Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:44:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stroka_Alessandra_M.pdf: 5695207 bytes, checksum: 81505eb22e83ba5221b3adf2e6bb373a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Envenenamentos por serpentes das subfamílias Crotalinae e Viperinae são caracterizados por um complexo quadro fisiopatológico, em que a hemorragia é freqüentemente observada. Neste trabalho, purificamos e caracterizamos uma proteína hemorrágica (BlaH1) da peçonha de Bothrops lanceolatus. A hemorragina foi purificada utilizando-se uma combinação de Cromatografias de gel filtração, afinidade e interação hidrofóbica. Em SDS-PAGE, a enzima apresentou uma massa molecular estimada em 28 kDa, tanto na ausência quanto na presença de j3-mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A reação da BlaH1 com anticorpo foi confirmada pelos ensaios de imunobloting, ELlSA, imunoeletroforese e imunodifusão, onde o antisoro botrópico comercial foi capaz de reconhecer a proteína hemorrágica. BlaH1 possui atividade hemorrágica e caseinolítica. O uso do agente quelante EDTA inibiu as atividades hemorrágica e caseinolítica, sugerindo que a hemorragina é uma metaloproteinase. O pH ótimo da enzima foi de 8,0 e a temperatura ótima entre 30-40°C. Esses resultados mostram que a hemorragina isolada da peçonha de B. lanceolatus apresenta propriedades semelhantes a outras hemorraginas isoladas de peçonhas ofídicas / Abstract: Bothrops snake venoms contain metalloproteinases that contribute to the local effects seen after envenoming. In this work, a hemorrhagic metalloproteinase (BlaH1) was purified from the venom of the snake Bothrops lanceolatus by a combination of gel filtration, affinity (metal chelating) and hydrophobic interaction chromatographies. The hemorrhagin was homogeneous by SDS-PAGE and had a molecular mass of 28 kDa that was unaltered by treatment with beta-mercaptoethanol. BlaH1 gave a single band in immunodiffusion, immunoelectrophoresis and immunoblotting using commercial bothropic antivenom. This reactivity was confirmed by ELlSA. BlaH1 had hemorrhagic, caseinolytic, fibrinogenolytic, collagenolytic and elastinolytic activities, but no phospholipase A2 activity. The hemorrhagic and caseinolytic activities were inhibited by EDTA, indicating that they were metal ion-dependent. In contrast, aprotinin, benzamidine and PMSF did not affect these activities. The caseinolytic activity of BlaH1 had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution at up to 40°C; activity was completely lost at >70°C. The hemorrhagic activity was neutralized by commercial bothropic antivenom. These properties suggest that this new hemorrhagin belongs to class P-I snake venom metalloproteinases / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T18:40:23Z No. of bitstreams: 1 2012_AdriadoPradoBarros.pdf: 2931377 bytes, checksum: d29320500f488b7799b05805fcfa4046 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-20T14:23:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AdriadoPradoBarros.pdf: 2931377 bytes, checksum: d29320500f488b7799b05805fcfa4046 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T14:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AdriadoPradoBarros.pdf: 2931377 bytes, checksum: d29320500f488b7799b05805fcfa4046 (MD5) / O processo de envelhecimento da pele em humanos é um mecanismo bastante complexo, uma vez que além dos efeitos do envelhecimento cronológico a pele também sofre os efeitos do envelhecimento extrínseco. De modo geral, as modificações ocorrem parcialmente como resultado do acúmulo de danos endógenos resultados da formação contínua de espécies reativas de oxigênio. O estrato córneo permanece relativamente inalterado, mas a epiderme e a derme sofrem um achatamento das junções dermo-epidérmicas, uma redução na capacidade proliferativa e biossintética das células, que resulta em uma diminuição da produção de matriz dérmica, um aumento da expressão das metaloproteinases de matriz (MMP), e um consequente adelgaçamento do tecido cutâneo, redução da vascularização, redução da expressão de colágeno tipo I e desaparecimento progressivo do tecido elástico na derme papilar. A L-arginina é o substrato da síntese de óxido nítrico e está envolvida na angiogênese e na proliferação celular. Ao mesmo tempo, a L-arginina é precursora indireta da síntese de colágeno, por ser utilizada na síntese de prolina, componente da fibra de pró-colágeno. