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Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T13:44:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JéssicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T13:44:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JéssicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T13:44:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JéssicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertacao_BCM_JessicaBarreto_CPqRR2015.pdf.txt: 6013 bytes, checksum: 3c416ed5aaca48410b85e3561489de45 (MD5) Dissertacao_BCM_JessicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A bactéria Wolbachia pipientis tem sido investigada como nova estratégia de controle biológico que pode ser usada simultaneamente com as medidas de controle de vetores já existentes. O potencial desse endossimbionte para o controle de doenças transmitidas por vetores está na sua capacidade de induzir diversos efeitos no hospedeiro, dentre eles a capacidade de bloquear patógenos. Nos dias de hoje existem técnicas de transinfecção que permitem criar associações entre Wolbachia e hospedeiros que não abrigam a bactéria naturalmente. Estudos anteriores têm demonstrado que nesses casos o fenótipo de bloqueio é mais intenso em comparação àquele observado em mosquitos com infecção natural. As infecções nativas podem se atenuar depois de um processo de coevolução entre o hospedeiro e o endossimbionte, entretanto, sob condições específicas, possivelmente seja observada uma capacidade residual de interferência a patógenos. Uma dessas circunstâncias pode ser a carga parasitária adquirida pelo vetor em uma alimentação sanguínea. Diante do exposto, realizamos uma análise comparativa entre a capacidade de bloqueio em duas espécies de Aedes infectados com Wolbachia, o mosquito Aedes fluviatilis com a cepa natural wFlu, e o Aedes aegypti transinfectado com a cepa wMel. Mosquitos tratados com tetraciclina foram usadas como controle para cada espécie. Investigamos a capacidade de bloqueio para o Dengue vírus e para o modelo de malária aviária Plasmodium gallinaceum. Os mosquitos foram infectados diretamente em aves com curvas ascendentes de parasitemias ou via alimentação sanguínea artificial e os intestinos foram dissecados 7 dias após infecção para contagem de oocistos. Em outra série de experimentos vírus dengue sorotipo 3 foi adicionado a sangue humano para obter titulações que variaram de 106 a 103 PFU/mLe as cargas virais foram quantificadas aos 7 e 14 dias pós infecção sanguínea por RT-qPCR. Em contraste ao que foi observado para o P. gallinaceum, observamos diferentes respostas ao virus nas duas espécies de Aedes, a cepa wMel induziu forte interferencia a este patógeno enquanto que wFlu levou ao aumento da susceptibilidade no Ae. fluviatilis aos 7 dias pós infecção. Diante desses resultados investigamos a presença do vírus na saliva de Ae. fluviatilis. Mais uma vez foi observado aumento da susceptibilidade dos mosquitos da linhagem wFlu e detectamos a presença do virus em parte das salivas coletadas. Nossos dados sugerem que a cepa wMel não é eficiente no bloqueio do P. gallinaceum, o que indica que a capacidade de interferencia não é uma característica universal para os diferentes patógenos. Constatamos que a carga parasitária não é um fator que induz a capacidade de bloqueio em Ae fluviatilis, já que esse feito não foi observado em nenhuma das parasitemias testadas. Criticamente, demonstramos o potencial aumento da susceptibilidade de Ae. Fluviatilis ao vírus dengue em uma infecção nativa de Wolbachia. Nossos resultados destacaram que a análise da capacidade de bloqueio a patógenos em mosquitos ransinfectados com Wolbachia é complexa e que o estudo de espécies correlatas naturalmente infectadas por este ndossimbionte podem ajudar a esclarecer questões relacionadas com o fenótipo de bloqueio de infecção a patógenos. / Wolbachia pipientis has been investigated as a new biological control strategy that can be used simultaneously with current vector control methods. The potential of this endosymbiont for disease control is its ability to induce various effects on the host, including pathogen blocking. Nowadays there are transinfections techniques that allow to create associations in hosts that not harbor the bacteria naturally. Previous studies have shown that pathogen blocking is stronger in those cases compared