Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al título de Bioquímico / Las hemocianinas son metaloglicoproteínas de elevado tamaño presentes en la hemolinfa de algunos moluscos, cuya función principal es el transporte de oxígeno. La hemocianina más estudiada se obtiene de la Lapa Californiana, Megathura crenulata y se conoce como KLH, presentando notorias capacidades inmunomoduladoras, por lo que ha sido utilizada con múltiples fines terapéuticos y de investigación. Sin embargo, las recientemente descubiertas hemocianinas del Loco, Concholepas concholepas, (CCH) y de la Lapa Negra, Fissurella latimarginata, (FLH), han cobrado relevancia, dadas sus mejores propiedades en cuanto a estabilidad y efectos inmunoestimulantes, respectivamente. No obstante, los mecanismos inmunológicos mediante los cuales estas proteínas ejercen sus diversas acciones son poco conocidos. Así, un factor frecuentemente mencionado es su alto contenido de carbohidratos (hasta 9% en peso), con diferencias en su composición entre las especies mencionadas. Interesantemente, se ha descrito en individuos no inmunizados de varias especies, incluyendo los seres humanos, la presencia de anticuerpos naturales reactivos con KLH que estarían dirigidos contra sus carbohidratos, hecho que lleva a considerar como otro factor posible al sistema del complemento. El sistema del complemento es un conjunto de proteínas plasmáticas y de membrana cuya activación, finamente regulada se lleva a cabo en una secuencia de eventos proteolíticos limitados sobre los componentes iniciales. Culmina con la lisis del patógeno mediante la formación de complejos de ataque de membrana. Además, conduce a la opsonización del patógeno y a la coestimulación de linfocitos B, junto con la producción de anafilotoxinas con propiedades inflamatorias, que favorecen la respuesta inmune. Este sistema puede ser activado por la vía clásica, mediante anticuerpos que reconocen al agresor; la vía de las lectinas, mediante diversos carbohidratos presentes en el células agresoras, y la vía alterna, en que el sistema detecta ausencia de moléculas “propias”. En vista de estos antecedentes, proponemos que la presencia, en individuos no inmunizados, de anticuerpos naturales que reconocen a las hemocianinas, conduce a la activación de la vía clásica del sistema del complemento humano por dichas proteínas. Así, el objetivo general de esta tesis ha sido estudiar un rol del complemento que contribuya a explicar la capacidad inmunoestimulante no específica de las hemocianinas en mamíferos. En primera instancia, se analizaron los sueros de 4 pacientes inmunizados con KLH, identificándose dos pacientes con altos niveles de anticuerpos anti-KLH, los cuales se utilizaron como controles positivos para la detección de anticuerpos en donantes no inmunizados con hemocianinas. Así, se detectó en una muestra de 5 donantes, diferentes niveles de anticuerpos no sólo contra KLH, sino que también contra FLH y CCH. Luego, para analizar la especificidad de estos anticuerpos, se realizó una desglicosilación química de las hemocianinas y se observó si esto afectaba la unión de estos anticuerpos, encontrándose que este tratamiento afectó de forma diferencial su reactividad. Específicamente, en algunos casos la desglicosilación disminuyó la unión de los anticuerpos, en otros casos no tuvo efecto y en otros incluso aumentó. Posteriormente, se procedió a analizar la capacidad de algunos sueros para activar la vía clásica del sistema del complemento in vitro, fenómeno que ocurrió con todas las hemocianinas, aunque no se pudo establecer una correlación entre el nivel de anticuerpos y la intensidad de la activación. Además, en concordancia con lo observado anteriormente, la desglicosilación de las hemocianinas tuvo un efecto diferencial en la activación de esta vía, destacándose el efecto sobre FLH, en la cual la desglicosilación aumentó fuertemente tanto la unión de anticuerpos como la activación de la vía clásica. En concordancia con estos resultados, cuando se utilizó un anticuerpo anti-C1q que inhibe específicamente la activación de la vía clásica, esta activación fue revertida. En conjunto, estos resultados apuntan a un nuevo rol para el sistema del complemento, específicamente a través de la vía clásica, con respecto a las notables propiedades inmunomoduladoras no específicas de las hemocianinas de moluscos en mamíferos. Si bien no se pudo definir un rol preponderante para los carbohidratos en todas las