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência de diferentes concentrações da L-arginina na elasticidade da pele de camundongos, através da avaliação da força tênsil suportada pela pele, avaliação histológica e imuno-histoquímica, determinação do grau de lipofilia da L-arginina, ensaio de retenção, penetração e permeação cutânea e da atividade proteolítica das MMPs por eletroforese em gel de poliacrilamida, com o intuito de avaliar a possibilidade de usá-la como ativo cosmético em produtos antienvelhecimento. Os resultados obtidos sugerem que a aplicação de L-arginina melhora a resistência da pele à força de tração para camundongos do grupo de fêmeas idosas e promove a formação de uma maior quantidade de fibras colágenas e elásticas na pele quando aplicada na concentração de 15%. Nos grupos de animais idosos, machos ou fêmeas, tratados com L-arginina foi observada também uma diminuição da atividade proteolítica das MMPs. Estudos posteriores devem ser realizados para melhor elucidar o mecanismo da melhora da elasticidade da pele pela aplicação de L-arginina. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Skin, just like any other organ of the human body, suffers the effects of chronological aging and, unlike the others, also suffers the effects of extrinsic aging. The process of aging skin in humans is a quite complex mechanism that begins to be understood. Overall, the changes occur partly as a result of the accumulation of endogenous injuries resulting from the continuing formation of reactive oxygen species generated by cellular oxidative metabolism. The stratum corneum remains relatively unchanged, but the epidermis and dermis undergo a flattening of the dermal-epidermal junction, reduction in the proliferative and biosynthetic ability of cells, which results in a decrease in the dermal matrix production, increased expression of matrix metalloproteinases (MMP), with a consequent skin thinning, reduced vascularization, decreased collagen type I expression and progressive decrease of elastic tissue in the papillar dermis. The loss of elastic fibers integrity is associated with progressive reduction of skin elasticity. L-arginine is the substrate of nitric oxide synthesis and is thus indirectly involved in many important regulatory mechanisms, such as angiogenesis and cell proliferation. At the same time, L-arginine is an indirect precursor of collagen synthesis because of its use in proline synthesis, a component of procollagen. The aim of this study was to evaluate the influence of different concentrations of L-arginine in mice skin elasticity in order to evaluate the possibility of using it as a cosmetic ingredient in anti-aging products. For that, the tensile strength supported by the skin, histological and immunohistochemical analysis, the L-arginine lipophilicity, retention, penetration and permeation tests and proteolytic activity of MMPs in polyacrylamide gel were evaluated. The results suggested that the application of L-arginine improves the skin resistance to traction force in female elder mice and L-arginine promotes the formation of a higher amount of collagen and elastic fibers in the skin when applied at a concentration of 15%. In groups of aged animals, males or females, treated with L-arginine it was also observed a decrease in proteolytic activity of MMPs. Further studies should be performed to further elucidate the mechanism of the skin elasticity improvement by application of L-arginine.

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-γ, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF-α IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-γ, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT; BIOSONDA; FUCITED

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade UnB Planaltina, Programa de Pós-Graduação em Meio Ambiente e Desenvolvimento Rural, 2015. / Submitted by Andrielle Gomes (andriellemacedo@bce.unb.br) on 2015-07-06T16:43:59Z No. of bitstreams: 1 2015_WllyaneSilvaFigueiredo.pdf: 2053770 bytes, checksum: c133bab9f3182d8a328289c19a7a3dc0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-08-03T14:36:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_WllyaneSilvaFigueiredo.pdf: 2053770 bytes, checksum: c133bab9f3182d8a328289c19a7a3dc0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-03T14:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_WllyaneSilvaFigueiredo.pdf: 2053770 bytes, checksum: c133bab9f3182d8a328289c19a7a3dc0 (MD5) / A mensuração de contaminantes no ambiente não traz respostas completas sobre os reais efeitos adversos que estas substâncias podem estar causando aos organismos. A identificação de biomarcadores relacionados ao mapeamento e expressão de metaloproteínas associadas a contaminantes poderão auxiliar na elucidação da dinâmica de vários elementos no ambiente, indicar previamente possíveis riscos de contaminação dos recursos ambientais e ser base para elaboração de mecanismos de neutralização dos seus efeitos. Dessa forma, este estudo buscou a identificação de possíveis biomarcadores de exposição ao mercúrio em tucunarés do rio Negro através de métodos metaloproteômicos. Inicialmente, foram determinadas as concentrações de mercúrio total no tecido muscular de tucunarés capturados