to what observed in mosquitoes with a native infection. Natural infections may have attenuated following a long period of co-evolution between host and symbiont. However there may be a residual capacity for blocking in natural strains that could manifest under certain conditions, as according pathogen load acquired by the mosquito during a blood feeding. In this study we conducted a comparative analysis of the effect of pathogen load on the pathogen blocking in two different Wolbachia-infected mosquitoes; the wFlu strain in its natural host, Aedes fluviatilis, and the wMel strain transinfected in Aedes aegypti. Tetracycline treated, Wolbachia-uninfected mosquitoes served as a control line for each species. We looked at pathogen blocking against dengue virus and the model avian malaria parasite Plasmodium gallinaceum. Malaria infections were conducted either by feeding directly on an infected chicken, over several day throughout the course of P. gallinaceum infection, or by artificial feeding. Plasmodium oocyst numbers were counted at 7dpi. Neither mosquito species displayed consistent pathogen blocking, nor was there a change in the effect of either Wolbachia strain at lower pathogen loads. Dengue virus in cell culture was mixed with human blood to produce different final concentrations that ranged from 106 to 103 PFU/mL, virus levels were quantified at 7 and 14 days pos blood infection by RT-qPCR. In contrast to P. gallinaceum, we observed a differential response to DENV for the two species, with wMel producing a strong blocking effect when viral loads were sufficient for mosquitoes to become infected. On the other hand, wFlu appeared to increase susceptibility to DENV, as infection rates were higher than in Wolbachia-uninfected Ae. fluviatilis at 7dpi. Because of these results we investigated the vector competence of Ae. fluviatilis. We were able to detect the presence of the virus in a small portion of Ae. fluviatilis saliva. We again observed that wFlu enhanced susceptibility rates at the whole body level, however Wolbachia appeared to decrease the prevalence of virus in the saliva. Our data suggest firstly that wMel is effective at blocking P. gallinaceum, which indicates that pathogen blocking is not ubiquitous for all pathogens even among transinfections. Lower pathogen loads did not induce pathogen blocking in infected Ae. fluviatilis, which suggests that induction of the phenotype, is not dependent on the amount of pathogen ingested by the mosquito. Critically, we firstly demonstrated a potential pathogen enhancement effect for a native Wolbachia infection and dengue virus. However, the fact that wFlu appears to reduce DENV levels in saliva, may indeed be evidence that a latent pathogen blocking persists in this association.Overall, our results provide further evidence of the complexity of the pathogen blocking response, and highlight the insight that can be gained by studyi ng the phenotype in native strain.

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-19T08:44:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Totti_MarildaAparecidaGoncalves_M.pdf: 2950217 bytes, checksum: 8656561b666ad4485dcb6dafe09fdf85 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A presença de cinco espécies de Candida foi estudada em ratos normais e xerostômicos. Os animais foram inoculados na cavidade bucal durante 4 dias consecutivos com '10 POT.8' células de C. albicans, C. parapsilosis, C. Tropicalis, C. Guilliermondii e C. Krusei. Após 1. 2. 3. 5. 8. 15 e 30 dias da última inoculação, as leveduras foram recuperadas da saliva e quantificadas. C. albicans foi a única espécie recuperada em maior quantidade da boca dos ratos sialoadenectomizados em relação aos normais. C. Tropicalis, C. guilliermondii e C. krusei permaneceram na boca de ratos normais e sialoadenectomizados pelo período de até 5 dias, enquanto a C albicans e C. parapsilosis foram recuperadas em todos os períodos experimentais. Estes resultados confirmam que a xerostomia facilita a instalação, proliferação e persistência de C. albicans na cavidade bucal de ratos, não interferindo, porém, nas outras espécies. Os dados deste estudo sugerem que fatores inerentes às espécies atuam no processo de colonização do fungo na boca de ratos, resultando em diferentes graus de patogenicidade / Abstract: The presence of five Candida species was studied in the mouth of normal and xerostomic rats. The animals were innoculated into the oral cavity with '10 POT.8' cells of Candida albicans, C. Parapsitosis, C. Tropicalis, C. Guilliermondii and C. krusei during 4 consecutive days. The yeasts were recovered from saliva 1. 