Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-γ, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF-α IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-γ, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-α, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT; BIOSONDA; FUCITED

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas provenientes de los gastrópodos Megathura crenulata, conocida como KLH, Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH), presentan propiedades inmunomoduladoras en mamíferos, las cuales han permitido su uso en biomedicina como proteína carrier de antígenos tumorales y como inmunoestimulantes no específicos en el tratamiento de ciertos cáncer. Para explicar esta propiedad se han invocado características tales como su tamaño, xenogenicidad, estructura compleja y contenido de azúcares, siendo este último uno de los rasgos estructurales de importancia en esta Tesis, ya que podrían ser reconocidos por receptores de inmunidad innata de tipo lectinas tipo C (CLRs), presentes en células presentadoras de antígeno (APCs). La endocitocis mediada por CLRs, tales como el receptor de manosa (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) o MGL (macrophage galactose lectine), tiene diversas consecuencias en la respuesta inmune y una de ellas es la presentación cruzada de antígenos por APCs, un mecanismo por el cual los péptidos antigénicos de proteínas exógenas, que se presentan normalmente en el contexto de antígenos de Histocompatibilidad de Clase II (MHC II) a linfocitos T CD4+, son cargados en MHC de clase I y presentados a linfocitos T CD8+, células fundamentales en la respuesta inmune celular antitumoral. Siendo las hemocianinas antígenos exógenos, la hipótesis ha sido que: la endocitosis de las hemocianinas mediada por receptores lectinas tipo C en APCs, conduce a su presentación cruzada. Para estudiar la unión de las hemocianinas y los CLRs, se realizaron ensayos de unión in vitro mediante ELISA, entre quimeras recombinantes del MR y DC-SIGN con hemocianinas nativas y desglicosiladas; además de ensayos de inhibición con sus ligandos naturales, en presencia y ausencia de EDTA. Se caracterizó la interacción receptor/ligando utilizando SPR (surface plasmon resonance), permitiendo determinar las constantes de afinidad aparente entre las hemocianinas y dichos receptores. Además, mediante citometría de flujo se realizaron estudios en un modelo artificial de células. CHO que sobre-expresan el MR y, con APCs humanas y murinas. Usando microscopia confocal de fluorescencia y marcadores específicos, se estudió en APCs murinas a qué compartimento intracelular se destinan las hemocianinas. Finalmente, se iniciaron los estudios para determinar si APCs murinas y líneas tumorales internalizan y presentar las hemocianinas en MHC-I. Los principales resultados muestran que las hemocianinas interactúan con más de un receptor, así CCH, FLH y KLH interactúan con MR y DC-SIGN, pero solo FLH y KLH lo hacen con MGL. Además, se demostró en APCs murinas, que la incorporación de hemocianina es inhibida parcialmente por EDTA y D-Manosa. Por otro lado, se observó que el MR participa en la captura de las hemocianinas en células CHO que sobreexpresan el MR; además, que APCs humanas y murinas, que expresan CLRs, internalizan las hemocianinas. También se encontró, que las tres hemocianinas se destinan a compartimentos lisosomales (Lamp-1+) y endosomas tardíos (Rab7+). Sin embargo, no se encontró CCH en endosomas tempranos (Rab5+), a diferencia de FLH y KLH, sugiriendo diferencias en la ruta endocítica que siguen las hemocianinas una vez internalizadas por las APCs. Así, FLH y KLH podrían estar siguiendo una ruta de procesamiento alternativa, que las conduzca a ser presentadas a linfocitos T CD8+. La vía de procesamiento alternativa de las hemocianinas, podría explicar en parte su efecto antitumoral no específico, ya que sumada a la vía de presentación en MHC II, al activar linfocitos T CD8+ vía MHC I, se liberarían citoquinas y factores humorales que indirectamente, activarían la destrucción de células tumorales u otras respuestas específicas latentes, efecto conocido como bystander / Hemocyanins from the gastropod Megathura crenulata (KLH), Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH) have mainly been used as non-specific immunostimulants with beneficial clinical outcomes, to prevent the progression of recurrent superficial bladder cancer or as