em rios e reservatórios hidrelétricos. As concentrações apresentaram pouca variação independente do local de amostragem e algumas estavam superiores aos limites máximos definidos na legislação brasileira. As concentrações aumentaram na sequência: reservatório de Cana Brava < reservatório de Balbina < rio Madeira < rio Purus < reservatório de Tucuruí < rio Apuaú < rio Solimões < rio Negro. As amostras do rio Negro foram selecionadas para definição de um biomarcador proteico através da eletroforese bidimensional (2D-PAGE). O mercúrio foi determinado em 15 possíveis proteínas com massa molar abaixo de 20,1 kDa, sendo 2 mais promissoras à biomarcadoras. Além disso, foi extraído da musculatura dos tucunarés apenas 12,4% do mercúrio, sendo que 89% desse mercúrio foi aplicado na técnica 2D-PAGE, resultando em 49,74% de mercúrio nas proteínas. Essa porcentagem de mercúrio nos spots indica que os procedimentos otimizados de preparação da amostra foram eficientes para ser aplicados na 2D-PAGE. Os resultados metaloproteômicos desse estudo são importantes no subsídio de estudos futuros de identificação e caracterização de biomarcadores de mercúrio em peixes. / The measurement of contaminants does not bring complete answers about the real effects that these substances may be causing the organisms. The identification of biomarkers related to mapping and metalloproteins expression associated with contaminants may help to elucidate the dynamics of various elements in the environment indicates previously possible contamination risks of environmental resources and be a basis for development of neutralizing mechanisms of its effects. Thus, this study sought to identify possible mercury exposure biomarkers in tucunares the Negro river through metalproteomics methods. Initially, were determined the total mercury concentrations in muscle tissue of tucunares caught in rivers and hydroelectric reservoirs. They were in a little independent variation of the sampling site and some were above the maximum limits set by Brazilian law. The concentrations increased following: Cana Brava reservoir < Balbina reservoir < Madeira river < Purus river < Tucurui reservoir < Apuau river < Solimões river < Negro river. Samples of the Negro river were selected for definition of a protein biomarker by two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE). Mercury was determined in 15 possible protein with molecular weight of 20.1 kDa below, 2 the most promising biomarkers. Moreover, it was extracted from the muscle of tucunarés only 12.4% of mercury, with 89% of mercury was applied to the 2D-PAGE technique, and 49.74% of mercury in proteins. This percentage of mercury in spots indicates that the sample preparation procedures were optimized for efficient be applied to 2D-PAGE. The metalproteomics results of this study are important in the allowance for futures studies of identification and characterization of mercury biomarkers in fish. / La medición de los contaminantes no trae respuestas completas sobre los efectos reales que estas sustancias pueden estar causando los organismos. La identificación de biomarcadores relacionados con la cartografía y metalloproteins expresión asociada a contaminantes puede ayudar a dilucidar la dinámica de los diversos elementos en el ambiente indica anteriormente posibles riesgos de contaminación de los recursos ambientales y ser una base para el desarrollo de mecanismos de neutralización de sus efectos. Por lo tanto, este estudio trata de identificar posibles biomarcadores de exposición a mercurio en tucunarés el Río Negro a través metaloproteômicos métodos. Inicialmente, se determinó las concentraciones de mercurio total en el tejido muscular de tucunarés capturados en los ríos y embalses hidroeléctricos. Estaban en una pequeña variación independiente del sitio de muestreo y algunos estaban por encima de los límites máximos establecidos por la legislación brasileña. Las concentraciones aumentaron siguiente: Cana Brava embalses < Balbina embalses < río Madeira < río Purus < Tucuruí embalses < río Apuaú < río Solimões < río Negro. Las muestras del río Negro fueron seleccionados para la definición de un biomarcador de proteínas mediante electroforesis bidimensional (2D-PAGE). Mercurio se determinó en 15 posible proteína con peso molecular de 20,1 kDa abajo, 2 los biomarcadores más prometedores. Por otra parte, se extrajo desde el músculo de tucunarés sólo 12,4% de mercurio, con 89% de mercurio se aplicó a la técnica 2D-PAGE, y 49,74% de mercurio en proteínas. Este porcentaje de mercurio en puntos indica que los procedimientos de preparación de muestras se optimizaron para una eficiente aplicarse a 2D-PAGE. Los metaloproteômicos resultados de este estudio son importantes en la provisión para futuros estudios de identificación y caracterización de biomarcadores de mercurio en el pescado.