2. 3. 5. 8. 15 and 30 days after the last innoculation and quantified. C. albicans was the only specie recovered in higher quantity from sialoadenectomized rats, C. Tropicalis, C. Guilliermondii and C. krusei were recovered from the mouth of normal and sialoadenectomized rats up to 5 days after innoculation and C. albicans and C. parapsilosis in all periods. These results confirm that xerostomia facilitate the instalation, proliferation and persistence of C. albicans in the rat's oral cavity, but doesn't interfere with the other species. These differences suggest that factors inherent to the Candida species are relevant for colonization of the mouth of rats, resulting in different degrees of patogenicity / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

A observação das infecções por Nocardia species em pacientes de vários hospitais de Porto Alegre, RS, de 1977 a 1991 revelou 14 casos de nocardiose pulmonar; 1 caso de nocardiose cerebral; 1 caso de nocardiose cutânea e 1 caso de micetoma. Dos 17 casos, somente 2 pacientes ( 11 ,8%) não apresentavam nenhuma doença prévia à infecção por Nocardia spp . Os demais 15 pacientes (88,2%) apresentavam doenças ou fatores associados a essas doenças causadores de diminuição da imunidade celular, representando casos em que a nocardiose foi considerada uma infecção oportunística. As doenças predisponentes mais freqüentes foram neoplasias, que incidiram em 6 pacientes (35%): doença de Hodgkin (1 paciente),linfoma e câncer do laringe(1 paciente), câncer de mama (2 pacientes), carcinoma brônquico (1 paciente) e neoplasia cerebral metastática indiferenciada (1 paciente). Cinco pacientes faziam uso de corticoesteroides em altas doses e 4 pacientes haviam usado radioterapia. Quimioterapia antiblástica estava sendo usada em 3 desses casos, também associada. DBPOC incidiu em 6 pacientes (35%), porém somente em 1 caso foi a única doença subjacente. Em outros 2 casos foi associada a hepatite e, nos demais 3 casos foi associada a doenças imunodepressoras severas e ao uso de corticóide em altas doses. Dois pacientes (11 ,7%) eram portadores de transplante renal, em uso de altas doses de corticóides e quimioterapia antiblástica. Polimiosite ocorreu associada a neoplasia em 1 caso e em outro foi a doença principal, que exigiu o uso de corticóides para seu tratamento. Tivemos 1 caso de esclerose múltipla em corticoterapia, 1 caso de LES em corticoterapia e quimioterapia antiblástica e 1 caso de SIDA. Diabete muito provavelmente ocorreu como conseqüência de corticoterapia em 3 pacientes. Corticoterapia foi a condição associada imunodepressora mais prevalente, pois foi usada em 11 pacientes (64,7%) e quimioterapia antiblástica em 6 casos (35,0%). A apresentação radiológica mais frequente da nocardiose pulmonar foi infiltração pulmonar ou consolidação (71 ,4%), seguida de cavitação (57,0%) e nódulos pulmonares (21 ,4%). Comparamos a nossa série de 17 pacientes com as séries da literatura, especialmente com a série de PRESANT et a/ (que em 1973 estudaram fatores influenciando a mortalidade de 147 pacientes com nocardiose) para avaliar diferenças e semellhanças estatisticamente significativas. Foram utilizados o teste "T" de Student para comparação de médias, o teste do Quiquadrado para comparação de proporções de indivíduos e, quando a menor frequência esperada foi inferior a 5, usou-se o teste exato de Fisher. Concluímos que as infecções por Nocardia species em Porto Alegre se assemelham à experiência de outros autores da literatura, quanto à sua apresentação clínico-radiológica; quanto às doenças e fatores imunodepressores prévios do hospedeiro; quanto ao aspecto de transmissão nosocomial entre portadores de transplante renal e quanto à evolução dos casos para cura ou óbito; com as características de que a nocardiose em nossa série foi uma infecção significativamente mais oportunística (P<0,05) do que para Presant et ai (1973), o que se deve principalmente ao número significativamente maior (P<0,05) de pacientes com neoplasias e em tratamento com drogas imunossupressoras em nossa série; de que a incidência de nocardiose do SNC e conseqüentemente de nocardiose sistêmica em