Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T15:19:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T15:19:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_Daniela da Silva Gonçalves.pdf: 3089652 bytes, checksum: 385ead67db7f264f48369a8a80a7040e (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel) foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente) e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco. Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados. Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo. / Wolbachia pipientis is an intracellular bacterium that infects about 40% of arthropods and some nematodes, causing reproductive alterations in their hosts. Recently, two strains of Wolbachia (wMelPop and wMel) were individually introduced into Aedes aegypti (naturally uninfected) and the adult mosquitoes containing Wolbachia were less susceptible to different arboviruses (Dengue and Chikungunya) and Plasmodium sp. Currently, A. aegypti mosquitoes containing Wolbachia (wMel) are being released in the field in many countries, through the Eliminate Dengue Program, as a possible biological control agent for Dengue. During the invasion of mosquitoes containing Wolbachia in the field there is the need to weekly screen large numbers of mosquitoes to detect Wolbachia via quantitative PCR, a technique still quite costly. Due to this fact, it is essential to develop a rapid, specific and inexpensive method to detect mosquitoes infected with this bacterium, to survey and monitor the spread of Wolbachia in the field. In the present study we successfully developed a rapid detection method through LAMP (loop-mediated isothermal amplification) using 3 pairs of primers that bind to 8 distinct regions of the target DNA, increasing the specificity of the reaction. In our case, we designed primers based on the sequence of the Wolbachia 16S rRNA gene. During the optimization process we used colony mosquitoes reared at the Insectary of the Malaria Laboratory (CPqRR), either infected or uninfected with Wolbachia. We also used field insect samples (mosquitoes and insects belonging to different orders). The incubation time allowing amplification was set to 90 minutes at 63oC, being possible to perform the reaction either in a thermocycler or on a heat block. For sensitivity analysis, we performed serial dilutions of plasmid DNA (109 to 100 copies) containing the target sequence and the amplification was still possible by using only one copy of the plasmid DNA. To verify the specificity, samples of different bacterial species were used and in none of them the amplification occurred, confirming that the LAMP is very specific. To reduce the reaction cost we were able to reduce the amount of the Bst DNA polymerase down to 1 unit and we can see clearly a great amplification. To visualize the results, two dyes were used, the Hydroxy Naphtol Blue (HNB) and SYBR Green I. In both cases it was possible to differentiate positive from negative samples without the need to run agarose gels. An advantage of using the HNB is that there is no need to manipulate amplified products as this dye is added before the reaction, avoiding possible contamination, and it is also possible to see the difference in color by naked eye without the need of UV light. When comparing the costs, in Brazilian Reais, to perform PCR or LAMP, the latter had a cost 53.92% lower than the PCR, and it does not require sophisticated equipment or electrophoresis agarose gel to analyze the results. In the present study, we develop a technique for Wolbachia detection which is very specific, rapid, sensitive and with low cost enabling its use in large-scale monitoring of Wolbachia infection status of several insect species.