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T03:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColetta_Ricardo_M.pdf: 1863333 bytes, checksum: 44c85001fc634c2cd4363b8f4868e6bc (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A participação das metaloproteinases durante o desenvolvimento dental ainda não está bem estabelecida. Neste trabalho foram realizados estudos no intuito de caracterizar e detenninar o sítio principal de atuação dos grupos de metaloproteinases associadas ao germe dental' do primeiro molar em desenvolvimento. Verificou-se a presença de enznnas gelatinolíticas e caseinolíticas com comportamento, quanto à ação de inibidores específicos, ação colagenolítica e peso molecular, semelhante ao das enzimas pertencentes. ao grupo das metaloproteinases. A análise nos diversos períodos do desenvolvimento do germe dental mostrou que a maturação dental é acompanhada por um aumento na secreção dessas proteinases. Quando analisado o sítio de atuação dessas metaloproteinases, observou-se maior ação gelatinolítica na. papila dental quando comparado com o órgão do esmalte. A ação caseinolítica foi maior no órgão do esmalte. Estes resultados indicam que enzimas pertencentes ao grupo das metaloproteinases estão associadas ao desenvolvimento e crescimento do órgão dental. A presença de caseínases, principalmente no órgão do esmalte, pode estar relacionada ao processo de mineralização dental / Abstract: The participation of metalloproteinases during the tooth development is not well established. This work was performed in order to determine and characterize the expression of metalloproteinases during the rat first molar development. Gelatinolytic and caseinolytic activities were analyzed by zymography on polyacrylamide gels containing one of the substracts. The maturation of the rat first molar was accompanied by changes in the expression of metalloproteinases. Gelatinolytic activity increased progressively from day O to 15, while caseinolytic activity increased rapidly from day 3 to 10, decreasing on day 15. Mechanical separation of compartments of tooth genn showed that caseinolytic activity was restricted, mainly in the enamel organ whi1e gelatinolytic activity was localized mainly in the papillae. All the enzymes detected were inhibited by 1,10phenanthroline, which is a specific inhibitor for metalloproteinases. These data suggest that matrix metalloproteinases pIay an important role in the developmtmt and maturation of tooth germ / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Ciências

Orientadores: Ricardo Della Coletta, Oslei Paes de Almeida / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:59:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cotrim_AnaPaolaPereira_D.pdf: 2298011 bytes, checksum: b5d485c2128e23b4bc9cda2e3a245b02 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Ciclosporina A é a principal droga imunossupressora utilizada na prevenção da rejeição de transplantes. Esta droga induz inúmeros efeitos colaterais, incluindo o aumento gengiva I observado em 8 a 70% dos pacientes em tratamento com a droga. Embora a patogênese dos aumentos gengivais seja desconhecida, recentemente foi demonstrado que ciclosporina A induz a expressão do fator de crescimento transformante-betal (TGF-Bl). O objetivo deste trabalho foi investigar o papel de TGF-Bl na patogênese do aumento gengiva I induzido por ciclosporina A, explorando um possivel efeito autócrino deste fator na proliferação celular e na expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs). Para determinar o efeito de ciclosporina A na expressão e produção de TGF-Bl, culturas primárias de fibroblastos gengivais humanos normais foram tratadas com concentrações crescentes de ciclorporina A por 24 h, e os níveis de expressão e produção de TGF- (beta) 1 analizados por pelo método sem i-quantitativo da transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e EUSA, respectivamente. Os efeitos de ciclorporina A e TGF - (beta)1 na proliferação de fibroblastos gengivais foram analisados através de 4 ensaios de proliferação celular, incluindo ensaio de crescimento celular, análise da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), quantificação da expressão imunohistoquímica do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e potencial mitótico. O efeito de ciclosporina A na expressão de MMP-l, MMP-2, TIMP-l e TIMP-2 foram determinados por RTPCR. Para determinar o efeito autócrino de TGF-Bl na proliferação celular e na expressão de MMPs e TIMPs, nós utilizamos oligonucleotides complementares a região de iniciação da tradução de TGF-Bl. Ciclosporina A, em níveis similares aos encontrados no sangue de pacientes em uso da droga, significantemente