nossa série foram significativamente menores (P<0,05), provavelmente devido à não sistematização do uso da tomografia computadorizada cerebral em nossos casos com sintomas neurológicos. A mortalidade dos nossos 17 pacientes com nocardiose (46, 7%) foi percentualmente menor do que a mortalidade de PRESANT et ai (59,0%), embora não significativamente menor (P<0,05). Mas nossa mortalidade não foi maior, apesar de nosso grupo ser constituído significativamente (P<0,05) por pacientes mais imunocomprometidos. Isso sugere que outros fatores tenham influenciado nossos resultados, tendendo a diminuir nossa mortalidade; entre eles, provavelmente, o diagnóstico feito mais precocemente e a influência de cepas menos patogênicas ou até mesmo espécies menos invasivas de Nocardia em nossa série, por nós identificadas somente como Nocardia spp. A nossa mortalidade (46,7%) foi semelhante à mortalidade de 42,4% obtida num grupo de 643 pacientes imunodeprimidos de um total de 1000 casos de nocardiose revisados desde 1950 por BEAMAN & BEAMAN(1994), em contraste com a mortalidade de apenas 19,8% no grupo de pacientes não imunodeprimidos, em que nocardiose foi uma infecção primária, confirmando que o fator que mais influencia na evolução da doença é a condição imune do hospedeiro . Esses dados confirmam a coincidência dos achados obtidos em nossa experiência de nocardiose em Porto Alegre, RS, 1977-1991. / lnfections by Nocardia species observed in 17 patients from many hospitais in Porto Alegre (RS), from 1977 to 1991 showed 14 cases of pulmonary nocardiosis; one case of cerebral nocardiosis; one case of cutaneous nocardiosis and one case of mycetoma. From these 17 cases, only 2 patients (11 ,8%) were previously healthy. The remaining 15 patients (88,2%) had underlying previous diseases or predisposing factors, representing cases of opportunistic nocardial disease. The most frequent predisposition for nocardial infection was malignancy, that ocurred in 6 patients(35,0%) : Hodgkin's disease(1 patient), lymphoma and cancer of the larynx (1 patient), breast cancer (2 patients) , lung cancer(1 patient) and cerebral metastatic cancer (1 patient). Five patients were taking corticoesteroids in high doses and four of them had done radiotherapy . Antineoplastic therapy was associated in three patients. Six patients had COPO previously, but in only one of them it was the main disease; in the remaining cases, it was associated to hepatites(2 patients), cancer(1 patient), AIDS(1 patient), multiple esclerosis and corticosteroid therapy (1 patient). In ou r nocardiosis series there were 2 renal transplant recipients (11, 7%) taking corticosteroids in high doses and antineoplastic therapy . Diabetes steroid-induced ocurrred in 3 patients. Polimiosites ocurred in 1 cancer patient and in another patient who needed to use corticosteroids for its treatment. We had 1 patient with multiple esclerosis on corticosteroids, 1 patient with SLE on corticosteroids and antineoplastic therapy , too; and finally, 1 patient with AIDS. Corticotherapy was the most frequent predisposing factor to nocardiosis in our series, for it was used in 11 patients (64,7%) before nocardiosis. Antineoplastic therapy was done in 6 patients (35,0%). The most common Roentgen patterns were pulmonary infiltrates or consolidations (71 ,4%), pulmonary cavitation (57,0%) and pulmonary nodules(21 ,4%). Since meaningful patterns of disease can be observed only in large samples of patients, we have prefered to compare our sample of 17 patients to the 14 7 reported cases collected from the medicai literature by PRESANT et a/ (1973), who studied factors affecting the mortality. Statistical analysis were performed using Student "T"test, Chi squared test and Fisher exact test in arder to evaluate the similarities and differences statistically significants. We have concluded that infections caused by Nocardia species in Porto Alegre(RS) are very similar to that reported in the literature : as to the clinico-radiological presentation; as to underlying diseases and predisposing factors prior to nocardiosis; as to the aspects of nosocomial transmission among transplant recipients and the outcome . There was a larger group of cancer patients on steroids and on antineoplastic therapy in our series (P<0,05) in comparison to Presant's 147 patients, and in conseqüence nocardiosis is a more opportunistic infection to us. The