Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-20T17:24:52Z No. of bitstreams: 1 PACIDÔNIO.pdf: 32476477 bytes, checksum: a96cf41a7daea427bc40612b36dfc340 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-20T17:25:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PACIDÔNIO.pdf: 32476477 bytes, checksum: a96cf41a7daea427bc40612b36dfc340 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T17:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PACIDÔNIO.pdf: 32476477 bytes, checksum: a96cf41a7daea427bc40612b36dfc340 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A dengue é um problema médico crescente em países subtropicais e tropicais. A dengue é uma infecção viral que apresentem quatro sorotipos distintos, DENV-1 a - 4, sendo recentemente relatado o quinto sorotipo, DENV-5, na Malásia. Estes são transmitidos pela picada de mosquitos infectados do gênero Aedes, sendo o Aedes aegypti o principal vetor. Atualmente, a prevenção e controle da dengue dependem exclusivamente de medidas de combate ao vetor, e estas apresentam-se ineficientes, principalmente em países em desenvolvimento. Nesse contexto, há a necessidade da busca de novas estratégias que possam ser utilizadas concomitantemente com as formas de controle já existentes. A Wolbachia é uma bactéria intracelular, amplamente conhecida por promover o fenótipo de bloqueio do vírus dengue em mosquitos A. aegypti. Apesar disto, não se conhece se a Wolbachia é capaz de interferir na infecção da progênie de mosquitos infectados com o vírus dengue, fenômeno conhecido como transmissão vertical. A transmissão vertical pode estar associada com a manutenção do vírus em períodos interepidêmicos ou em locais nos quais a transmissão ativa está diminuída. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Wolbachia introduzida na linhagem brasileira de A. aegypti influencia a transmissão vertical da dengue. Duas metodologias de infecção foram utilizadas: infecção oral e nanoinjeção intratorácica, onde utilizou-se o DENV-4 e DENV-1,-3 e -4, respectivamente. Para estes experimentos, foram comparados mosquitos com Wolbachia (Mel) e uma linhagem de mosquitos tratada com antibiótico e portanto, livre da bactéria (Tet). Os ovos dos mosquitos infectados foram coletados em um período de 20 e 11 dias após a infecção, oral e injeções, respectivamente. A fecundidade e fertilidade, de forma geral, foram diminuídas na co-infecção da Wolbachia com o vírus dengue. Em todos os mosquitos infectados, não se observou diferenças na suscetibilidade ao vírus, porém a carga viral foi diminuída pela Wolbachia no DENV-4, em ambas as formas de infecção. Foi possível a detecção de pools positivos independente da forma de infecção, demonstrando que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu, porém a proporção de pools positivos entre os grupos Mel e Tet não foi alterada. Entretanto, pudemos observar uma diminuição da carga viral nos pools positivos Mel. Os ovários na infecção oral, interessantemente, tiveram uma forte diminuição da suscetibilidade conferida pela Wolbachia. A carga viral dos ovários foi diminuída em DENV-1 e DENV-4, em ambas as formas de infecção. Os dados obtidos nestes experimentos apontam que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu em pequenas taxas. Independente da forma de infecção utilizada, as taxas não variaram, mostrando que os mecanismos que regulam a ocorrência da transmissão vertical precisam ser explorados. Concluímos que, a Wolbachia pode potencialmente ser responsável pela redução da transmissão vertical em campo. Isto é considerado um grande avanço no controle da dengue, se realmente for comprovada que a transmissão vertical é a responsável pela manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos. / Dengue is a growing medical problem in subtropical and tropical countries. Dengue is a viral infection which is known four distinct serotypes, DENV-1 to -4, recently being reported the fifth serotype DENV-5 in Malaysia. These are transmitted by the bite of infected mosquitoes of the genus Aedes, being the main vector Aedes aegypti. Currently, prevention and control of dengue rely solely on anti-vector measures, and these have to be inefficient, especially in developing countries. In this context, there is the need to search for new strategies that can be used concurrently with the forms of existing control. Wolbachia is an intracellular bacterium The widely known for promoting the virus lock phenotype in dengue mosquitoes A. aegypti. Despite this, it is not known if the Wolbachia is able to interfere in the progeny of infected mosquitoes, known as vertical transmission. Vertical transmission may be associated with the maintenance of the virus in inter-epidemic periods or active sites that transmission is decreased. The objective of this study was to evaluate whether Wolbachia introduced in the Brazilian strain of A. aegypti influences the vertical transmission of dengue. Two methods were used for infection: Oral nanoinjeção intrathoracic infection and, where used DENV-4 and DENV-1, -3 and -4 respectively. For these experiments, mosquitoes were compared with Wolbachia (Mel) and a strain of mosquitoes treated with antibiotics and therefore free of bacteria (Tet). The eggs of infected mosquitoes were collected over a period of 20 and 11 days after infection, orally and injections, respectively. The fecundity and fertility, in general, were reduced in the co-infection of Wolbachia with the dengue virus. In all infected mosquitoes, no differences were observed in susceptibility to the virus, but the viral load was reduced by Wolbachia in DENV-4 in both forms of the infection. Independent positive pools of detection was possible the form of infection, demonstrating that vertical transmission of dengue virus occurred, but the proportion of positive pools between Mel and Tet group was unchanged. However, we observed a decrease in viral load in positive pools Mel. Ovaries in the oral infection, interestingly, had a strong decrease in susceptibility conferred by Wolbachia. The viral load in the ovaries was decreased DENV-1 and DENV-4 in both forms of the infection. The data from these experiments indicate that vertical transmission of dengue virus occurred in small fees. Independent of the infection used, the rates did not change, showing that the mechanisms that regulate the occurrence of vertical transmission need to be explored. We conclude that the Wolbachia could potentially be responsible for the reduction of vertical transmission in the field. This is considered a major breakthrough in dengue control, if it is really proven that vertical transmission is responsible for virus maintenance in inter-epidemic periods

