Submitted by Raquel Birbeire (ensinoicc@fiocruz.br) on 2016-02-12T14:03:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Castro Rodrigues Lucena (final).pdf: 3260035 bytes, checksum: d0b775f25026c251662a16fbc7b5d26d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Birbeire (ensinoicc@fiocruz.br) on 2016-02-15T17:26:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Castro Rodrigues Lucena (final).pdf: 3260035 bytes, checksum: d0b775f25026c251662a16fbc7b5d26d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T17:26:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Aline Castro Rodrigues Lucena (final).pdf: 3260035 bytes, checksum: d0b775f25026c251662a16fbc7b5d26d (MD5) Previous issue date: 2015 / Instituto Carlos Chagas / Durante a metaciclogênese in vitro, a forma epimastigota de Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, se diferencia em tripomastigota metacíclica após ser submetido a estresse nutricional em meio TAU, com isso, adquire a capacidade de infectar o hospedeiro vertebrado. Durante a diferenciação, os parasitas sofrem diversas adaptações que incluem a modulação de modificações pós-traducionais. Em um trabalho recente, nosso grupo delineou, sem quantificar, o perfil de fosforilação em T. cruzi durante a metaciclogênese. Neste trabalho, visando realizar a quantificação dos sítios de fosforilação, foi utilizada a metodologia SILAC, que marca proteínas durante o cultivo celular, através da incorporação de aminoácidos contendo isótopos pesados. Visando compreender a sinalização através de fosforilação que ocorre nos momentos iniciais de metaciclogênese, ou seja, durante o estresse nutricional, foram selecionados os pontos epimastigotas em crescimento exponencial (epimastigotas 3 dias, EPI-3D) e na fase estacionária (epimastigotas 5 dias – EPI-5D), bem como alguns pontos ao longo do estresse nutricional (5 e 15 minutos, 1 e 2 horas). Para cada ponto experimental, os peptídeos foram digeridos, fracionados por FR básica, então os fosfopeptídeos foram enriquecidos utilizando beads de TiO2, e analisados por LC-MS/MS. Foram identificados 5.405 grupos de proteínas, 1.679 grupos de fosfoproteínas, 3.893 grupos de sítios de fosforilação sendo 3049 em Serina, 786 em Treonina vii e, 58 em Tirosina, entre os quais cerca de 99% foram quantificados. As análises foram realizadas de duas formas: inicialmente comparando as diferentes fases de cultivo celular (exponencial e estacionária), e os diferentes pontos ao longo do estresse nutricional. Foram observadas diversas alterações no perfil de expressão das proteínas e modulação dos sítios de fosforilação, envolvidos em diversos processos como síntese de ácidos graxos, sinalização celular, locomoção, estresse oxidativo, processamento de RNA, entre outros. Projetos “ômicos”, assim como este, são importante para gerar listas com um número limitado de alvos para posterior caracterização. Nesse sentido, nós objetivamos caracterizar alguns dos elementos apontados visando elucidar o “gatilho” da metaciclogênese. / During metacyclogenesis in vitro, the epimastigote form of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, differentiates into metacyclic trypomastigote, after nutritional stress in TAU medium, and acquires capability to infect the vertebrate host. During differentiation, the parasites suffer several adaptations that include modulation of post-translational modulations. In a recent work, our group outlined, without quantifying, the protein phosphorylation profile of T. cruzi during metacyclogenesis. Here, in order to accomplish the quantification the phosphorylation sites, we applied the SILAC methodology, which labels proteins by incorporation of amino acids containing heavy isotopes, in culture. Aiming to understand the signaling that occurs through phosphorylation in the initial moments of metacyclogenesis, that is, during the nutritional stress, epimastigotes in exponential growth (Epimastigote 3 days, EPI-3D) and in the late log phase (Epimastigote 5 days, EPI-5D), as well as several points during the nutritional stress (5 and 15 minutes, 1 and 2 hours) were selected. For each experimental point, peptides were digested, fractionated by basic RP, then phosphopeptides were enriched with TiO2 beads, and analyzed by LC-MS/MS. In total, 5,405 proteins groups were identified, including 1,679 groups of phosphoproteins and 3,893 phosphorylation sites, being 3,049 in Serine, 786 in Threonine and, 58 in Tyrosine residues, among which around 99% were quantified. The analyzes were performed in two ways: first comparing the ix different stages of cell growth (exponential and stationary), and the different points along the nutritional stress. Several changes were observed in the expression profile of the proteins and modulation of the phosphorylation sites, involved in various processes such as fatty acid synthesis, cell signaling, mobility, oxidative stress, RNA processing, among others. Omics projects like this one are important to generate lists that have limited number of targets for further characterization. In this sense we aim to characterize some of the elements pinpointed to elucidate the trigger of metacyclogenesis.