carriers/adjuvants for producing antibodies against tumor-associated antigens in therapeutic vaccines against cancer. However, the mechanism involved in the positive immunomodulatory effects of these proteins has been scarcely studied. An important feature of these hemocyanins is its carbohydrate content, which can reach up to 3% (w/w), being mannose as the most abundant sugar. These oligosaccharides can be recognized by C-type lectin receptors (CLRs) of innate immunity, such as Mannose Receptor (MR), DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) or MGL (macrophage galactose lectine), present on antigen presenting cells (APCs). Furthermore, these innate receptors have been involved in classical and alternative antigen presentation by MHC I and MHC II to CD8+ and CD4+ lymphocytes, respectively. Hence, we proposed that CLRs-mediated endocytosis of hemocyanins in antigen presenting cells triggers the cross-presentation of these proteins. In this work, we studied the interaction between CLRs and hemocyanins using indirect ELISA and SPR (surface plasmon resonance). We found that CCH, FLH, and KLH bind to MR and DC-SIGN with high affinity constants; additionally FLH and KLH also bind to MGL. Our results demonstrate that the interaction between MR and hemocyanins trigger their endocytosis, analysed by an artificial CHO-MR system. Furthermore, human and murine APCs-expressing CLRs can uptake hemocyanins and ovalbumin. We also found that hemocyanins uptake by murine macrophages and dendritic cells can be partially inhibited by EDTA and D-Mannose. These results suggest an important role of CLRs in endocytosis and signalling transduction of hemocyanins. On the other hand, we studied the cellular destination of hemocyanins in bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) using confocal microscopy. FLH and KLH showed a similar localization in Rab5+, Rab7+ and Lamp-1+ compartments. However, CCH was not found in Rab5+ early endosomes, suggesting differential compartmentalization between the hemocyanins. Thus, FLH and KLH could be involved in an alternative processing pathway such as cross-presentation. Finally, we determined if murine APCs could present hemocyanins on MHC I context. Our results showed that in vitro stimulation of macrophages with FLH, but not with CCH or KLH, increased MHC I and MHC II expression, supporting our hypothesis. Hemocyanins cross-presentation could explain one of the mechanisms involved in the antitumoral effect of these proteins, in addition to the classic presentation by MHC II. Moreover, CD8+ lymphocytes activation could promote cytokines and humoral factors release that indirectly trigger other latent immune responses against the tumoral cells, effect known as bystander effect / FONDECYT; CONICYT; BIOSONDA; FUCITED

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas, glicoproteínas de alto peso molecular cuya función más conocida es transportar el oxígeno en algunos moluscos, son ampliamente utilizadas en aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La hemocianina más empleada para estos propósitos, conocida como KLH, proviene de la Lapa californiana Keyhole limpet (Megathura crenulata), y en Chile se han descubierto dos hemocianinas sustitutas que provienen de las especies litorales Concholepas concholepas (CCH) y Fissurella latimarginata (FLH). Las hemocianinas se utilizan como carriers de moléculas de haptenos y péptidos, como adyuvantes en vacunas y como inmunoestimulantes no específicos en la terapia contra ciertos tipos de cáncer, pues al ser inoculadas en mamíferos inducen una respuesta inmune adaptativa del tipo Th1, caracterizada por la síntesis de IFN-, fundamental en la destrucción de células tumorales e infectadas con patógenos. Los efectos inmunogénicos y antitumorales de las hemocianinas se han atribuido a su tamaño (4-8 MDa), a su estructura cuaternaria didecamérica con múltiples epítopos repetidos, a su xenogenicidad, y a sus azúcares, mayoritariamente N-glicosilaciones heterogéneas y complejas ricas en manosa, que alcanzan un 3-4% (p/p). Se ha demostrado que las N-glicosilaciones tienen funciones estructurales en la hemocianina de Tadorodes pacificus, sin embargo, este aspecto está escasamente estudiado en CCH, FLH y KLH, así como también el rol de los azúcares en sus efectos inmunológicos. Al respecto, se ha descrito que las hemocianinas son endocitadas por células presentadoras de antígenos (APCs) vía receptores