incidence of SNC nocardiosis and systemic nocardiosis in our series was significantly smaller (P<0,05) probably because we haven't done brain CT in ali our patients who have had neurologic simptoms. Althougt the mortality rate of our sample of 17 patients with nocardiosis (46, 7%) was percentually smaller than the mortality rate of Presan et a/ (59,0%), this difference is not sifnificantly smaller (P<0,05). Despite of that, our mortality rate is not higher than his, even our series of patients being significantly more imunnocompromised than his (P<0,05). This suggests that other factors might have affected our better results, diminishing our mortality rate. Among them are probably the diagnosis made earlier in ou r series (P<0,01) and the influence of less pathogenic strains of Nocardia or even less invasive species of Nocardia which were identified by us only as Nocardia spp. Ou r mortality rate (46, 7%) was similar to the one obtained in 643 immunodepressed patients ( 42,4% ) from a total of 1000 cases with nocardíosís revíewed sínce 1950 by BEAMAN and BEAMAN (1994); contrastíng to the mortality of only 19,8% in the group of non-immunodepressed patients, where the nocardiosis was a primary infection, confirming that the fact which most influences the evolution of the disease is the immune condition of the host. These data show the similarity between our experience of 17 cases of nocardiosís occured in Porto Alegre, RS (1977-91) and that reported by the literature.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001Bitstream added on 2014-06-13T18:41:14Z : No. of bitstreams: 1 hanna_sa_dr_botfm.pdf: 4239450 bytes, checksum: a2303b4b075a8f209a246b54d76deee8 (MD5) / A virulência microbiana é considerada uma propriedade complexa propiciando ao agente infeccioso condições para penetrar as barreiras protetoras do hospedeiro, sobreviver aos mecanismos de defesa, multiplicar-se e produzir a doença. A paracoccidioidomicose apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, onde o fungo, Paracoccidioides brasiliensis, pode atingir vários tecidos com ênfase ao pulmão. Os mecanismos de disseminação são baseados em evidências indiretas, porém observando-se os aspectos clínicos polimórficos pode-se sugerir que diferentes mecanismos de virulência estão envolvidos. A propriedade do patógeno de interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro é essencial para sua virulência e poucas informações são disponíveis no que se refere aos prováveis mecanismos de interação de P.brasiliensis às células. Assim, foram avaliadas a interação de P.brasiliensis e células epiteliais das linhagens Vero e A549, dando ênfase a interação com componentes da matriz extracelular e o envolvimento do citoesqueleto durante a cinética de interação fungocélula. A cinética da interação mostrou que a adesão do fungo ocorreu a partir de 30 minutos de contato nas duas linhagens celulares levando a um acréscimo no número de leveduras aderidas nos tempos subseqüentes. A presença dos fungos no interior das células ocorreu a partir de duas horas de contato com as células Vero e uma hora com as células A549. A interação de P.brasiliensis com as células epiteliais e componentes da matriz extracelular (MEC) foi avaliada por imunoperoxidase in situ e imunofluorescência indireta. O padrão de reconhecimento nas células epiteliais frente aos soros antifibronectina, anti-laminina e anti-colágeno tipo I foi de maneira diferenciada nas células infectadas. A distribuição característica da marcação... / Microbial virulence is a set of mechanisms that enable the infectious agent to penetrate the host protection barriers and then survive against the defense mechanisms, multiply and cause disease. Paracoccidioidomycosis presents a variety of clinical manifestations, and the fungus Paracoccidioides brasiliensis can reach many tissues, most importantly the lungs. Understanding of the mechanisms of dissemination is based on indirect evidence, and the polymorphic aspects of disease suggest that several virulence mechanisms are involved. The ability of the pathogen to interact with the host superficial structures is essential to its virulence, but little is known about interactions between cells and P.brasiliensis. For this reason, interactions between P.brasiliensis and epithelial Vero and A549 cells were evaluated, with the emphasis on interactions with extracellular matrix and the