hemocianinas, los resultados señalan la necesidad de continuar con esta línea de investigación, para proveer información adicional para un uso seguro de las hemocianinas en biomedicina / Hemocyanins are metalloglycoproteins with large molecular sizes present in the hemolymph of some mollusks, with oxygen transport being their main function. The most studied hemocyanin is obtained from the keyhole limpet, Megathura crenulata and it is known as KLH, with remarkable immunomodulatory capacities, leading to its use in multiple therapeutical and research approaches uses. However, the recently discovered hemocyanins of the Chilean abalone, or “Loco”, Concholepas concholepas (CCH), and that from “Lapa negra”, Fissurella latimarginata, (FLH), have become relevant, given their better properties regarding stability and immunomodulatory effects, respectively. In spite of this, the mechanisms through which these molecules exert their effects are scarcely understood. A frequent explanation is their high carbohydrate content (up to 9% w/w), with differences between their compositions among the mentioned species. Interestingly, in unimmunized individuals from different species, humans included, it has been described the presence of natural antibodies reactive with KLH, possibly through its carbohydrate moieties, leading to the possibility that the complement system is also involved. The complement system is a group of plasma and membrane-bound proteins whose finely regulated activation is carried out in a sequence of limited proteolytic events, involving mainly the initial components. It culminates with the pathogen lysis through formation of membrane attack complexes. It also leads to pathogen opsonization and B cell costimulation, along with the production of anaphylatoxins with inflammatory properties, thus favoring the immune response. This system can be activated through the classical pathway, due to antibodies recognizing an aggressor; the lectin pathway, due to diverse carbohydrates present on the aggressor cells; and the alternate pathway, where the system detects the absence of “self” molecules. Taking these antecedents into account, we propose that the presence, in unimmunized individuals, of antibodies recognizing the hemocyanins, leads to the activation of the classical pathway of the human complement system by these proteins. Thus, the general goal of this thesis has been to study a role of the complement that contributes to explain the non-specific immunostimulatory capacity of the hemocyanins in mammals. First, the sera of 4 patients immunized with KLH were analyzed, and two patients with a high level of anti-KLH antibodies were identified, being used as a positive controls for the detection of antibodies in healthy donors previously unimmunized with hemocyanins. Then we detected in 5 donors, different levels of antibodies not only against KLH, but also against FLH and CCH. In order to analyze the specificity of these antibodies, the hemocyanins were chemically deglycosylated and we observed how this affected the antibody binding in the sera of unimmunized donors, concluding that this treatment affected differentially their reactivity, Specifically, deglycosylation in some cases diminished antibody binding, while in others, no effect was observed and yet, in some it was even increased. Then, the ability of some sera to activate in vitro the classical pathway of the complement system was assessed, a phenomenon that was observed with all hemocyanins, although no correlation between antibody level and activation intensity could be established. Also, as observed before, hemocyanin deglycosylation had a differential effect in the activation of this pathway, with a remarkable effect over FLH, where deglycosylation strongly increased both antibody binding and classical pathway activation. In agreement with these results, when an anti-C1q antibody that specifically inhibits classical pathway activation was used, this activation was reversed. Taken together, these results point towards a new role for the complement system, specifically through the classical pathway, regarding the remarkable non-specific immunomodulatory properties of the molluskan hemocyanins in mammals. Even though we could not define a prevailing role for carbohydrates in all hemocyanins, the results indicate the need to continue with this line of research, to provide additional information for a safe use of hemocyanins in biomedicine / Conicyt, Fondecyt, Proyecto Anillo PIA-ACT 112, BIOSONDA, FUCITED

Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas Recombinantes y Biotecnología / Las hemocianinas de algunos moluscos son ampliamente usadas en biomedicina, entre ellas, la de Megathura crenulata (KLH), de Concholepas concholepas (CCH) y de Fissurella latimarginata (FLH), éstas dos últimas producidas en Chile, debido a que son potentes inmunoestimulantes no específicos. El factor común en su mecanismo de inmunoestimulación es que polarizan la respuesta hacia una de tipo Th1, fundamental para combatir tumores. Sin embargo, para potenciar su efecto en cánceres más agresivos como el cáncer oral, se requieren adyuvantes adicionales. Así, los objetivos de esta tesis fueron estudiar la respuesta inmune específica, el efecto antitumoral en modelos murinos de cáncer oral y el efecto in vitro de una formulación terapéutica, constituida por una hemocianina y un adyuvante tipo Th1 (QS-21, AddaVax), planteando las siguientes hipótesis: 1. Las hemocianinas de moluscos gastrópodos inducen una respuesta inmune humoral y celular del tipo Th1 en la inmunoterapia del cáncer oral en un modelo murino, que será potenciada al ser empleadas en conjunto con adyuvantes Th1, mejorando así la respuesta terapéutica contra dicho cáncer. 2. Las hemocianinas afectan la viabilidad de las células tumorales de cáncer oral. Los principales resultados demostraron que: 1. La formulación FLH más QS-21 presentó la mejor inmunogenicidad, reflejada en un mayor título de IgG total anti-hemocianina, con predominio de anticuerpos IgG2a, y una respuesta celular superior en un ensayo de hipersensibilidad retardada (DTH). 2. En los modelos ortotópicos y heterotópicos de cáncer oral, la formulación FLH más QS-21 brindó los resultados más prometedores, evaluados mediante una DTH positiva, menor desarrollo de tumor y mayor sobrevida de los animales de experimentación en comparación con el resto de los tratamientos y controles, siendo el denominador común el requerimiento de una inmunización previa con hemocianina antes del desafío con las células tumorales. 3. Las preparaciones de hemocianina-adyuvante tuvieron efectos variables, pero no significativos sobre la viabilidad de las líneas celulares de cáncer oral AT-84, AT-84 E7 Luc y MOC7. 4. No se encontró reacción cruzada entre los anticuerpos antihemocianina y antígenos de superficie presentes en la línea tumoral murina MOC7. Finalmente, es importante destacar que se trata del primer trabajo en que se investiga el efecto de hemocianinas solas y combinadas con adyuvantes en modelos de cáncer oral murino, por lo cual los resultados obtenidos sientan las bases para profundizar en el estudio y la aplicación de las hemocianinas y especialmente de FLH en la inmunoterapia del cáncer oral, tanto para la prevención como para el tratamiento de este tipo de carcinoma en seres humanos / The hemocyanins of some mollusks are used in biomedicine, including the one of Megathura crenulata (KLH), of Concholepas concholepas (CCH) and of Fissurella latimarginata (FLH), the last two produced in Chile, since they are potent non-specific immunostimulants. The common factor in their immunostimulatory mechanism is that induce a strong polarization toward Th1 immune response, fundamental for destroying tumors. Nevertheless, to potentiate its effect in more aggressive cancers like oral cancer, additional adjuvants are required. The aims of this thesis were to study the specific immune response, the antitumor effect in murine models of oral cancer and the in vitro effect of a therapeutic formulation, consisting of a hemocyanin and a Th1 adjuvant (QS-21, AddaVax). The hypotheses were: 1. The hemocyanins of mollusks gastropod induce a humoral and cellular type Th1 immune response in oral cancer immunotherapy in a murine model, and will be enhanced when they are used in conjunction with Th1 adjuvants, thereby improving the therapeutic response against such cancer. 2. The hemocyanins affect the cellular viability of the tumor cells of oral cancer. The principal results demostrated that: 1. The FLH plus QS-21 formulation showed the better immunogenicity, as reflected in a major anti-hemocyanin IgG total title, with predominance of IgG2a antibodies, and better cellular response in a delated-type hypersensitivity assay (DTH). 