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T13:44:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JéssicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T13:44:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JéssicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T13:44:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_JéssicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertacao_BCM_JessicaBarreto_CPqRR2015.pdf.txt: 6013 bytes, checksum: 3c416ed5aaca48410b85e3561489de45 (MD5) Dissertacao_BCM_JessicaBarreto_CPqRR2015.pdf: 29570632 bytes, checksum: 4474e8beef339803539f586d52e9b27d (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A bactéria Wolbachia pipientis tem sido investigada como nova estratégia de controle biológico que pode ser usada simultaneamente com as medidas de controle de vetores já existentes. O potencial desse endossimbionte para o controle de doenças transmitidas por vetores está na sua capacidade de induzir diversos efeitos no hospedeiro, dentre eles a capacidade de bloquear patógenos. Nos dias de hoje existem técnicas de transinfecção que permitem criar associações entre Wolbachia e hospedeiros que não abrigam a bactéria naturalmente. Estudos anteriores têm demonstrado que nesses casos o fenótipo de bloqueio é mais intenso em comparação àquele observado em mosquitos com infecção natural. As infecções nativas podem se atenuar depois de um processo de coevolução entre o hospedeiro e o endossimbionte, entretanto, sob condições específicas, possivelmente seja observada uma capacidade residual de interferência a patógenos. Uma dessas circunstâncias pode ser a carga parasitária adquirida pelo vetor em uma alimentação sanguínea. Diante do exposto, realizamos uma análise comparativa entre a capacidade de bloqueio em duas espécies de Aedes infectados com Wolbachia, o mosquito Aedes fluviatilis com a cepa natural wFlu, e o Aedes aegypti transinfectado com a cepa wMel. Mosquitos tratados com tetraciclina foram usadas como controle para cada espécie. Investigamos a capacidade de bloqueio para o Dengue vírus e para o modelo de malária aviária Plasmodium gallinaceum. Os mosquitos foram infectados diretamente em aves com curvas ascendentes de parasitemias ou via alimentação sanguínea artificial e os intestinos foram dissecados 7 dias após infecção para contagem de oocistos. Em outra série de experimentos vírus dengue sorotipo 3 foi adicionado a sangue humano para obter titulações que variaram de 106 a 103 PFU/mLe as cargas virais foram quantificadas aos 7 e 14 dias pós infecção sanguínea por RT-qPCR. Em contraste ao que foi observado para o P. gallinaceum, observamos diferentes respostas ao virus nas duas espécies de Aedes, a cepa wMel induziu forte interferencia a este patógeno enquanto que wFlu levou ao aumento da susceptibilidade no Ae. fluviatilis aos 7 dias pós infecção. Diante desses resultados investigamos a presença do vírus na saliva de Ae. fluviatilis. Mais uma vez foi observado aumento da susceptibilidade dos mosquitos da linhagem wFlu e detectamos a presença do virus em parte das salivas coletadas. Nossos dados sugerem que a cepa wMel não é eficiente no bloqueio do P. gallinaceum, o que indica que a capacidade de interferencia não é uma característica universal para os diferentes patógenos. Constatamos que a carga parasitária não é um fator que induz a capacidade de bloqueio em Ae fluviatilis, já que esse feito não foi observado em nenhuma das parasitemias testadas. Criticamente, demonstramos o potencial aumento da susceptibilidade de Ae. Fluviatilis ao vírus dengue em uma infecção nativa de Wolbachia. Nossos resultados destacaram que a análise da capacidade de bloqueio a patógenos em mosquitos ransinfectados com Wolbachia é complexa e que o estudo de espécies correlatas naturalmente infectadas por este ndossimbionte podem ajudar a esclarecer questões relacionadas com o fenótipo de bloqueio de infecção a patógenos. / Wolbachia pipientis has been investigated as a new biological control strategy that can be used simultaneously with current vector control methods. The potential of this endosymbiont for disease control is its ability to induce various effects on the host, including pathogen blocking. Nowadays there are transinfections techniques that allow to create associations in hosts that not harbor the bacteria naturally. Previous studies have shown that pathogen blocking is stronger in those cases compared to what observed in mosquitoes with a native infection. Natural infections may have attenuated following a long period of co-evolution between host and symbiont. However there may be a residual capacity for blocking in natural strains that could manifest under certain conditions, as according pathogen load acquired by the mosquito during a blood feeding. In this study we conducted a comparative analysis of the effect of pathogen load on the pathogen blocking in two different Wolbachia-infected mosquitoes; the wFlu strain in its natural host, Aedes fluviatilis, and the wMel strain transinfected in Aedes aegypti. Tetracycline