Orientador: Henrique Ferreira / Coorientador:Danielle Biscaro Pedrolli / Banca: Karen Cristiane Martinez de Moraes / Banca: Paula Maria Moreira Martins / Resumo: Estudos genéticos em qualquer organismo requerem ferramentas eficazes para se alterar a expressão gênica. Dentre estas, os riboswitches oferecem uma alternativa bastante atrativa para modulação da expressão de genes de interesse, onde é possível ligar e desligar tais genes sem a remoção dos mesmos dos genomas. Esta alternativa permite o estudo direto de um gene e a avaliação da sua falta (quando desligado ou "OFF"), bem como permite o reestabelecimento do selvagem sem a necessidade da complementação padrão (estado "ON"). Na busca por melhores condições de caracterização genética e do desenvolvimento de ferramentas dedicadas para estudos de genes essenciais ou de difícil caracterização em Xanthomonas citri, avaliamos o uso de um sistema de riboswitch theo/metE para o controle de expressão gênica nesta bactéria. A caracterização propriamente dita foi realizada alterando-se a expressão dos genes parB e α- amilase. O sucesso destas estratégias permitiu o silenciamento dos genes parB e e α-amilase, e ainda, foi possível observar que a inibição da transcrição do gene α-amilase refletiu em um decaimento da enzima α-amilase estando o riboswitch theo/metE na presença de seu metabólito alvo, a teofilina. Os resultados indicam que o riboswitch theo/metE utilizado neste estudo é uma ferramenta genética em potencial para silenciamento gênico em Xac / Abstract: Genetic studies in any organism requires effective tools to change gene expression. Among these, the riboswitches offer a very attractive alternative to modulation of the expression of genes of interest, where it is possible to turn on and turn off such genes without removing them from the genomes. This alternative allows the direct study of a gene and the evaluation of its lack (when disconnected or "off"), as well as it allows the reestablishment without the necessity of the standard complementation (state "ON"). In the search for better conditions of genetic characterization and the development of tools dedicated to studies of essential genes or of difficult characterization in Xanthomonas citri, we evaluate the use of a system of riboswitch theo/metE for the control of gene expression in this bacteria. The characterization itself was performed by altering the expression of the parB and α-amylase genes. The success of these strategies allowed the silencing of parB and α-amylase genes, and it was also possible to observe that the inhibition of the transcription of the α-amylase gene reflected in a decay of the α-amylase enzyme while the riboswitch theo/metE in the presence of his target metabolite, theophylline. The results indicate that the riboswitch theo/metE used in this study is a potential genetic tool for gene silencing in XAC / Mestre

Orientador: Alessandro de Mello Varani / Coorientador: Marcos Túlio Oliveira / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Henrique Ferreira / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é um fitopatógeno responsável por causar o Cancro Cítrico, relacionado a grandes perdas econômicas para a citricultura. Esta bactéria utiliza diversos mecanismos moleculares para infectar o hospedeiro, dentre eles, o Sistema de Secreção Tipo III (T3SS), considerado o principal fator de virulência expresso in planta pela Xac. Sabe-se que a ativação do T3SS é controlada por dois reguladores: HrpG e HrpX. Porém, os mecanismos que controlam estes reguladores e posteriormente a expressão do T3SS in planta ainda são pouco compreendidos. Estudos realizados por nosso grupo de pesquisa sugerem que a concentração de fosfato inorgânico (Pi) presente em meio de cultura ou em espaço apoplástico, onde a Xac causa a infecção em plantas, pode estar relacionado com a ativação do T3SS, sugerindo uma possível relação entre o Pi com os reguladores HrpG e HrpX. Em Xac, a detecção e transportorte do Pi é realizada pelo sistema de dois componentes (TCS) PhoR/PhoB, codificado pelo operon pho. Afim de averiguar a possível relação entre PhoR/PhoB com os reguladores do T3SS HrpG e HrpX, ensaios de modelagem molecular foram realizados, indicando que a proteína PhoR poderia interagir fisicamente com HrpG, fosforilando-a, e sugerindo um possível mecanismo de interação entre o TCS PhoR/PhoB e os genes reguladores do T3SS. Para testar a hipótese de interação física entre HrpG e PhoR, as proteínas recombinantes PhoR, PhoB e HrpG de Xac foram expressas em células de Escher... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a plant pathogen that causes citrus canker, responsible for significant economic losses in citriculture. This bacteria uses several molecular mechanisms to infect the host, such as the Type III Secretion System (T3SS), which is considered the main factor of virulence expressed in plant by Xac. Activation of T3SS is controlled by two regulators, HrpG and HrpX, however, the mechanisms that control these regulators and subsequently the expression of T3SS in planta are poorly understood. Previosuly, our research group identified that the concentration of inorganic phosphate (Pi) present in culture media or in the apoplastic space, where Xac causes infection in plants, may be related to the activation of T3SS, suggesting a possible relationship between Pi and the HrpG and HrpX regulators. In Xac, the detection and transport of Pi is performed by the two-component system (TCS) PhoR/PhoB, encoded by the operon pho. In order to investigate the possible relationship between PhoR/PhoB and the regulators of T3SS HrpG and HrpX, molecular modeling analyses were performed and indicated that the PhoR protein could physically interact with HrpG and phosphorylate it, suggesting a possible mechanism of interaction between TCS PhoR / PhoB and the T3SS regulatory genes with subsequent activation of T3SS. To test the hypothesis, recombinant forms of PhoR, PhoB and HrpG were expressed in Escherichia coli BL21 cells for the purpose of performing pull-down ass... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Henrique Ferreira / Resumo: O cancro cítrico é uma doença que afeta todas as variedades economicamente importantes de citros cultivadas ao redor do mundo. Atualmente representa uma ameaça aos maiores produtores mundiais de laranjas doce e de suco concentrado: o estado de São Paulo, Brasil, e estado da Flórida, EUA. O agente etiológico mais importante do cancro é a bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) patotipo A, cujo genoma tem sido estudado e impulsionado descobertas e avanços na compreensão da doença e de seu agente causador. Contudo, mecanismos celulares essenciais são ainda pouco explorados neste micro-organismo. Desta forma, a compreensão de tais mecanismos e de seus efetores pode ser explorado no desenvolvimento de antimicrobianos e de novas estratégias para o combate ao cancro cítrico. Nosso grupo mostrou recentemente que ésteres de ácido gálico são potentes inibidores da divisão cromossômica e celular em X. citri. No presente trabalho, demos continuidade aos estudos com o objetivo de caracterizar processos essenciais à infecção ocasionada por X. citri, como a motilidade. As análises de bioinformática revelaram que a ORF XAC1934 estaria relacionada com motilidade em X. citri, uma vez que há uma grande identidade desta ORF com fleN, um gene regulador da formação flagelar em outros micro-organismos. Os resultados de motilidade e potencial infectivo in planta do mutante deletado desta ORF corroboraram a literatura, apresentando padrões semelhantes a estudos com mutantes d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Citrus canker is a disease that affects all economically important varieties of citrus cultivars worldwide. Currently, it represents a threat to the world’s biggest sweet orange juice producers: São Paulo state, Brazil, and Florida, USA. The canker etiologic agent is the Gram-negative bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Its genome knowledge has driven to discoveries and advances in the study of the causal agent of this disease. However, this microorganism’s essential microbiological processes are still underexplored. Therefore, the understanding of these mechanisms and its effectors can be useful in antibiotics development in order to prevent citrus canker infections. Our group have shown recently that esters of galic acid are potent inhibitors of cell division in X. citri. In this work, we continue to study essential processes for citrus canker infection such as motility. Bioinformatics analyses reveled that ORF XAC1934 is related to motility in X. citri, because there is an identity to fleN, a microorganism flagellar formation regulator gene. The motility and infective potential in planta results of the mutant deleted for this ORF corroborate the literature, showing a similar pattern presented in Pseudomonas aeruginosa and Vibrio cholerae deleted mutants for fleN. Despite this, there was no subcellular localization of the studied ORF protein. It suggests that this ORF does not interfere in flagellar localization nor in adequate divisional septa formation as... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Nilce Maria Martinez Rossi / Resumo: A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri é um fitopatógeno causador do cancro cítrico que compromete parte da produção de laranjas do Estado de São Paulo, com reflexos negativos para a economia do Estado e do País. Para que haja um controle futuro do cancro cítrico, vários pesquisadores se empenharam no Projeto Genoma-Xanthomonas visando desvendar o conjunto gênico desta bactéria e fornecer subsídios para a identificação dos genes envolvidos com a sua patogenicidade. Neste sentido, o atual trabalho visa o monitoramento da expressão gênica do patógeno quando submetido a diferentes condições ambientais, tais como variações no pH extracelular e antibacterianos utilizando o Differential Display RT - PCR. Deste modo, obtivemos a expressão de genes importantes quando o microrganismo foi submetido ao pH 8.0 tais como: um gene relacionado a um transportador MFS, valina - piruvato aminotransferase, glucano 1,4--glucosidase e uma proteína hipotética conservada. Quando submetida à agentes inibidores como a ampicilina, a Xanthomonas expressou proteínas como a integrase, proteína de virulência e uma fosforibosilformilglicinamida ciclo ligase. Quando em meio de cultura contendo penicilina, a bactéria expressou o gene da tirosil t-RNA sintetase. Há um grande interesse em desvendar os mecanismos de ataque da Xanthomonas axonopodis pv. citri, na sua interação com o vegetal e também suas estratégias para inibir o sistema de defesa do hospedeiro, promovendo o surgimento da doença. Neste sentido, espera-se que estes resultados, adicionados a outros projetos funcionais, possam fornecer informações quanto ao mecanismo de defesa da Xanthomonas, bem como da interação planta-bactéria e conseqüentemente auxiliar no controle do cancro cítrico. / Abstract: The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri is a pathogen causing citric canker that compromises part of the orange production in the State of São Paulo, with negative consequences for the economy of the State and the Country. For the future control of citric canker, several investigators participated in the Xanthomonas Genome Project in order to determine the gene set of this bacterium and to contribute to the identification of the genes involved in its pathogenicity. In this respect, the objective of the current study was to monitor the gene expression of the pathogen when submitted to different environmental conditions such as variation in extracellular pH, and to different antibacterial agents using Differential Display RT-PCR. Using this method we obtained the expression of important genes when the bacteria were submitted to pH 8.0, such as a gene related to an MFS transporter, valine-pyruvate aminotransferase, glucan 1,4--glucosidase and a conserved hypothetical protein. When submitted to the action of inhibitory agents such as ampicillin, Xanthomonas expressed various proteins, i.e., integrase, virulence protein and a phosphoribosylformylglycinamide cycloligase. In a culture containing penicillin, the bacteria expressed the gene of tyrosyl t-RNA synthetase. There is great interest in determining the mechanisms of attack of Xanthomonas axonopodis pv. citri, its interaction with plants and also the strategies it uses to inhibit the defense system of the host, promoting the onset of the disease. In this respect, the present results, added to those obtained in other functional projects, are expected to provide information about the defense mechanism of Xanthomonas and about the plant-bacterium interaction in order to contribute to the control of citric canker / Mestre

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-06. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:55Z : No. of bitstreams: 1 000856518_20170619.pdf: 389927 bytes, checksum: 4be3b8327beb9325c295271ea9eaffa2 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-06-19T16:12:33Z: 000856518_20170619.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-06-19T16:13:18Z : No. of bitstreams: 1 000856518.pdf: 1255973 bytes, checksum: 911854ad6a713ea1a328b649f79c9d4d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Xanthomonas. citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma das doenças mais graves que afetam plantas cítricas de importância comercial em todo o mundo. O controle eficaz para o cancro cítrico constitui na eliminação de plantas infectadas em programas rigorosos para conter a propagação da bactéria. No entanto, o relaxamento recente nas políticas para combater cancro cítrico em áreas como o estado de São Paulo - Brasil, está a contribuir para a propagação da doença. O conhecimento da biologia deste patógeno de plantas e também dos mecanismos envolvidos na interação planta-patógeno são de grande importância para apoiar o desenvolvimento de estratégias para lidar com o cancro cítrico. Um trabalho recente de nosso grupo demonstrou que os mutantes X. citri com disrupção do gene parB são comprometidos na segregação cromossômica e na capacidade de produzir os sintomas da doença na planta. No presente trabalho, nós estendemos nossas caracterizações, avaliando os efeitos da falta de parB em mutantes X. citri através de uma deleção