2. In the orthotopic and heterotopic models of oral cancer, the FLH plus QS-21 formulation showed the most promising results, evaluated through a positive DTH, less tumor development and a major survival compared with other treatments and controls. The common factor was the priming with hemocyanins prior the tumor cells challenge. 3. The hemocyanin-adjuvant preparations had variable, without significant effects on the viability of the oral cancer cell lines AT-84, AT-84 E7 Luc and MOC7. 4. A cross reaction between the anti-hemocyanin antibodies and the surface antigens in the MOC7 murine tumor line was not found. Finally, it is important to note that this is the first study in which are investigated the effect of the hemocyanins alone and combined with adjuvants in murine models of oral cancer. Therefore, the results lay the basis for further studies on application of hemocyanins and especially FLH in oral cancer immunotherapy, both for the prevention and/or the treatment of such carcinoma in humans / Fondecyt

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Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y optar al título de Bioquímico / Las hemocianinas de moluscos son enormes glicoproteínas que al ser inoculadas en mamíferos, generan una potente respuesta inmune del tipo Th1, caracterizada por la secreción de IFN-y. Es así que se han usado como carrier en el desarrollo de anticuerpos contra haptenos, como carrier/adyuvante en vacunas terapéuticas contra patógenos y cáncer y además, como inmunoestimulante no específico en la inmunoterapia del carcinoma superficial de vejiga. Sin embargo, los mecanismos inmunológicos involucrados en las etapas tempranas de la respuesta inmune anti-hemocianina, conducentes a sus notables propiedades inmunoestimulantes, son muy poco conocidos. Es así que ha sido escasamente abordado su efecto sobre las redes de comunicación coordinadas por citoquinas, las proteínas que median las interacciones entre las células del sistema inmune. Esta información, ampliará no solo el conocimiento básico para comprender los efectos inmunoestimulantes de las hemocianinas en mamíferos, sino que también contribuirá a nuevas aplicaciones. En esta tesis se propuso estudiar el efecto de tres hemocianinas sobre macrófagos peritoneales murinos, como modelo para entender la respuesta inmune innata que inducen en dichas células presentadoras de antígeno. Específicamente, se estudiaron la hemocianina clásica, originaria de California y conocida como KLH, obtenida de Megathura crenulata y dos descubiertas más recientemente que corresponde a CCH de Concholepas concholepas y FLH de Fissurella latimarginata, especies que habitan las costas de nuestro país. Se propuso que las hemocianinas al ser incorporadas por las células presentadoras de antígenos, inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias, un evento fundamental para dar el inicio a una respuesta inmune. Para demostrarlo, cultivos in vitro de macrófagos peritoneales murinos, previamente caracterizados morfológicamente, fenotípicamente (F4/80+) y funcionalmente, fueron incubados con las distintas hemocianinas en concentraciones de hasta 1 mg/ml; LPS y medio de cultivo fueron usados como control positivo y negativo, respectivamente. Posteriormente, se estudió la correlación entre los niveles de mRNA y los niveles de proteína de un panel de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias mediante dos tipos de PCR y ELISA, respectivamente. Los principales resultados demuestran que: 1. Las hemocianinas fueron fagocitadas por los macrófagos peritoneales cultivados in vitro. Sin embargo, FLH y KLH estimularon más tempranamente que CCH el aumento en la expresión de quimioquinas claves en la extravasación de leucocitos, tales como MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) y LIX (CXCL-5), las cuales son indicativas de un proceso inflamatorio agudo. 2. Las hemocianinas estimularon la expresión de IL-6, IL-12p40 y TNF-α en distintos tiempos e intensidades, como indican los resultados de RT-qPCR y ELISA, sugiriendo la inducción de mecanismos de señalización diferentes, cuya explicación es atribuible a las diferencias estructurales que presentan las hemocianinas entre ellas y especialmente, en aquellas que dicen relación con su composición de oligosacáridos. 