treated, Wolbachia-uninfected mosquitoes served as a control line for each species. We looked at pathogen blocking against dengue virus and the model avian malaria parasite Plasmodium gallinaceum. Malaria infections were conducted either by feeding directly on an infected chicken, over several day throughout the course of P. gallinaceum infection, or by artificial feeding. Plasmodium oocyst numbers were counted at 7dpi. Neither mosquito species displayed consistent pathogen blocking, nor was there a change in the effect of either Wolbachia strain at lower pathogen loads. Dengue virus in cell culture was mixed with human blood to produce different final concentrations that ranged from 106 to 103 PFU/mL, virus levels were quantified at 7 and 14 days pos blood infection by RT-qPCR. In contrast to P. gallinaceum, we observed a differential response to DENV for the two species, with wMel producing a strong blocking effect when viral loads were sufficient for mosquitoes to become infected. On the other hand, wFlu appeared to increase susceptibility to DENV, as infection rates were higher than in Wolbachia-uninfected Ae. fluviatilis at 7dpi. Because of these results we investigated the vector competence of Ae. fluviatilis. We were able to detect the presence of the virus in a small portion of Ae. fluviatilis saliva. We again observed that wFlu enhanced susceptibility rates at the whole body level, however Wolbachia appeared to decrease the prevalence of virus in the saliva. Our data suggest firstly that wMel is effective at blocking P. gallinaceum, which indicates that pathogen blocking is not ubiquitous for all pathogens even among transinfections. Lower pathogen loads did not induce pathogen blocking in infected Ae. fluviatilis, which suggests that induction of the phenotype, is not dependent on the amount of pathogen ingested by the mosquito. Critically, we firstly demonstrated a potential pathogen enhancement effect for a native Wolbachia infection and dengue virus. However, the fact that wFlu appears to reduce DENV levels in saliva, may indeed be evidence that a latent pathogen blocking persists in this association.Overall, our results provide further evidence of the complexity of the pathogen blocking response, and highlight the insight that can be gained by studyi ng the phenotype in native strain.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T15:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel) foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente) e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco. Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados. Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo. / Wolbachia pipientis is an intracellular bacterium that infects about 40% of arthropods and some nematodes, causing reproductive alterations in their hosts. Recently, two strains of Wolbachia (wMelPop and wMel) were individually introduced into Aedes aegypti (naturally uninfected) and the adult mosquitoes containing Wolbachia were less susceptible to different arboviruses (Dengue and Chikungunya) and Plasmodium sp. Currently, A. aegypti mosquitoes containing Wolbachia (wMel) are being released in the field in many countries, through the Eliminate Dengue Program, as a possible biological control agent for Dengue. During the invasion of mosquitoes containing Wolbachia in the field there is the need to weekly screen large numbers of mosquitoes to detect Wolbachia via quantitative PCR, a technique still quite costly. Due to this fact, it is essential to develop a rapid, specific and inexpensive method to detect mosquitoes infected with this bacterium, to survey and monitor the spread of Wolbachia in the field. In the present study we successfully developed a rapid detection method through LAMP (loop-mediated isothermal amplification) using 3 pairs of primers that bind to 8 distinct regions of the target DNA, increasing the specificity of the reaction. In our case, we designed primers based on the sequence of the Wolbachia 16S rRNA gene. During the optimization process we used colony mosquitoes reared at the Insectary of the Malaria Laboratory (CPqRR), either infected or uninfected with Wolbachia. We also used field insect samples (mosquitoes and insects belonging to different orders). The incubation time allowing amplification was set to 90 minutes at 63oC, being possible to perform the reaction either in a thermocycler or on a heat block. For sensitivity analysis, we performed serial dilutions of plasmid DNA (109 to 100 copies) containing the target sequence and the amplification was still possible by using only one copy of the plasmid DNA. To verify the specificity, samples of different bacterial species were used and in none of them the amplification occurred, confirming that the LAMP is very specific. To reduce the reaction cost we were able to reduce the amount of the Bst DNA polymerase down to 1 unit and we can see clearly a great amplification. To visualize the results, two dyes were used, the Hydroxy Naphtol Blue (HNB) and SYBR Green I. In both cases it was possible to differentiate positive from negative samples without the need to run agarose gels. An advantage of using the HNB is that there is no need to manipulate amplified products as this dye is added before the reaction, avoiding possible contamination, and it is also possible to see the difference in color by naked eye without the need of UV light. When comparing the costs, in Brazilian Reais, to perform PCR or LAMP, the latter had a cost 53.92% lower than the PCR, and it does not require sophisticated equipment or electrophoresis agarose gel to analyze the results. In the present study, we develop a technique for Wolbachia detection which is very specific, rapid, sensitive and with low cost enabling its use in large-scale monitoring of Wolbachia infection status of several insect species.