limpa. ParB é uma proteína de ligação ao DNA e está envolvida no processo de segregação cromossômica através de interação com outras proteínas. Devido à dificuldade de deleção de genes envolvidos neste processo em X. citri, o nocaute de parB foi realizado numa variante abrigando um plasmídeo replicativo capaz de expressar cópias extras de ParB (ParB-TAP) sob o controle de para (promotor de arabinose). A viabilidade de X. citri parB nocaute (XacΔparB-pLAC2) foi avaliada em experimentos de curva de crescimento e em comparação com a estirpe do tipo selvagem, em condições de repressão ou de indução de parB-tap ligado a este promotor; O objetivo foi explorar as condições de depleção e superexpressão de ParB e seus efeitos através da caracterização do referido promotor. Em seguida, X. citri parB nocaute foi visualizado por microscopia de... / Xanthomonas citri ssp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, one of the most severe diseases that affect citrus plants of commercial importance around the world. An effective control for citrus canker constitutes the elimination of infected plants in rigorous programs to contain the spread of the bacteria. However, recent relaxation in the policies to combat citrus canker in areas such as the state of São Paulo, Brazil, the major orange juice producer in the world, are contributing to the spread of the disease. Therefore, knowledge of the biology of this plant pathogen and also of the mechanisms involved in plant-pathogen interaction are of great importance to support the development of strategies to deal with citrus canker. Recent work from our group demonstrated that X. citri mutants disrupted for parB are compromised in chromosome segregation and are unable to produce disease symptoms in plant. In the present work, we extended our characterizations by evaluating the effects of a lack of ParB in X. citri mutants carrying a clean deletion of its coding DNA. ParB is a DNA binding protein and is involved in chromosome segregation process through interaction with other proteins. Because of difficult in genes deletion involved this process in X. citri, the parB gene was deleted in a X. citri variant harboring a replicative plasmid able to express extra copies of ParB (ParB-TAP) under the control of the para (arabinose promoter). The viability of the X. citri parB knockout was assessed in growth curve experiments and compared with the wild type strain under different conditions of parB-tap repression or induction. The aim was to explore the conditions depletion and overexpression of ParB and its effects through the characterization of para in X. citri Thus, the X. citri parB knockout was visualized under differential interference contrast (DIC) microscopy in order to detect morphological alterations normally expected from ...

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-25Bitstream added on 2015-04-09T12:47:59Z : No. of bitstreams: 1 000817146.pdf: 479870 bytes, checksum: d3427b349dc719a504332ddf82064866 (MD5) / O estudo da interação planta-patógeno é de grande importância para o entendimento do cancro cítrico, justificando assim a busca por genes que estejam ligados a patogenicidade e virulência em Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), agente causal dessa doença. Neste estudo, foi realizada mutagênese aleatória por inserção do transposon EZ-Tn5 in vitro no genoma da Xac. Obteve-se 8000 mutantes onde 292 foram conduzidos em ensaio experimental in planta. Cinco mutantes expressaram sintomatologia alterada, dois com ausência total de sintomas e três com leve hiperplasia. A análise da sequência dos genes onde se inseriu o transposon indicam mutações nos genes purF, yapH, oar, um gene que codifica uma proteína hipotética (XAC 0196), e na região entre os genes pobB (XAC0362) e glpR (XAC0361). As análises de curvas de crescimento bacteriano in planta demonstraram que, exceto o gene purF, todos os demais podem ser genes envolvidos na patogenicidade de Xac. Dois destes, yapH e oar são descritos como relacionados à adesividade bacteriana, evidenciando que a interferência nesse processo exerce influência direta no sucesso da infecção de Xac. Destaca-se também a importância da identificação de uma proteína hipotética, já que essa apresentou sintomatologia atenuada quando ocorreu a inserção do transposon / The study of plant-pathogen interaction is very important to citrus canker understanding, justifying the search for virulence and pathogenicity related genes in Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), causal agent of this disease. In this study, a random mutagenesis by Tn5 transposon insertion into Xac’s genome was performed. Eight thousand mutants were produced and 292 mutants were tested in planta. From those, five mutants expressed altered symptomatology, two showed