3. Las hemocianinas muestran la inducción de un perfil inmunológico Th1 marcado, al mantener reguladas a la baja citoquinas claves de la respuesta Th2, como son IL-4, IL-5, IL-13, TGF-ß2. Finalmente, los resultados presentados en esta tesis permiten concluir que los macrófagos también participan en los mecanismos inmunológicos tempranos que acompañan el reconocimiento de las hemocianinas, induciendo un ambiente proinflamatorio que puede explicar sus notables propiedades inmunomoduladoras en los mamíferos / Molluskan hemocyanins are huge glycoproteinscapable of induce a potent Th1-dominant immune response, characterized by the secretion of IFN-y, when are inoculated in mammals. By this reason, they have been used as a carrier protein in the development of antibodies against pathogens and cancers and also, as non-specific immunostimulant in the immunotherapy of superficial bladder cancer. However, the immunological mechanisms involved in the early phases of the anti-hemocyanin immune response, that leads to its remarkable immunostimulatoryt effects, are scarcely known. Thus, it has been poorly addressed their effects on the communication network coordinated by cytokines, the proteins which mediate interactions between cells from the immune system. This information will allow expand the basic comprehension to understand its immunostimulatory effects, but also will contribute to new applications. In this thesis, we proposed to examine the effects of three hemocyanins on murine peritoneal macrophages, as a model for understanding the earliest immune responses induced by these antigen presenting cells (APC). Specifically, we studied the classical hemocyanin, native from California and obtained from Megathura crenulata, known as KLH and two recently discovered hemocyanins, CCH collected from Concholepas concholepas and FLH from Fissurella latimarginata, both species natives of our coasts. It was proposed that once hemocyanins are incorporated by APC, would induce the expression of proinflammatory cytokines, a key event in the initiation of an immune response. To demostrate this, in vitro cultures of murine peritoneal macrophages, previously characterized morphologically, phenotypically (F4/80+) and functionally, were incubated with hemocyanins in concentrations up to 1 mg/ml for different times; as positive and negative control, LPS and culture médium were used, respectively. Subsequently, we studied the correlation between mRNA and protein levels from a panel of proinflammatory cytokines and chemokines using two types of PCR and ELISA, respectively. The main results show that: 1. Hemocyanins were endocyted by peritoneal macrophages cultured in vitro, but only FLH and KLH and not CCH can induced an increased in the expression of key chemokines related to leukocyte extravasation, such as MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) and LIX (CXCL-5), wich are indicative of an acute inflammatory process. 2. Hemocyanins simulated the expression of IL-6, IL-12p40and TNF-α at different times and intensities, as indicated by the results of RT-qPCR and ELISA, suggesting different signaling pathways of induction, which can be explained by strutural differences between them, and specially those concerns to their oligosaccharides composition. 3. Hemocyanins showed induction of a Th1-dominant immune profile, maintaining downregulated key Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-13 and TGF-ß2. Finally, the results presented in this thesis, allow to conclude that macrophages are involved in the early phases of immunes recognition of hemocyanins, inducing a proinflammatory milieu that may explain its enhanced immunomodulatory properties in mammals / Fondecyt, Biosonda, Fucited

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Ingeniera Civil en Biotecnología / El melanoma es un cáncer de alta incidencia y mortalidad, que posee una inmunogenicidad suprimida por mecanismos de evasión propios, como la expresión aberrante del gangliósido GD2 en la superficie de las células tumorales. Entre las terapias experimentales, la hemocianina de Megathura crenulata, conocida como KLH, generó una respuesta inmune protectiva contra el tumor de melanoma al estar acoplada a un péptido que mimetiza a GD2 (péptido P10), induciendo anticuerpos anti-GD2 que dirigen la respuesta hacia el tumor. Así, se propuso que las hemocianinas de los moluscos del litoral chileno, Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH), acopladas a P10 generarían una respuesta inmune protectiva frente al desafío de ratones C57BL/6, con melanoma murino de la línea B16F10. Primero, los péptidos P10 y control (S266) fueron acoplados a las tres hemocianinas mediante el entrecruzador sulfo-SMCC. Luego, utilizando el adyuvante