estimulou a expressão de produção de TGF-Bl. De uma maneira similar, ciclosporina A estimulou a proliferação celular e inibiu a expresao de MMP-l e MMP-2 por fibroblastos gengivais. Os níveis de TIMP-l e TIMP-2 foram inalterados pelo tratamento com ciclorporina A. O tratamento com ciclosporina A em combinação com o bloqueio na produção de TGF-(beta)1 por oligonucleotideos complementares reduziu os efeitos de ciclosporina A na proliferação celular e na expressão de MMP-l e MMP-2 por fibroblastos gengivais. Nossos resultados demonstram que ciclosporina A induz a expressão TGF-(beta)1 em fibroblastos gengivais, o qual de uma maneira autocrina exacerba a proliferação e reduz a expressão de MMPs em fibroblastos gengivais normais / Abstract: Cyclosporin A (CyA) is a widely used immunosuppressant which possesses significant side effects including gingival overgrowth. The pathogenesis of this condition is not ful/y understood. However, recent studies showed that CyA regulates the transcription of several cytokines including transforming growth fador-betal (TGF-(beta)l). The aim of this study was to analyze the potential role of TGF-Bl in the pathogenesis of CyA-induced gingival overgrowth. We hypothesize that TGF-(beta)1 is an important autocrine regulator of cel/ proliferation, synthesis of matrix metal/oproteinases (MMPs) and its tissue inhibitors TIMPS in the experimental settings of CyA induced gingivalovergrowth. To test these hypothesis gingival fibroblasts (GF) from normal gingival were incubated with increasing concentrations of CyA and the expression and production of TGF-Bl determined by RT-PCR and ELISA. Proliferative activity of CyA-treated GF was studied by growth curve (via cel/ counting), BrdU incorporation, quantification of PCNA and mitotic potential. MMPs expression levels were analyzed by RT-PCR. To determine the effects of TGF-Bl on the proliferation rate and on the expression of MMPs by GF under CyA treatment, the cells were incubated with CyA and antisense oligonucleotides (AON) against the TGF-Bl mRNA. CyA simultaneously stimulated TGF-Bl expression, increased proliferation and inhibited expression of MMP-l and MMP-2 with a slight effect on TIMP-l and TIMP-2 expressions. Both CyA and TGF-(beta)1 stimulated significantly the proliferation of GF in a dose-dependent manner. When TGF-Bl was inhibited using specific antisense oligonucleotides (AON) a reduced TGF(beta)1 production was noticed (demonstrated by EUSA) with no signifjcant effect on the mRNA levels. When cells were treated with AON simultaneously with CyA, the effects of CyA on proliferation and expression of MMPs were neutralized, the original proliferation rate and MMPs expression were restored. Our investigation of the molecular events that lead to CyA-induced gingival overgrowth showed that TGF-Bl in an autocrine fashion upregulates proliferation and downregulates expression of MMPs, which may underlie the clinical changes associated with CyA treatment / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF- IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT 1151337; BIOSONDA; FUCITED

Orientador: Marco Aurelio Zezzi Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T09:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_JerusaSimone_D.pdf: 2794112 bytes, checksum: 68557f9b9cfbc996644d2a33b82031bc (MD5) Previous issue date: 2006 / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Orientador: Sergio R. Peres Line / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T06:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaia_AlexandreAugusto_D.pdf: 2456850 bytes, checksum: d1b3ef837bc68e43f27ecb9248a2d266 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Atrofia obstrutiva de glândulas salivares é uma alteração comum que pode ser causada pela presença de cálculos, infecções ou processos neoplásicos. No presente estudo utilizamos microscopia eletrônica de transmissão e métodos bioquímicos para estudar alterações que ocorrem na matriz extracelular durante atrofia experimental de glândulas submandibulares de ratos. Estudos imunohistoquímicos da laminina e do colágeno IV mostraram distribuição irregular dessas proteínas ao redor das estruturas ductais e acinares atróficas. Análise em "Western blot" mostrou que glândulas submandibulares de ratos expressam laminina contendo apenas cadeias S, enquanto a cadeia A é presente em pequena quantidade. Isso foi observado tanto em glândulas normais como atróficas. Investigação da expressão da colagenase fibroblástica (MMP-1) por técnica zimográfica mostrou altos níveis desta enzima após 5 dias de atrofia. Com a evolução da atrofia, a atividade gelatinolítica regrediu gradativamente até 30 dias de atrofia. Microscopia