induction of cytoskeletal alterations during the interaction process fungus-cells. The kinetics of interaction showed that adhesion occurred after 30 minutes of contact between the two cell lines and the yeast, and the number of adhesion points increased on the cells after that. The fungus were inside the Vero cells after two hours and inside A549 after one hour. The interaction between P.brasiliensis and epithelial cells and the components of the extracellular matrix (MEC) were evaluated through immunoperoxidase in situ and indirect immunofluorescence. The recognition patterns of the infected cells against anti-fibronectin, anti-laminin and anti-collagen type I sera were different from those of the uninfected cells. Characteristic distributions of bound anti-fibronectin and anti-laminin on the surface of yeast cells were detected, indicating the presence of specific binding sites for each one. Cytochalasin D, an inhibitor of actin polymerization and colchicine... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Resumo: A virulência microbiana é considerada uma propriedade complexa propiciando ao agente infeccioso condições para penetrar as barreiras protetoras do hospedeiro, sobreviver aos mecanismos de defesa, multiplicar-se e produzir a doença. A paracoccidioidomicose apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, onde o fungo, Paracoccidioides brasiliensis, pode atingir vários tecidos com ênfase ao pulmão. Os mecanismos de disseminação são baseados em evidências indiretas, porém observando-se os aspectos clínicos polimórficos pode-se sugerir que diferentes mecanismos de virulência estão envolvidos. A propriedade do patógeno de interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro é essencial para sua virulência e poucas informações são disponíveis no que se refere aos prováveis mecanismos de interação de P.brasiliensis às células. Assim, foram avaliadas a interação de P.brasiliensis e células epiteliais das linhagens Vero e A549, dando ênfase a interação com componentes da matriz extracelular e o envolvimento do citoesqueleto durante a cinética de interação fungocélula. A cinética da interação mostrou que a adesão do fungo ocorreu a partir de 30 minutos de contato nas duas linhagens celulares levando a um acréscimo no número de leveduras aderidas nos tempos subseqüentes. A presença dos fungos no interior das células ocorreu a partir de duas horas de contato com as células Vero e uma hora com as células A549. A interação de P.brasiliensis com as células epiteliais e componentes da matriz extracelular (MEC) foi avaliada por imunoperoxidase in situ e imunofluorescência indireta. O padrão de reconhecimento nas células epiteliais frente aos soros antifibronectina, anti-laminina e anti-colágeno tipo I foi de maneira diferenciada nas células infectadas. A distribuição característica da marcação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Microbial virulence is a set of mechanisms that enable the infectious agent to penetrate the host protection barriers and then survive against the defense mechanisms, multiply and cause disease. Paracoccidioidomycosis presents a variety of clinical manifestations, and the fungus Paracoccidioides brasiliensis can reach many tissues, most importantly the lungs. Understanding of the mechanisms of dissemination is based on indirect evidence, and the polymorphic aspects of disease suggest that several virulence mechanisms are involved. The ability of the pathogen to interact with the host superficial structures is essential to its virulence, but little is known about interactions between cells and P.brasiliensis. For this reason, interactions between P.brasiliensis and epithelial Vero and A549 cells were evaluated, with the emphasis on interactions with extracellular matrix and the induction of cytoskeletal alterations during the interaction process fungus-cells. The kinetics of interaction showed that adhesion occurred after 30 minutes of contact between the two cell lines and the yeast, and the number of adhesion points increased on the cells after that. The fungus were inside the Vero cells after two hours and inside A549 after one hour. The interaction between P.brasiliensis and epithelial cells and the components of the extracellular matrix (MEC) were evaluated through immunoperoxidase in situ and indirect immunofluorescence. The recognition patterns of the infected cells against anti-fibronectin, anti-laminin and anti-collagen type I sera were different from those of the uninfected cells. Characteristic distributions of bound anti-fibronectin and anti-laminin on the surface of yeast cells were detected, indicating the presence of specific binding sites for each one. Cytochalasin D, an inhibitor of actin polymerization and colchicine... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A criptococose acomete pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com a resposta imune mediada por células T debilitada, sendo portanto, suscetíveis a patógenos oportunistas. C. neoformans possui um repertório de fatores de virulência que permitem o estabelecimento da infecção e sua disseminação para o sistema nervoso central, causando meningoencefalite. O tratamento da criptococose é baseado apenas na utilização prolongada de antifúngicos e provoca muitos efeitos colaterais nos pacientes. Por estes motivos, novas terapias estão sendo abordadas, com o intuito de promover a ativação do sistema imune do hospedeiro para debelar a infecção. Para que tais terapias possam ser desenvolvidas se faz necessário identificar moléculas que estimulem a resposta imune celular. Proteínas de choque térmico de patógenos têm sido utilizadas como alvo no tratamento de muitas doenças infecciosas em seres humanos. Estas proteínas estimulam a resposta imune mediada por células T e apresentam resultados promissores em tratamentos contra infecções fúngicas. Da mesma forma, proteínas que fazem parte do sistema de defesa antioxidante, como as catalases, por exemplo, desempenham um papel importante no combate a radicais livres produzidos pelo hospedeiro e parecem ter outras funções no processo da infecção. O entendimento da biologia destas proteínas bem como a sua participação na interação com células do sistema imune do hospedeiro é fundamental para a validação da sua aplicabilidade no tratamento da criptococose. Nesse contexto, apresentamos aqui um estudo das funções biológicas de uma das proteínas de choque térmico (Hsp70) e de uma das enzimas envolvidas na detoxificação de espécies reativas de oxigênio (catalase 2) do fungo C. neoformans. Também foram avaliados os efeitos terapêuticos destas proteínas no tratamento da criptococose. Demonstramos que a proteína Hsp70 de C. neoformans está localizada na cápsula polissacarídica, sendo importante no processo de adesão da levedura a células epiteliais A549. Demonstramos também que Cn_rHsp70 co-localiza com o principal componente da cápsula polissacarídica a glucuronoxilomanana (GXM) na superfície de macrófagos. A Cn_rHsp70 quando em contato com células do fungo, diminui sua viabilidade celular e não altera o tamanho da cápsula, mas interfere na secreção de GXM. Em relação à catalase 2, foi demonstrado que a proteína é localizada na parede celular do fungo e possui atividade de degradação de peróxido de hidrogênio quando associada à superfície celular. Em ensaios de infecção experimental em animais imunizados com construções de DNA contendo as sequências de Hsp70 e catalase 2, nenhuma das proteínas conferiu proteção, mas ocorreu estímulo da resposta mediada por células Th1 e Th2. O mecanismo pelo qual estas proteínas estimulam o sistema imune ainda precisa ser elucidado. / Cryptococcus neoformans affects immunocompromised patients, especially patients with impaired T cell-mediated immune response, and therefore are susceptible to opportunistic pathogens. C. neoformans has a repertoire of virulence factors that allows the establishment and dissemination of the infection in the central nervous system, causing meningoencephalitis. The virulence factors of Cryptococcus has been subject of many studies that have showed the involvement of gene products in the infection process. However, the treatment of cryptococcal meningoencephalitis consists of antifungal therapy and displays many side effects. For these reasons, new therapies are being addressed, in order to promote the activation of the host immune system to overcome the infection. To develop these therapies, it is necessary to identify molecules that stimulate cell-mediated immune response. Heat shock proteins from many pathogens have been used as a target for the treatment of many humans infectious diseases. These proteins stimulate the T cell-mediated immune response and show promising results in treatment against fungal