Chagas disease, is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The available chemotherapy is restricted to two compounds: Nifurtimox and Benzonidazol. The T. cruzi life cycle occurs among invertebrate and vertebrate hosts and its survival strongly depends on its ability to catabolise both, carbohydrates and amino acids to obtain energy. The amino acids have an important role in several biological processes in this parasite. In this context, we studied the L-asparagine (Asn) relevance in the metabolism, differentiation and stress resistance of the T cruzi. Our results have shown that epimastigotes use Asn as carbon source, and contributes with the resistance to nutritional and oxidative stress. The Asn also showed a positive influence in metacyclogenesis and supported the ATP synthesis. Finally, the absence of Asn interfered with the proliferation of the replicative forms of T. cruzi. Taken together, our results suggest the involvement of the Asn metabolism in the protection of T. cruzi when submitted to different stress conditions. / Chagas disease, is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The available chemotherapy is restricted to two compounds: Nifurtimox and Benzonidazol. The T. cruzi life cycle occurs among invertebrate and vertebrate hosts and its survival strongly depends on its ability to catabolise both, carbohydrates and amino acids to obtain energy. The amino acids have an important role in several biological processes in this parasite. In this context, we studied the L-asparagine (Asn) relevance in the metabolism, differentiation and stress resistance of the T cruzi. Our results have shown that epimastigotes use Asn as carbon source, and contributes with the resistance to nutritional and oxidative stress. The Asn also showed a positive influence in metacyclogenesis and supported the ATP synthesis. Finally, the absence of Asn interfered with the proliferation of the replicative forms of T. cruzi. Taken together, our results suggest the involvement of the Asn metabolism in the protection of T. cruzi when submitted to different stress conditions.

Chagas disease, is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The available chemotherapy is restricted to two compounds: Nifurtimox and Benzonidazol. The T. cruzi life cycle occurs among invertebrate and vertebrate hosts and its survival strongly depends on its ability to catabolise both, carbohydrates and amino acids to obtain energy. The amino acids have an important role in several biological processes in this parasite. In this context, we studied the L-asparagine (Asn) relevance in the metabolism, differentiation and stress resistance of the T cruzi. Our results have shown that epimastigotes use Asn as carbon source, and contributes with the resistance to nutritional and oxidative stress. The Asn also showed a positive influence in metacyclogenesis and supported the ATP synthesis. Finally, the absence of Asn interfered with the proliferation of the replicative forms of T. cruzi. Taken together, our results suggest the involvement of the Asn metabolism in the protection of T. cruzi when submitted to different stress conditions. / Chagas disease, is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. The available chemotherapy is restricted to two compounds: Nifurtimox and Benzonidazol. The T. cruzi life cycle occurs among invertebrate and vertebrate hosts and its survival strongly depends on its ability to catabolise both, carbohydrates and amino acids to obtain energy. The amino acids have an important role in several biological processes in this parasite. In this context, we studied the L-asparagine (Asn) relevance in the metabolism, differentiation and stress resistance of the T cruzi. Our results have shown that epimastigotes use Asn as carbon source, and contributes with the resistance to nutritional and oxidative stress. The Asn also showed a positive influence in metacyclogenesis and supported the ATP synthesis. Finally, the absence of Asn interfered with the proliferation of the replicative forms of T. cruzi. Taken together, our results suggest the involvement of the Asn metabolism in the protection of T. cruzi when submitted to different stress conditions.