de reconocimiento de patógenos de la familia lectina tipo C (CLRs), los cuales reconocen azúcares ricos en manosa, tales como el receptor de manosa (MR), Dectina-1 y Dectina-2, estimulando la secreción de citoquinas que generan un ambiente proinflamatorio benéfico. Sin embargo, no se ha estudiado experimentalmente la contribución de los azúcares sobre la estructura y la respuesta inmunomoduladora y antitumoral de dichas hemocianinas, por lo cual, en base a los antecedentes, se sustenta la siguiente hipótesis: “La eliminación enzimática de N-glicosilaciones en hemocianinas de gastrópodos, tales como KLH, CCH y FLH, disminuye la formación de estructuras didecaméricas y sus propiedades inmunogénicas y antitumorales en mamíferos”. CCH, FLH y KLH fueron N-desglicosiladas enzimáticamente utilizando PNGasa F y también, químicamente con peryodato de sodio como control. Posteriormente fueron analizadas según parámetros bioquímicos que incluyeron dot blot con lectinas, tinción de PAS y Lectin array blot para determinar la presencia de azúcares remanentes, y además, se realizaron análisis mediante SDS-PAGE, microscopía electrónica de transmisión y dicroísmo circular para determinar las modificaciones estructurales. Los resultados principales indicaron que la N-desglicosilación enzimática es parcial, selectiva, y que los azúcares remanentes corresponden principalmente a fucosilaciones. Además, la N-desglicosilación no afectó la estructura secundaria ni el desplegamiento, pero sí la estructura cuaternaria y el replegamiento de estas glicoproteínas. Los estudios inmunoquímicos mediante ELISA demostraron que la unión de hemocianinas desglicosiladas a CLRs quiméricos (MR-Fc, Dectina-1-Fc y Dectina-2-Fc) disminuye, en comparación con la unión de las hemocianinas nativas. Además, se demostró que la unión de hemocianinas al MR y Dectina-2 es específica para manosa, no así la unión a Dectina-1. Estudios mediante citometría de flujo y ELISA, en los que se evaluó el efecto funcional de la N-desglicosilación de las hemocianinas, sobre la unión/incorporación y secreción de citoquinas proinflamatorias en la línea de macrófagos murinos J774.2, demostraron que los N-glúcidos de estas glicoproteínas contribuyen a su unión/incorporación en dichas células, así como a la producción de las citoquinas proinflamatorias TNF- IL-6 e IL-12p40. Finalmente, se realizaron estudios inmunológicos en los que se evaluó el efecto de la N-desglicosilación de hemocianinas sobre la respuesta humoral específica y antitumoral en un modelo murino de melanoma B16F10. Los resultados demostraron que la N-desglicosilación disminuyó el título de anticuerpos anti-hemocianinas, indicando una respuesta humoral desfavorecida. Respecto al potencial antitumoral, el volumen tumoral y porcentaje de animales con tumor no mostraron diferencias entre hemocianinas nativas y N-desglicosiladas con CCH y FLH, pero sí con KLH, donde se observó un mayor volumen tumoral en el grupo tratado con hemocianina N-desglicosilada. El conjunto de los resultados obtenidos, confirman el rol de los N-glúcidos de CCH, FLH y KLH a nivel de su estructura cuaternaria, y además, sugieren fuertemente que las N-glicosilaciones participan en su reconocimiento por algunos receptores lectina tipo C, así como en su efecto proinflamatorio en células presentadoras de antígenos. Finalmente, la N-desglicosilación disminuye la respuesta humoral anti-hemocianinas, sin embargo, se requieren experimentos adicionales para confirmar su rol en el efecto antitumoral / Hemocyanins are huge glycoproteins with several applications in biomedicine and biotechnology, whose better-known function is to carry oxygen in the hemolymph of some mollusks. The most used hemocyanin is named as KLH, from the keyhole limpet (Megathura crenulata), and two substitute hemocyanins have been described in Chile, from the species Concholepas concholepas (CCH) and Fissurella latimarginata (FLH). Hemocyanins act as non-specific immunostimulants when inoculated in mammals, inducing an adaptative Th1 immune response, characterized by the secretion of IFN-, essential in the destruction of tumoral and infected cells. By this property, hemocyanins are widely used in biomedicine as carriers of haptens/peptides, as adjuvants in vaccines, and as immunostimulants in therapies against certain types of cancer. Their immunomodulatory properties have been attributed to their high molecular weight (4-8 MDa), their complex