infections. Similarly, proteins from antioxidant system such as catalase for example, play an important role against free radicals produced by the host and appear to have other functions in the infection process. The understanding of these proteins biology and their involvement with host immune system cells is essential for the validation of its applicability in the treatment of cryptococcosis. In this context, we present here a study of the biological function of a heat shock protein (Hsp70) and one of the enzymes involved in detoxification of reactive oxygen species (catalase 2) of the fungus C. neoformans. We evaluated the therapeutic effects of these proteins in the treatment of cryptococcosis. We have demonstrated that the protein Hsp70 from C. neoformans is located in the polysaccharide capsule, and it is important in the adhesion process of the yeast to epithelial cells A549. Also demonstrated that Cn_rHsp70 co-localizes with the main component of the polysaccharide capsule, glucuronoxilomanana (GXM), on the surface of macrophages. When Cn_rHsp70 are in contact with fungal cells, the cellular viability decreased and does not change the capsule size however, interferes with the GXM secretion. Catalase 2 is deposited on the fungal cell wall and showed activity by hydrogen peroxide degradation. In vivo experiments using animals infected and treated with Hsp70 DNA vaccines and catalase 2, no protection were observed, but there are immune response mediated by Th1 and Th2 cells. The mechanism by which these proteins stimulate the immune system has yet to be elucidated.

O conhecimento a respeito dos fatores que de fato definem a patogenicidade de Acanthamoeba é limitado. A atividade proteolítica apresentada por isolados de Acanthamoeba tem sido associada a funções importantes na patogênese de doenças como ceratite e encefalite granulomatosa amebiana. O presente trabalho avaliou os perfis de atividade proteolítica de meios condicionados de Acanthamoeba isoladas de casos clínicos e do ambiente em gel de zimograma, com o objetivo de caracterizar as proteases secretadas e relacioná-las à capacidade patogênica apresentada pelos isolados nos testes in vivo e in vitro. Os isolados avaliados secretaram quantidades e tipos de proteases diferentes entre si, as quais não foram associadas à origem do isolado, genótipo ou espécie e nem à patogenicidade in vivo de Acanthamoeba. Os modelos in vivo aplicados foram úteis para avaliar a capacidade do mesmo isolado em estabelecer infecções uculares olhos e sistêmicas e diferenciar os isolados quanto ao grau de virulência. Além disso, demonstramos que cepas de origem ambiental são capazes de estabelecer infecções oculares e sistêmicas em animais, destacando o risco que estes protozoários podem oferecer à saúde humana. Em conjunto, nossos dados indicam que, apesar de importantes, testes fenotípicos e genotípicos para verificar diferenças entre isolados não podem prever a virulência dos mesmos, sendo necessário associar estes dados a testes in vivo. / The knowledge about the factors that determine the pathogenicity of Acanthamoeba is limited. The proteolytic activity presented by Acanthamoeba isolates has been associated with important roles in the pathogenesis of diseases such as keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. This study evaluated the profiles of proteolytic activity of Acanthamoeba-conditioned medium from clinical and environmental isolates in zymogram gels, in order to characterize the proteases secreted and relate them to the pathogenic capacity demonstrated by the isolated in in vitro and in vivo tests. The isolates secreted different amounts and types of proteases, which were not associated with the source of the isolate genotype or species, and in vivo pathogenicity of the Acanthamoeba. The in vivo models applied were useful to evaluate the ability of the same strain to establish systemic and eye infections, and to differentiate them in the degree of virulence. Furthermore, we demonstrated that isolates of environmental origin are able to establish ocular and systemic infections in animals, highlighting the risk that this protozoan can offer to human health. Furthermore, our data indicate that, despite important, phenotypic and genotypic tests for detecting differences between isolates cannot predict the virulence of the Acanthamoeba, being necessary to link these data to in vivo tests.