complete absence of symptoms and three reduced hyperplasia. Gene sequences analysis where transposon was inserted, indicated mutations in purF, yapH and oar genes, in a region that codes for a hypothetical protein (XAC0196), and in a region between pobB (XAC0362) and glpR (XAC0361) genes. Analysis of bacteria growth curve in planta showed that, except for purF gene, all the others genes may be involved in Xac pathogenicity. Two of these genes, yapH and oar, are described as bacterial adhesion related genes, highlighting that interference in this process has direct influence in the Xac infection success. The importance of hypothetical protein identification is emphasized, since it presented attenuated symptomatology when mutated

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:27:23Z : No. of bitstreams: 1 000199389.pdf: 584941 bytes, checksum: 5a9337c1a6d76389fabc4039dfce878f (MD5) / A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri é um fitopatógeno causador do cancro cítrico que compromete parte da produção de laranjas do Estado de São Paulo, com reflexos negativos para a economia do Estado e do País. Para que haja um controle futuro do cancro cítrico, vários pesquisadores se empenharam no Projeto Genoma-Xanthomonas visando desvendar o conjunto gênico desta bactéria e fornecer subsídios para a identificação dos genes envolvidos com a sua patogenicidade. Neste sentido, o atual trabalho visa o monitoramento da expressão gênica do patógeno quando submetido a diferentes condições ambientais, tais como variações no pH extracelular e antibacterianos utilizando o Differential Display RT - PCR. Deste modo, obtivemos a expressão de genes importantes quando o microrganismo foi submetido ao pH 8.0 tais como: um gene relacionado a um transportador MFS, valina - piruvato aminotransferase, glucano 1,4--glucosidase e uma proteína hipotética conservada. Quando submetida à agentes inibidores como a ampicilina, a Xanthomonas expressou proteínas como a integrase, proteína de virulência e uma fosforibosilformilglicinamida ciclo ligase. Quando em meio de cultura contendo penicilina, a bactéria expressou o gene da tirosil t-RNA sintetase. Há um grande interesse em desvendar os mecanismos de ataque da Xanthomonas axonopodis pv. citri, na sua interação com o vegetal e também suas estratégias para inibir o sistema de defesa do hospedeiro, promovendo o surgimento da doença. Neste sentido, espera-se que estes resultados, adicionados a outros projetos funcionais, possam fornecer informações quanto ao mecanismo de defesa da Xanthomonas, bem como da interação planta-bactéria e conseqüentemente auxiliar no controle do cancro cítrico. / The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri is a pathogen causing citric canker that compromises part of the orange production in the State of São Paulo, with negative consequences for the economy of the State and the Country. For the future control of citric canker, several investigators participated in the Xanthomonas Genome Project in order to determine the gene set of this bacterium and to contribute to the identification of the genes involved in its pathogenicity. In this respect, the objective of the current study was to monitor the gene expression of the pathogen when submitted to different environmental conditions such as variation in extracellular pH, and to different antibacterial agents using Differential Display RT-PCR. Using this method we obtained the expression of important genes when the bacteria were submitted to pH 8.0, such as a gene related to an MFS transporter, valine-pyruvate aminotransferase, glucan 1,4--glucosidase and a conserved hypothetical protein. When submitted to the action of inhibitory agents such as ampicillin, Xanthomonas expressed various proteins, i.e., integrase, virulence protein and a phosphoribosylformylglycinamide cycloligase. In a culture containing penicillin, the bacteria expressed the gene of tyrosyl t-RNA synthetase. There is great interest in determining the mechanisms of attack of Xanthomonas axonopodis pv. citri, its interaction with plants and also the strategies it uses to inhibit the defense system of the host, promoting the onset of the disease. In this respect, the present results, added to those obtained in other functional projects, are expected to provide information about the defense mechanism of Xanthomonas and about the plant-bacterium interaction in order to contribute to the control of citric canker