AddaVax, como potenciador inmunológico de los conjugados hemocianina-péptido, se inmunizó a los ratones encontrándose un elevado y similar título de anticuerpos contra las hemocianinas (de 1:2.500), y un menor título de anticuerpos específicos y predominantemente de clase IgG contra cada péptido (de 1:300). Posteriormente, se evaluó la terapia anti-tumoral inducida por tres inmunizaciones con los conjugados y con hemocianinas no acopladas, en ratones desafiados con células B16F10 y previamente sensibilizados con cada antígeno. Se encontró que FLH indujo una mayor respuesta inmune protectiva contra el tumor que CCH, dado que inhibió la incidencia y la velocidad de crecimiento tumoral, similar al control positivo con KLH, estando o no conjugada, y sin efectos tóxicos colaterales. Con ello, y según se verificó por inmunofluorescencia y indirecta citometría de flujo, los anticuerpos anti-hemocianinas presentaron reacción cruzada con epítopos presentes en las células B16F10 y en líneas de melanoma humano. En conclusión, no se encontraron diferencias entre las hemocianinas al actuar como carrier de péptidos miméticos, pero sí hubo diferencias significativas en la respuesta inmune antitumoral inducida por FLH y KLH, respecto a los controles y a CCH, resultados que son promisorios para continuar los estudios preclínicos con FLH, que potencien su uso como adyuvante o inmunomodulador en la terapia del melanoma.

Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos, en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata (KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes, incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1. En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas, consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs, activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides. En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6. Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c+) vía endocitosis mediada por vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp, sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot, mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kDa hasta las 54 h de incubación, no siendo detectados a las 72 h. Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC. Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas. Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es fundamental / Hemocyanins are glycoproteins that function as oxygen transporters in some mollusks and arthropods. They are known by their powerful immunogenicity in mammals, and therefore are widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccine development, and as non specific inmunoestimulant for the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH obtained from the Californian limpet M. crenulata has been exclusively used for the above purposes. We demonstrated that CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod C. concholepas, although differ in origin and structure; have similar immunomodulatory properties, increasing the activity of NK cells, and inducing a type Th1 immune response. Considering the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, it is of interest to determine the relationship among the structural features of hemocyanins and their effect on DCs maturation and how they specifically modulate their functions. We postulated that CCH induce DC maturation by activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and presentation, to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin environment in lymphoid tissues. First, we analyzed the kinetics of CCH uptake by DCs obtained from bone marrow precursors of C57BL mice, isolated by magnetic sorting and cultured in vitro. The uptake of CCH was studied using diverse microscopic techniques and flow cytometry. To track the protein, we used fluorescent conjugates of CCH and specific anti CCH antibodies. We found that CCH is quickly internalized by clathrin-mediated endocytosis vesicles, and after that, it was localized in secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, was investigated by the analyses of the expression of surface molecules as MHCI, MHCII and CD86, as well as by IL12 secretion and the lost of fagocitic activity. As a positive control we used DCs treated with LPS, which modify these parameters after 24h of culture. DCs treated with CCH did not show differences up to 72 h with respect to the control DCs. At this time, an increased of the expression of the lysosome membrane glycoprotein Lamp was observed, suggesting that CCH is gradually processed. We found additional evidence for a slow processing by DCs, since, fragments of size around 50 kDa, were detected by Western blot up to 54 h, and disappears at the 72h. In contrast to these results, when DCs were cocultured with purified NK cells in the presence of CCH, an increase in the expression of MHCII and CD86 surface molecules and secretion of IL12 and INFγ was observed. The above effects of CCH were boosted when both cellular types were put in contact, indicating that the NK and DCs contact is necessary for the modulation of DCs by CCH. Next, we studied the influence of the size and the sugar moieties of CCH in their immunostimulatory effect, trough the study of the humoral immune response against deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the inmunoestimulant capacity was not decreased; on the contrary, the titers of antibodies were higher against the deglicosilated proteins than the native ones. However, the increased immunogenicity of the deglicosilated CCH did not correlate with the secretion of IL12 in isolated DCs cultured in vitro, suggesting again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the mechanisms of action of the hemocyanins. In conclusion, this work is the first experimental approached to get inside the fine immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model. The main conclusions that can be drawn from this work are that CCH is slowly processed by the DCs, and that the NK/DC interaction is required for the effect on DCs in vitro and in vivo

Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-γ, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF-α IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-γ, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT; BIOSONDA; FUCITED

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas provenientes de los gastrópodos Megathura crenulata, conocida como KLH, Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH), presentan propiedades inmunomoduladoras en mamíferos, las cuales han permitido su uso en biomedicina como proteína carrier de antígenos tumorales y como inmunoestimulantes no específicos en el tratamiento de ciertos cáncer. Para explicar esta propiedad se han invocado características tales como su tamaño, xenogenicidad, estructura compleja y contenido de azúcares, siendo este último uno de los rasgos estructurales de importancia en esta Tesis, ya que podrían ser reconocidos por receptores de inmunidad innata de tipo lectinas tipo C (CLRs), presentes en células presentadoras de antígeno (APCs). La endocitocis mediada por CLRs, tales como el receptor de manosa (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) o MGL (macrophage galactose lectine), tiene diversas consecuencias en la respuesta inmune y una de ellas es la presentación cruzada de antígenos por APCs, un mecanismo por el cual los péptidos antigénicos de proteínas exógenas, que se presentan normalmente en el contexto de antígenos de Histocompatibilidad de Clase II (MHC II) a linfocitos T CD4+, son cargados en MHC de clase I y presentados a linfocitos T CD8+, células fundamentales en la respuesta inmune celular antitumoral. Siendo las hemocianinas antígenos exógenos, la hipótesis ha sido que: la endocitosis de las hemocianinas mediada por receptores lectinas tipo C en APCs, conduce a su presentación cruzada. Para estudiar la unión de las hemocianinas y los CLRs, se realizaron ensayos de unión in vitro mediante ELISA, entre quimeras recombinantes del MR y DC-SIGN con hemocianinas nativas y desglicosiladas; además de ensayos de inhibición con sus ligandos naturales, en presencia y ausencia de EDTA. Se caracterizó la interacción receptor/ligando utilizando SPR (surface plasmon resonance), permitiendo determinar las constantes de afinidad aparente entre las hemocianinas y dichos receptores. Además, mediante citometría de flujo se realizaron estudios en un modelo artificial de células. CHO que sobre-expresan el MR y, con APCs humanas y murinas. Usando microscopia confocal de fluorescencia y marcadores específicos, se estudió en APCs murinas a qué compartimento intracelular se destinan las hemocianinas. Finalmente, se iniciaron los estudios para determinar si APCs murinas y líneas tumorales internalizan y presentar las hemocianinas en MHC-I. Los principales resultados muestran que las hemocianinas interactúan con más de un receptor, así