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BrunaMEC_DISSERT.pdf: 1873830 bytes, checksum: 826b39ab376c52af03d9abc3c0b121dd (MD5) Previous issue date: 2010-12-21 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Global warming due to Greenhouse Gases (GHG) emissions, especially CO2, has been identified as one of the major problems of the twenty-first century, considering the consequences that could represent to planet. Currently, biological processes have been mentioned as a possible solution, especially CO2 biofixation due to association microalgae growth. This strategy has been emphasized as in addition to CO2 mitigation, occurs the production of biomass rich in compounds of high added value. The Microalgae show high photosynthetic capacity and growth rate higher than the superior plants, doubling its biomass in one day. Its culture does not show seasons, they grow in salt water and do not require irrigation, herbicides or pesticides. The lipid content of these microorganisms, depending on the species, may range from 10 to 70% of its dry weight, reaching 90% under certain culture conditions. Studies indicate that the most effective method to promote increased production of lipids in microalgae is to induce stress by limiting nitrogen content in the culture medium. These evidences justify research continuing the production of biofuels from microalgae. In this paper, it was studied the strategy of increasing the production of lipids in microalgae I. galbana with programmed nutritional stress, due to nitrogen limitation. The physiological responses of microalgae, grown in f / 2 with different concentrations of nitrogen (N: P 15,0-control, N: 5,0 P and N: P 2,5) were monitored. During exponential phase, results showed invariability in the studied conditions. However the cultures subjected to stress in stationary phase, showed lower biomass yields. There was an increase of 32,5% in carbohydrate content and 87.68% in lipids content at N: P ratio of 5,0 and an average decrease of 65% in protein content at N: P ratios of 5, 0 and 2.5. There were no significant variations in ash content, independently of cultivation and growth phase. Despite the limitation of biomass production in cultures with N: P smaller ratios, the increase of lipid accumulation highest lipids yields were observed as compared to the control culture. Given the increased concentration of lipids associated to stress, this study suggests the use of microalgae Isochrysis galbana as an alternative raw material for biofuel production / O aquecimento global decorrente da emiss?o dos gases geradores do Efeito Estufa (GEE), em especial o CO2, ? um dos problemas mais graves do s?culo XXI, tendo em vista as conseq??ncias que esse agravante pode trazer ao planeta. Atualmente, os processos biol?gicos v?m sendo apontados como uma poss?vel solu??o, principalmente a biofixa??o do CO2 por microalgas. Essa estrat?gia tem sido ressaltada, uma vez que, paralelamente a mitiga??o do CO2 ocorre ? produ??o de biomassa rica em compostos de alto valor econ?mico agregado. As microalgas possuem alta capacidade fotossint?tica e taxa de crescimento superior aos vegetais superiores, duplicam a sua biomassa em um dia. O seu cultivo n?o segue regime de safras, s?o cultivadas em meio salino simples e n?o exigem irriga??o, herbicidas ou pesticidas. O teor de lip?dios destes microrganismos, dependendo da esp?cie, varia de 1 a 70% do seu peso seco, podendo chegar a 90% em certas condi??es de cultivo. Estudos indicam que ? poss?vel aumentar a produ??o de lip?dios pelas microalgas atrav?s de estresses fisiol?gicos induzidos pela restri??o do nitrog?nio no meio de cultura. Essas evid?ncias justificam pesquisas envolvendo a produ??o de biocombust?veis a partir de microalgas. No presente trabalho, estudou-se a estrat?gia de aumentar a produ??o de lip?dios pela microalga I. galbana atrav?s de um estresse nutricional programado, ocasionado pela restrin??o do nitrog?nio. Foram acompanhadas as respostas fisiol?gicas desta esp?cie, cultivada em meio f/2 com diferentes concentra??es de nitrog?nio (raz?es m?ssica N:P 15,0-controle, N:P 5,0 e N:P 2,5). Durante