Orientador: Henrique Ferreira / Banca: Alessandra Alves de Souza / Banca: Patricia Pasquali Parise Maltempi / Resumo: Xanthomonas. citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma das doenças mais graves que afetam plantas cítricas de importância comercial em todo o mundo. O controle eficaz para o cancro cítrico constitui na eliminação de plantas infectadas em programas rigorosos para conter a propagação da bactéria. No entanto, o relaxamento recente nas políticas para combater cancro cítrico em áreas como o estado de São Paulo - Brasil, está a contribuir para a propagação da doença. O conhecimento da biologia deste patógeno de plantas e também dos mecanismos envolvidos na interação planta-patógeno são de grande importância para apoiar o desenvolvimento de estratégias para lidar com o cancro cítrico. Um trabalho recente de nosso grupo demonstrou que os mutantes X. citri com disrupção do gene parB são comprometidos na segregação cromossômica e na capacidade de produzir os sintomas da doença na planta. No presente trabalho, nós estendemos nossas caracterizações, avaliando os efeitos da falta de parB em mutantes X. citri através de uma deleção limpa. ParB é uma proteína de ligação ao DNA e está envolvida no processo de segregação cromossômica através de interação com outras proteínas. Devido à dificuldade de deleção de genes envolvidos neste processo em X. citri, o nocaute de parB foi realizado numa variante abrigando um plasmídeo replicativo capaz de expressar cópias extras de ParB (ParB-TAP) sob o controle de para (promotor de arabinose). A viabilidade de X. citri parB nocaute (XacΔparB-pLAC2) foi avaliada em experimentos de curva de crescimento e em comparação com a estirpe do tipo selvagem, em condições de repressão ou de indução de parB-tap ligado a este promotor; O objetivo foi explorar as condições de depleção e superexpressão de ParB e seus efeitos através da caracterização do referido promotor. Em seguida, X. citri parB nocaute foi visualizado por microscopia de... / Abstract: Xanthomonas citri ssp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, one of the most severe diseases that affect citrus plants of commercial importance around the world. An effective control for citrus canker constitutes the elimination of infected plants in rigorous programs to contain the spread of the bacteria. However, recent relaxation in the policies to combat citrus canker in areas such as the state of São Paulo, Brazil, the major orange juice producer in the world, are contributing to the spread of the disease. Therefore, knowledge of the biology of this plant pathogen and also of the mechanisms involved in plant-pathogen interaction are of great importance to support the development of strategies to deal with citrus canker. Recent work from our group demonstrated that X. citri mutants disrupted for parB are compromised in chromosome segregation and are unable to produce disease symptoms in plant. In the present work, we extended our characterizations by evaluating the effects of a lack of ParB in X. citri mutants carrying a clean deletion of its coding DNA. ParB is a DNA binding protein and is involved in chromosome segregation process through interaction with other proteins. Because of difficult in genes deletion involved this process in X. citri, the parB gene was deleted in a X. citri variant harboring a replicative plasmid able to express extra copies of ParB (ParB-TAP) under the control of the para (arabinose promoter). The viability of the X. citri parB knockout was assessed in growth curve experiments and compared with the wild type strain under different conditions of parB-tap repression or induction. The aim was to explore the conditions depletion and overexpression of ParB and its effects through the characterization of para in X. citri Thus, the X. citri parB knockout was visualized under differential interference contrast (DIC) microscopy in order to detect morphological alterations normally expected from ... / Mestre

Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Flavia Maria de Souza Carvalho / Banca: Fabrício José Jaciani / Resumo: O estudo da interação planta-patógeno é de grande importância para o entendimento do cancro cítrico, justificando assim a busca por genes que estejam ligados a patogenicidade e virulência em Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), agente causal dessa doença. Neste estudo, foi realizada mutagênese aleatória por inserção do transposon EZ-Tn5 in vitro no genoma da Xac. Obteve-se 8000 mutantes onde 292 foram conduzidos em ensaio experimental in planta. Cinco mutantes expressaram sintomatologia alterada, dois com ausência total de sintomas e três com leve hiperplasia. A análise da sequência dos genes onde se inseriu o transposon indicam mutações nos genes purF, yapH, oar, um gene que codifica uma proteína hipotética (XAC 0196), e na região entre os genes pobB (XAC0362) e glpR (XAC0361). As análises de curvas de crescimento bacteriano in planta demonstraram que, exceto o gene purF, todos os demais podem ser genes envolvidos na patogenicidade de Xac. Dois destes, yapH e oar são descritos como relacionados à adesividade