CCH, FLH y KLH interactúan con MR y DC-SIGN, pero solo FLH y KLH lo hacen con MGL. Además, se demostró en APCs murinas, que la incorporación de hemocianina es inhibida parcialmente por EDTA y D-Manosa. Por otro lado, se observó que el MR participa en la captura de las hemocianinas en células CHO que sobreexpresan el MR; además, que APCs humanas y murinas, que expresan CLRs, internalizan las hemocianinas. También se encontró, que las tres hemocianinas se destinan a compartimentos lisosomales (Lamp-1+) y endosomas tardíos (Rab7+). Sin embargo, no se encontró CCH en endosomas tempranos (Rab5+), a diferencia de FLH y KLH, sugiriendo diferencias en la ruta endocítica que siguen las hemocianinas una vez internalizadas por las APCs. Así, FLH y KLH podrían estar siguiendo una ruta de procesamiento alternativa, que las conduzca a ser presentadas a linfocitos T CD8+. La vía de procesamiento alternativa de las hemocianinas, podría explicar en parte su efecto antitumoral no específico, ya que sumada a la vía de presentación en MHC II, al activar linfocitos T CD8+ vía MHC I, se liberarían citoquinas y factores humorales que indirectamente, activarían la destrucción de células tumorales u otras respuestas específicas latentes, efecto conocido como bystander / Hemocyanins from the gastropod Megathura crenulata (KLH), Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH) have mainly been used as non-specific immunostimulants with beneficial clinical outcomes, to prevent the progression of recurrent superficial bladder cancer or as carriers/adjuvants for producing antibodies against tumor-associated antigens in therapeutic vaccines against cancer. However, the mechanism involved in the positive immunomodulatory effects of these proteins has been scarcely studied. An important feature of these hemocyanins is its carbohydrate content, which can reach up to 3% (w/w), being mannose as the most abundant sugar. These oligosaccharides can be recognized by C-type lectin receptors (CLRs) of innate immunity, such as Mannose Receptor (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) or MGL (macrophage galactose lectine), present on antigen presenting cells (APCs). Furthermore, these innate receptors have been involved in classical and alternative antigen presentation by MHC I and MHC II to CD8+ and CD4+ lymphocytes, respectively. Hence, we proposed that CLRs-mediated endocytosis of hemocyanins in antigen presenting cells triggers the cross-presentation of these proteins. In this work, we studied the interaction between CLRs and hemocyanins using indirect ELISA and SPR (surface plasmon resonance). We found that CCH, FLH, and KLH bind to MR and DC-SIGN with high affinity constants; additionally FLH and KLH also bind to MGL. Our results demonstrate that the interaction between MR and hemocyanins trigger their endocytosis, analysed by an artificial CHO-MR system. Furthermore, human and murine APCs-expressing CLRs can uptake hemocyanins and ovalbumin. We also found that hemocyanins uptake by murine macrophages and dendritic cells can be partially inhibited by EDTA and D-Mannose. These results suggest an important role of CLRs in endocytosis and signalling transduction of hemocyanins. On the other hand, we studied the cellular destination of hemocyanins in bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) using confocal microscopy. FLH and KLH showed a similar localization in Rab5+, Rab7+ and Lamp-1+ compartments. However, CCH was not found in Rab5+ early endosomes, suggesting differential compartmentalization between the hemocyanins. Thus, FLH and KLH could be involved in an alternative processing pathway such as cross-presentation. Finally, we determined if murine APCs could present hemocyanins on MHC I context. Our results showed that in vitro stimulation of macrophages with FLH, but not with CCH or KLH, increased MHC I and MHC II expression, supporting our hypothesis. Hemocyanins cross-presentation could explain one of the mechanisms involved in the antitumoral effect of these proteins, in addition to the classic presentation by MHC II. Moreover, CD8+ lymphocytes activation could promote cytokines and humoral factors release that indirectly trigger other latent immune responses against the tumoral cells, effect known as bystander effect / FONDECYT; CONICYT; BIOSONDA; FUCITED

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF- IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT 1151337; BIOSONDA; FUCITED