a fase exponencial, as an?lises mostraram uma invariabilidade para os cultivos estudados. Por?m, na fase estacion?ria, os cultivos submetidos ao estresse, indicaram menores rendimentos em biomassa. Observou-se um amento de 32,5% nos n?veis de carboidratos e de 87,68% no teor de lip?deos na raz?o N:P 5,0 e uma redu??o m?dia de 65% de prote?na nas raz?es N:P 5,0 ou 2,5. N?o houve varia??es significativas no teor de cinzas, independente das condi??es de cultivo e fase de crescimento. Apesar da limita??o de biomassa, o aumento do ac?mulo de lip?dios pelas culturas estressadas, proporcionou maiores produtividades de lip?dios, conseq?entemente este estudo sugere a utiliza??o da microalga Isochrysis galbana como fonte alternativa para a produ??o de biocombust?vel

No contexto das mudanças climáticas, a sobrevivência e a produtividade das plantações de eucaliptos poderão ser afetadas. Assim, são necessárias pesquisas em nutrição florestal, como a avaliação do K e do Na e sua interação com a disponibilidade hídrica com o crescimento e propriedades do lenho de eucaliptos. Em experimento instalado, em 20 de junho de 2010 de tipo \"Split-plot\", foram avaliadas as árvores de Eucalyptus grandis submetidas a dois regimes hídricos (100% e 63%) e três tipos de fertilização (K, Na e controle). O diâmetro do tronco (cada 15 dias, com dendrômetros) e a altura total (cada 6 meses) das árvores foram mensurados no período do 40º ao 61º mês. A umidade do solo foi analisada semanalmente e a precipitação e temperatura diariamente. Foram analisadas as propriedades do lenho de 48 árvores, no 47º mês, por amostragem destrutiva, avaliando-se a sua densidade aparente, densidade básica, estrutura anatômica e proporção cerne/alburno. Os resultados mostraram que a precipitação influenciou significativamente o crescimento das árvores, seguindo-se a temperatura mínima e a umidade do solo. O K e o Na mostraram interação com a precipitação, (i) no período seco, com a redução do incremento do tronco das árvores com o Na e a sua paralisação com o K, (ii) no período chuvoso, com o aumento do incremento em diâmetro e altura do tronco, em relação ao controle. O Na em relação ao K resultou em menor crescimento das árvores de eucalipto. Com a exclusão de 37% da chuva houve efeito negativo nas árvores com K; no tratamento controle e com aplicação de Na a exclusão não mostrou efeito significativo até o 58º mês. Em relação à (i) densidade do lenho das árvores- ocorreu a sua diminuição com K e Na (menor com Na), e incremento com a menor disponibilidade hídrica; K não diminuiu a densidade sob maior disponibilidade hídrica; (ii) anatomia do lenho- observaram-se vasos de maior diâmetro e menor frequência com K e Na (maior com K); as fibras apresentaram variação significativa com Na (com fibras mais longas e largas com menor espessura da parede); a menor disponibilidade hídrica resultante da exclusão de 37% da chuva não afetou aos vasos e fibras; (iii) relação cerne/alburno- o K e Na promoveram a formação de maior proporção de cerne em relação às árvores do tratamento controle, sem influência significativa da exclusão parcial de chuva. Relações entre anatomia e densidade do lenho mostraram que mudanças nas dimensões das fibras foram acompanhadas de mudanças na densidade do lenho; e maior taxa de crescimento nem sempre se relaciona com a diminuição da densidade do lenho. Os resultados indicaram que a perda de características desejáveis na densidade, fibras e proporção de alburno, com a adição de K ou Na (principalmente Na) na adubação básica, são altamente compensados pela maior produção de lenho, no entanto em regiões mais áridas e com maior risco de seca prolongada, potássio e sódio podem agravar o déficit hídrico. / In the context of climate change, survival and productivity of eucalyptus plantations may be affected. Thus, research is needed on nutrition and forest ecophysiology, such as the evaluation of K and Na and their interaction with water availability on the growth and wood properties of eucalyptus. In a split-plot type, experiment installed on June 20, 2010 we evaluated Eucalyptus grandis trees submitted to two water regimes (100% and 63%) and three fertilizer supplies (K, Na and control). The stem diameter was measured every 15 days with dendrometers and total height, every 6 months in the period from 40th to 61st month. Soil moisture was analyzed weekly and precipitation and temperature daily. The wood properties of 48 trees were analyzed after 47 months, by destructive sampling, evaluating their apparent density, specific gravity, anatomical structure and heartwood/sapwood proportion. The results showed that precipitation significantly influenced the growth of the trees, followed by the minimum temperature and soil moisture. K and Na showed interaction with precipitation, (i) in the dry season, by reducing the growth of the tree trunks with Na and its stoppage with K, (ii) during the rainy season, with increasing growth in diameter and height of the trunk, compared with the control. The Na, as compared to K, resulted in lower growth of the eucalyptus trees. With the artificial exclusion of 37% of throughfall there was a negative effect on the growth of trees fertilized with K; but in the control and Na treatment the rainfall exclusion showed no significant effect until 58º month. In relation to (i) density of the wood of trees, there was a decrease in K and Na (lower with Na), and an increase with lower water availability; although the K did not reduce the density under higher water availability; (ii) wood anatomy- larger vessels with lower frequency were formed with K and Na supply (with higher K); the fibers showed significant variations with Na (longer and wider fibers with smaller wall thickness); and the lower water availability from the of 37% rainfall exclusion did not affect vessels and fibers; (iii) Heartwood/sapwood ratio; K and Na promoted the formation of larger proportion of heartwood in relation to the trees from the control treatment, and there was no significant influence of the partial rainfall exclusion. Relationships between anatomy and wood density showed that changes in fiber dimensions were accompanied by changes in the wood density; and the higher growth rate is not always associated with decreased wood density. The results indicate that the loss of desirable characteristics in density, fiber and proportion of sapwood, with the addition of K or Na (mainly Na) in the basic fertilization are highly compensated by the increased wood production, though in more arid regions with increased risk of prolonged drought, potassium and sodium can aggravate water deficit.

No contexto das mudanças climáticas, a sobrevivência e a produtividade das plantações de eucaliptos poderão ser afetadas. Assim, são necessárias pesquisas em nutrição florestal, como a avaliação do K e do Na e sua interação com a disponibilidade hídrica com o crescimento e propriedades do lenho de eucaliptos. Em experimento instalado, em 20 de junho de 2010 de tipo \"Split-plot\", foram avaliadas as árvores de Eucalyptus grandis submetidas a dois regimes hídricos (100% e 63%) e três tipos de fertilização (K, Na e controle). O diâmetro do tronco (cada 15 dias, com dendrômetros) e a altura total (cada 6 meses) das árvores foram mensurados no período do 40º ao 61º mês. A umidade do solo foi analisada semanalmente e a precipitação e temperatura diariamente. Foram analisadas as propriedades do lenho de 48 árvores, no 47º mês, por amostragem destrutiva, avaliando-se a sua densidade aparente, densidade básica, estrutura anatômica e proporção cerne/alburno. Os resultados mostraram que a precipitação influenciou significativamente o crescimento das árvores, seguindo-se a temperatura mínima e a umidade do solo. O K e o Na mostraram interação com a precipitação, (i) no período seco, com a redução do incremento do tronco das árvores com o Na e a sua paralisação com o K, (ii) no período chuvoso, com o aumento do incremento em diâmetro e altura do tronco, em relação ao controle. O Na em relação ao K resultou em menor crescimento das árvores de eucalipto. Com a exclusão de 37% da chuva houve efeito negativo nas árvores com K; no tratamento controle e com aplicação de Na a exclusão não mostrou efeito significativo até o 58º mês. Em relação à (i) densidade do lenho das árvores- ocorreu a sua