bacteriana, evidenciando que a interferência nesse processo exerce influência direta no sucesso da infecção de Xac. Destaca-se também a importância da identificação de uma proteína hipotética, já que essa apresentou sintomatologia atenuada quando ocorreu a inserção do transposon / Abstract: The study of plant-pathogen interaction is very important to citrus canker understanding, justifying the search for virulence and pathogenicity related genes in Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), causal agent of this disease. In this study, a random mutagenesis by Tn5 transposon insertion into Xac's genome was performed. Eight thousand mutants were produced and 292 mutants were tested in planta. From those, five mutants expressed altered symptomatology, two showed complete absence of symptoms and three reduced hyperplasia. Gene sequences analysis where transposon was inserted, indicated mutations in purF, yapH and oar genes, in a region that codes for a hypothetical protein (XAC0196), and in a region between pobB (XAC0362) and glpR (XAC0361) genes. Analysis of bacteria growth curve in planta showed that, except for purF gene, all the others genes may be involved in Xac pathogenicity. Two of these genes, yapH and oar, are described as bacterial adhesion related genes, highlighting that interference in this process has direct influence in the Xac infection success. The importance of hypothetical protein identification is emphasized, since it presented attenuated symptomatology when mutated / Mestre

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Rafael Marini Ferreira / Banca: Fabricio José Jaciani / Banca; Helen Alves Penha / Resumo: Diante da importância do cancro cítrico para a citricultura mundial, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, o agente causal da doença, tem sido amplamente estudada. Pesquisadores brasileiros realizaram o sequenciamento completo do genoma da X. citri subsp. citri isolado 306 (Xac306), com o intuito de elucidar os genes e mecanismos envolvidos na patogenicidade e/ou virulência da bactéria. As ORFs XAC2361 e XAC3898 possuem tamanhos e locais diferentes no genoma da Xac306, mas têm em comum o domínio Peptidase_M23, cujo processo biológico predito é de hidrolase de parede celular, mas a real função destas proteínas em Xac ainda é desconhecida. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio da mutação sítio-dirigida, se as ORFs XAC2361 e XAC3898 estão relacionadas com a virulência e/ou patogenicidade de X. citri subsp. citri 306 e com o desenvolvimento do cancro cítrico. Para isso, foram realizados testes in vitro e in planta dos mutantes obtidos, visando observar alterações fenotípicas. Devido a presença de peptídeo sinal, a ORF XAC2361 foi fundida à proteína fluorescente mCherry (XAC2361-mCherry) para expressão in vivo e avaliação por microscopia de fluorescência. As análises fenotípicas demonstraram que o mutante ΔXAC2361 não apresentou alterações nos sintomas quando avaliado em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), porém apresentou menor capacidade de crescimento in vitro, menor motilidade swimming e swarming e menor capacidade de sobrevivência em SDS. Por outro lado,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In view of the importance of citrus canker in citrus culture worlwide, the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, the causal agent of this disease, has been extensively studied. Brazilian researchers performed the complete sequencing of the genome of X. citri subsp. citri isolate 306 (Xac306), in order to elucidate the genes and mechanisms involved in the pathogenicity and/or virulence of Xac. The ORFs XAC2361 and XAC3898 have different sizes and location in the genome, but have in common the M23 Peptidase domain, whose biological process is predicted to act as cell wall hydrolase, but the actual function of these proteins in Xac is still unknown. This work aimed to evaluate, through site-directed mutagenesis, whether XAC2361 and XAC3898 ORFs are related to the virulence and / or pathogenicity of Xac306 and the development of citrus canker. In order to observe phenotypic changes, in vitro and in planta tests of the mutants were carried out. Due to the presence of signal peptide, the ORF XAC2361 was fused to the mCherry fluorescent protein (XAC2361-mCherry) for in vivo expression and fluorescence microscopy evaluation. Phenotypic analyzes demonstrated that the ΔXAC2361 mutant showed no change in symptoms when evaluated in Mexican lime (Citrus limonia Osbeck), but presented lower in vitro growth capacity, lower swimming and swarming motility, and lower survival capacity in SDS. On the other hand, the ΔXAC3898 mutant showed a significant reduction in virulence, lower in plant... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor