hemoflagelate, Trypanosoma cruzi, transmitted mainly for the triatomíneo insect, congenital infection or sanguineous transfusion, cause American tripanosomiasis or Chagas disease, as more it is known. This is a serious parasitic illness that occurs in Latin America, with considerable social and economic impact. Two drugs, nifurtimox and benznidazol, are indicated in the treatment of infected people, but they are little efficient in the acute phase and practically inefficient in the chronic phase of the illness. Because of these factors, it is of extreme importance find efficient chemopreventive and/or chemotherapic agents. This work aims to evaluate the T. cruzi proteome influence of three substances extracted of plants belonging to Piperaceae family, being peperobtusine A and B of Peperomia obtusifolia and piplartine of Piper tuberculatum, through two dimensional electrophoresis (2D) - DIGE (Difference Gel Electrophoresis - GE Healthcare) and mass spectrometry. The treatment carried with peperobtusine A of P. obtusifolia in Y strain of T. cruzi identified interest proteins, as paraflagelar rod protein and triparedoxin peroxidase, important in the flagella composition and natural protection of oxidative stress, respectively. The results using peperobtusine B of the P. obtusifolia in Y strain of T. cruzi showed proteins that can be interesting potential targets for future development of drug. They are: calmodulin, tyrosine aminotransferase and arginine kinase. The results with the treatment of Y and Bol strains of T. cruzi with piplartine of P. tuberculatum demonstrated that although to the differences of susceptibility of these strains related to benznidazol, the piplartine was active for both strains as a similar way and modified the expression of enzymes involved in the protection of the parasitic to the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: A bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, responsável por perdas significativas na citricultura nacional e mundial. Com a finalidade de se obter um primeiro mapa proteômico de referência da Xac, as bactérias foram cultivadas em dois meios não indutores de virulência (meios CN e TS8), e as proteínas foram digeridas com tripsina e analisadas pela tecnologia de MudPIT (Tecnologia de Identificação Multidimensional de Proteínas). Trinta e nove por cento de todas as proteínas preditas pelo genoma da Xac foram identificadas através de seus peptídeos, e estão distribuídas em todas as categorias funcionais. Além disso, 25% das proteínas designadas como hipotéticas conservadas do genoma foram identificadas. Outro objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão protéico durante a patogênese decorrente do contato Xac::citros. Para isso, Xac em condição infectante foi cultivada em meio indutor de virulência XAM1 por 24 h, ou recuperadas de folhas de laranjeiras inoculadas após 3 ou 5 dias de infecção, tendo como referência a Xac cultivada em meio CN. A tecnologia 20 + MS detectou 228 proteínas diferencialmente expressas em condição infectante, e a tecnologia MudPIT identificou 1.679 proteínas de Xac. Um total de 57 proteínas diferenciais [17 (20 + MS) + 40 (MudPIT)] associadas à patogenicidade e virulência, na interação Xac::citros são discutidas neste trabalho, destacando-se proteínas do Sistema de Secreção Tipo 111 (SSTT), 11 (SSTO) e IV (SSTO), efetoras do SSTT, proteínas relacionadas a estresse, goma xantana, carência nutricional, entre outras. / Abstract: The phytopathogenic bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker disease, which responds for important losses in national and worldwide citriculture. In arder to obtain the first proteomic reference map of Xac, the bacterium was grown on two non-inductive media for bacterial virulence (CN and TSB media) and proteins were proteolysed with trypsin and analyzed by MudPIT technology (Multidimensional Protein Identification Technology). Thirty nine per cent of ali predicted proteins from Xac genome were identified with their component peptides as belonging to ali functional categories. Besides, 25% of proteins described as conserved hypothetical in Xac's genome were identified. Another aim of this study was to analyze the proteome profile during Xac::citrus pathogenesis. For this reason, infecting Xac was grown in XAM1 virulence inductive medium for 24 h, or recovered from infected citrus leaves at 3 or 5 days of infection, taking Xac grown on CN medium as reference. The 20 + MS technology has detected 228 differentially expressed proteins in infecting conditional, and MudPIT technology identified 1679 Xac proteins. A total of 57 differential proteins [17 (20 + MS) + 40 (MudPIT)] related to pathogenicity and virulence during Xac::citrus interaction are discussed in this study, emphasizing proteins of type 111 (SSTT), 11 (SSTO) and IV (SSTQ) secretion system, effectors of SSTT, proteins related to stress, xanthan gum, starvation, among others. / Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Haroldo Alves Pereira Júnior / Banca: Márcia Regina Soares da Silva / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: João Martins Pizauro Júnior / Doutor

Resumo: O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Abstract: Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system's secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system's proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system's pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris / Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo / Banca: Leandro Márcio Moreira / Mestre