diminuição com K e Na (menor com Na), e incremento com a menor disponibilidade hídrica; K não diminuiu a densidade sob maior disponibilidade hídrica; (ii) anatomia do lenho- observaram-se vasos de maior diâmetro e menor frequência com K e Na (maior com K); as fibras apresentaram variação significativa com Na (com fibras mais longas e largas com menor espessura da parede); a menor disponibilidade hídrica resultante da exclusão de 37% da chuva não afetou aos vasos e fibras; (iii) relação cerne/alburno- o K e Na promoveram a formação de maior proporção de cerne em relação às árvores do tratamento controle, sem influência significativa da exclusão parcial de chuva. Relações entre anatomia e densidade do lenho mostraram que mudanças nas dimensões das fibras foram acompanhadas de mudanças na densidade do lenho; e maior taxa de crescimento nem sempre se relaciona com a diminuição da densidade do lenho. Os resultados indicaram que a perda de características desejáveis na densidade, fibras e proporção de alburno, com a adição de K ou Na (principalmente Na) na adubação básica, são altamente compensados pela maior produção de lenho, no entanto em regiões mais áridas e com maior risco de seca prolongada, potássio e sódio podem agravar o déficit hídrico. / In the context of climate change, survival and productivity of eucalyptus plantations may be affected. Thus, research is needed on nutrition and forest ecophysiology, such as the evaluation of K and Na and their interaction with water availability on the growth and wood properties of eucalyptus. In a split-plot type, experiment installed on June 20, 2010 we evaluated Eucalyptus grandis trees submitted to two water regimes (100% and 63%) and three fertilizer supplies (K, Na and control). The stem diameter was measured every 15 days with dendrometers and total height, every 6 months in the period from 40th to 61st month. Soil moisture was analyzed weekly and precipitation and temperature daily. The wood properties of 48 trees were analyzed after 47 months, by destructive sampling, evaluating their apparent density, specific gravity, anatomical structure and heartwood/sapwood proportion. The results showed that precipitation significantly influenced the growth of the trees, followed by the minimum temperature and soil moisture. K and Na showed interaction with precipitation, (i) in the dry season, by reducing the growth of the tree trunks with Na and its stoppage with K, (ii) during the rainy season, with increasing growth in diameter and height of the trunk, compared with the control. The Na, as compared to K, resulted in lower growth of the eucalyptus trees. With the artificial exclusion of 37% of throughfall there was a negative effect on the growth of trees fertilized with K; but in the control and Na treatment the rainfall exclusion showed no significant effect until 58º month. In relation to (i) density of the wood of trees, there was a decrease in K and Na (lower with Na), and an increase with lower water availability; although the K did not reduce the density under higher water availability; (ii) wood anatomy- larger vessels with lower frequency were formed with K and Na supply (with higher K); the fibers showed significant variations with Na (longer and wider fibers with smaller wall thickness); and the lower water availability from the of 37% rainfall exclusion did not affect vessels and fibers; (iii) Heartwood/sapwood ratio; K and Na promoted the formation of larger proportion of heartwood in relation to the trees from the control treatment, and there was no significant influence of the partial rainfall exclusion. Relationships between anatomy and wood density showed that changes in fiber dimensions were accompanied by changes in the wood density; and the higher growth rate is not always associated with decreased wood density. The results indicate that the loss of desirable characteristics in density, fiber and proportion of sapwood, with the addition of K or Na (mainly Na) in the basic fertilization are highly compensated by the increased wood production, though in more arid regions with increased risk of prolonged drought, potassium and sodium can aggravate water deficit.