quaternary structure, their xenogenicity and their high and heterogeneous glycan content, mainly mannose-rich N-glycans that reach up to 3-4% (w/w). Studies in the hemocyanin of Todarodes pacificus and other glycoproteins suggest a structural role of N-glycans, however, this role has been scarcely studied in CCH, FLH, KLH, as well as the role of N-glycans on their immunostimulant properties. Hemocyanins are incorporated by antigen presenting cells (APCs) through mannose-recognizing C-type lectin receptors (CLRs), such as mannose receptor (MR), Dectin-1 and Dectin-2, promoting the secretion of beneficial proinflammatory cytokines. Nevertheless, the contribution of glycans to the structure and the immunomodulatory and antitumor properties of CCH, FLH and KLH has not been experimentally demonstrated. Based on the bibliographic background, the proposed hypothesis is that: “The enzymatic N-deglycosylation of gastropods hemocyanins, such as KLH, CCH and FLH, disfavors the quaternary didecameric structure, and their immunogenic and antitumor properties in mammals”. Hemocyanins were enzymatically N-deglycosylated by PNGase F, and as a control, they were chemically deglycosylated by oxidation with sodium periodate. Analyses by dot blot and lectin array blot suggest that N-deglycosylation is selective and partial, leaving fucose-rich residual glycans. Also, analyses by SDS-PAGE, transmission electron microscopy and circular dichroism showed that N-deglycosylation did not affect the secondary structure or unfolding of hemocyanins, but it disfavored the association of subunits to form quaternary structures and their refolding. Moreover, ELISA binding assays showed that the binding of deglycosylated hemocyanins to chimeric CLRs (MR-Fc, Dectin-1-Fc and Dectin-2-Fc) decreased, compared with native hemocyanins. Besides, the binding of hemocyanins to MR and Dectin-2, but not to Dectin-1, was specific for mannose-rich glycans. Experiments by flow cytometry and ELISA, performed in J774.2 macrophage cells, showed a decreased binding and incorporation of N-deglycosylated hemocyanins in these cells, and also showed a decrease in the secretion of proinflammatory cytokines, such as TNF-, IL-6 and IL-12p40, by N-deglycosylated proteins. Moreover, studies in a B16F10 murine model of melanoma were performed, to study the contribution of N-glycans to the humoral and antitumor responses induced by hemocyanins. ELISA assays showed a decreased antibody titer in mice immunized with N-deglycosylated hemocyanins, compared with their native forms. Nevertheless, no clear effects of N-deglycosylation on antitumor properties were observed, as mice immunized with native and N-deglycosylated CCH and FLH did not showed differences in tumor volume and tumor incidence. In contrast, mice immunized with N-deglycosylated KLH showed an increased tumor volume, compared with the native KLH group. Altogether, these results confirm that the N-glycans of CCH, FLH and KLH are essential for their didecameric structure. Similarly, N-glycans of hemocyanins contribute to their incorporation through CLRs, to the activation of the proinflammatory response by APCs, and to the humoral anti-hemocyanin response. However, further analyses are required to confirm the participation of N-glycans on their antitumor properties / FONDECYT 1151337; BIOSONDA; FUCITED

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al título de Bioquímico / La respuesta inmune de invertebrados se basa en un conjunto de elementos del sistema inmune innato, donde los péptidos antimicrobianos (AMPs) juegan un importante rol. Los AMPs son moléculas anfifílicas que se almacenan en el interior de los hemocitos o circulan libremente en la hemolinfa. Su efectividad en la defensa innata se basa en su baja especificidad, actuando contra un amplio rango de microorganismos; su pequeño tamaño y baja toxicidad abren potenciales aplicaciones como nuevos antibióticos, con la ventaja de que no hay evidencia de bacterias resistentes a ellos. Considerando la diversidad de moluscos marinos en nuestras costas, la hipótesis de este trabajo ha sido que existen AMPs en la hemolinfa o hemocitos de moluscos chilenos comestibles. Mediante ensayos en medio sólido, encontramos que extractos de hemocitos de Concholepas y especies de Lapas del género Fissurellidae, exhiben actividad AM contra V. parahaemolyticus y E. coli, ambas cepas Gram negativas. A través de análisis mediante microscopia