eletrônica mostrou extensivas alterações morfológicas nas células glandulares. Células mioepiteliais de glândulas atróficas mostraram áreas com espessamento da membrana basal. A atrofia experimental de glândulas salivares pode ser usada como modelo in vivo para estudar eventos moleculares que ocorrem durante remodelação da matriz extracelular / Abstract: Obstructive atrophy of salivary glands is a common disease. It may occur by ductal obstruction caused by calculus, infection or neoplastic processes. In the present work we have used electron microscopy and biochemical methods to study the changes that occur in the expression laminin, type IV collagen and metaloproteinases during the experimental atrophy of the submandibular gland in rats. Immunohistochemical studies of laminin and type IV collagen showed an irregular distribution of there proteins around atrophies ducts and acini. The composition of laminin chains was not altered during glandular atrophy. Western blot analysis showed that rat submandibular gland laminin contain B chains, while A chain seems to be present only in small amounts. Investigation of the expression of fibroblast collagenase (MMP1), by zimographic analysis showed. high levels of this enzyme after 5, days of ligation. Gelatinolytic activity decrease progressively until 30 days of atrophy. Electron microscopy showed extensive morphologic changes in glandular cells. Myoepithelial cells showed "wrinkling" of outer plasma membrane leading to a thickening of the associated basement membrane. We conclude that the atrophy of salivary gland is an useful in vivo model to study the molecular events that take part in the remodeling of the extracellular matrix / Doutorado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Doutor em Odontologia

Orientador: Edgard Graner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-27T09:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_HannahCarmemCarlosRibeiro_D.pdf: 2966581 bytes, checksum: 18a22acf8512cc1abc03572e8071674e (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: A Ciclosporina A (CSA) é uma droga imunossupressora, que atua de forma específica e reversível, principalmente em linfócitos T CD4. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito da CSA sobre a produção e atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas ao processo de reparação alveolar de molares de ratos Wistar, através de análise zimográfica. Foram utilizados 30 ratos tratados diariamente com CSA na concentração de 10 mg/kg de peso corporal por via subcutânea, com o início do tratamento ocorrendo 7 dias antes das exodontias e permanecendo após as cirurgias por períodos de 1 a 10 dias, quando os grupos foram sacrificados. Como grupo controle foram utilizados 30 ratos aplicados com solução salina a 0,9%. Verificou-se a presença de enzimas gelatinolíticas com comportamento, frente a ação de inibidores específicos e massa molecular semelhantes às das enzimas pertencentes ao grupo das MMPs. A análise nos diversos períodos de reparação alveolar demonstrou que este processo é acompanhado por secreção e atividade gelatinolítica, principalmente de MMP-9 e MMP-2. A produção e atividade gelatinolítica total e das MMP-9 e MMP-2 dos meios de cultura condicionados com o tecido de granulação dos alvéolos dos ratos foi menor nos animais tratados com CSA do que no grupo controle. Estes resultados indicam que a CSA reduz a produção e atividade de enzimas pertencentes ao grupo das MMPs, que participam no processo de reparo alveolar / Abstract: Cyclosporin A (CSA) is a potent immunosuppressive agent which acts in a specific and reversible way, mainly in T CD4 Iymphocytes. The aim of this study was to investigate the production and activity of matrix metalloproteinases (MMPs) through zymography during alveolar wound healing of inferior molars of Wistar's rats treated with CSA. Thirty Wistar rats where daily injected subcutaneously with 10 mg/kg/body weight of CSA starting seven days before the extraction and continuing from 1 to 10 days after surgery. The same numbers of rats were injected with the same volume of saline solution as a control group. Specific inhibitors were used to identify MMPs enzymes group. The data obtained from different healing periods, showed secretion and gelatinolytic activity, mainly by MMP-9 and MMP-2. The total gelatinolytic activity of MMP-9 and MMP-2 of the cell culture medium incubated with granulation tissue from the healing area, were lower in the CSA group than in the control group. The results showed that CSA use reduced the MMPs enzyme activity, which may have an important role in the alveolar wound healing process / Doutorado / Doutor em Biologia e Patologia Buco-Dental