electrónica, caracterizamos los hemocitos y encontramos al menos dos tipos celulares que presentan diferentes tipos de gránulos electrón-densos en su citoplasma, que de acuerdo a lo descrito en la literatura podrían almacenar AMPs. La caracterización y purificación de los extractos de hemocitos mediante métodos electroforéticos mostró un péptido principal de 3,7 kDa, y los estudios cromatográficos indican la presencia de AMPs de naturaleza hidrofóbica. La identificación de estos péptidos esta en progreso, y se espera a futuro iniciar su utilización en alguna aplicación biomédica o biotecnológica / The immune response of invertebrates relies on elements of the innate immune system, among them, antimicrobials peptides (AMPs) play a relevant role. They are amphiphilic molecules that are accumulated inside the hemocytes or are circulating freely in the hemolymph. Their effectiveness in the innate defence relay in their low specificity, thus acting on a wide range of microorganism; its small size and low toxicity open potential applications as new antibiotics, with the advantage that there are no evidence of building resistant bacteria. Considering the diversity of Chilean mollusc marine species, we hypothesized that there are AMPs in hemolymph or hemocytes of Chilean commercial molluscs. Using solid agar plate assays, we found that extracts of hemocytes from Concholepas and limpets of the Fissurellidae genus, exhibit antibacterial activity against Vibrio parahaemolyticus and Escherichia coli both Gram negative bacteria. Through electron microscopic analysis, we characterized the hemocytes and found at least two cellular types bearing different kind of electron-dense granules, according to literature, these granules may contain AMPs. The characterization and purification of hemocytes extracts through electrophoresis showed the presence of a principal peptide of 3,7 kDa, and chromatographic methods indicate the presence of AMPs with hydrophobic nature. The identification of these peptides is in progress to assess their utilization in some biomedical and biotechnological applications / Fundación COPEC-Pontificia Universidad Católica CQ057 Fondecyt

Overfishing is not an exclusive topic of big fishing industry. Overfishing by small-scale fishers is also happening. The Territorial Use of Rights – TURFs was implemented in Chile to protect the Chilean abalone from overfishing. Through the implementation of the TURFs Chilean abalone are no longer threatened by overfishing. The challenge to protect the resource thus seems to be solved. However, while some problems are solved others persist or new ones arise. The thesis explores the discourses of the Chilean social actors in regard to the development and challenges of the TURFs. The empirical data is formed by a group of interviews, where social issues such as TURFs accomplishments, resource availability, diversification, tenure issues, access to the coast, lack of infrastructure, competition for the space and future expectations, are milestones arising from the empirical material. These issues are analysed through the lens of fishers and stakeholder‟s perception. The paper confirms what other studies such as Cereceda and Czischke 2001, Gallardo 2008, Gallardo and Friman 2012, González et al. 2006, and Meltzoff et al. 2002 have found. Fishers organised nationally through confederations, regional federations and local associations have become active social actors in the artisanal fisheries arena. Similarly, it is also corroborated that through good leadership some fishing organisations are diversifying related and no-related fishing activities to secure better living conditions, thus, constantly evolving, encapsulating more and more benthic fishers‟ social and economic needs. The study concludes that the fishers, even though the difficulties and challenges encountered (heterogeneity of the richness of the seabed and different land issues) during the co-management of some TURFs and due to the fact that they are working in the same designated and exclusive place, they have developed a collective sense of permanent attachment and sense of „property‟ or tenure to the water body where the TURFs are located. Due to their development, the TURFs seem to be more than temporary, raising the question of the land tenure and associated infrastructure development where fishers place their activities, especially in rural areas where settlements do not exist.