Doctorado en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El estudio de péptidos como moléculas terapéuticas ha generado gran interés en la industria farmacéutica debido a sus características de alta especificidad y actividad biológica y baja toxicidad. Igualmente, la exploración de nuevos blancos terapéuticos al interior de la célula es bastante atractiva ya que, posibilita la modulación e intervención de procesos intracelulares. En este contexto, disponer de un sistema de expresión recombinante de péptidos en un huésped como Escherichia coli, permitirá potenciar el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos, especialmente en el estudio de péptidos terapéuticos con actividad biológica intracelular y que requieran unión a péptidos de penetración celular como transportador, ya que el tamaño del péptido a sintetizar podría no ser adecuado para su síntesis química en forma eficiente y sustentable. El trabajo realizado consiste en el diseño de un sistema de expresión bacteriana de péptidos potencialmente terapéuticos, con blanco intracelular y que utilicen al péptido de penetración celular Penetratin como transportador, que permita la producción de diversos péptidos con el fin de estudiar su potencial terapéutico. El sistema fue evaluado mediante la expresión de los péptidos p53pAnt y PNC27, los cuales han mostrado tener actividad biológica antitumoral in vitro. Se diseñó el vector pET31HT que permite la expresión de los péptidos fusionados a la proteína cetoesteroide isomerasa (KSI) en una forma tal que puedan ser posteriormente separados y obtenidos con su secuencia original mediante corte con Trombina. Utilizando técnicas de ingeniería genética se construyó el vector de expresión diseñado. Para la implementación del sistema, se clonó las secuencias nucleotídicas correspondientes a los péptidos p53pAnt y PNC27 en el vector pET31HT. Se logró la producción de los péptidos fusionados en células transformadas con las construcciones pET31HT-p53pAnt y pET31HT-PNC27. La expresión se obtuvo en forma de cuerpos de inclusión y se determinó que los niveles de expresión de proteína recombinante se mantienen constantes y alrededor del 20% del peso seco celular, para distintas condiciones de inducción. Los péptidos fusionados fueron purificados desde la fracción de proteína insoluble por cromatografía de afinidad en condiciones desnaturantes. Mediante una estrategia que incluye precipitación por dilución y solubilización de las muestras en un buffer específico, se logró la separación del péptido p53pAnt de la proteína KSI en un proceso de proteólisis altamente eficiente. Sin embargo, no se logró separar al péptido PNC27 desde la proteína de fusión probablemente debido a la rigidez impuesta por sus aminoácidos iniciales a la región de reconocimiento de la proteasa. El péptido p53pAnt fue purificado desde el producto de digestión, según la estrategia diseñada, obteniéndose un péptido altamente puro. Las características del sistema, en conjunto con el proceso de purificación desarrollado, permiten la síntesis biológica de péptidos con una productividad mayor a 30 mg/g de peso seco celular y con una pureza de al menos un 95%. Con esto, el sistema diseñado es apropiado para su uso en la producción de péptidos para investigación científica.

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica de Proteínas y Biotecnología, y Memoria para optar al título de Bioquímico / La respuesta inmune de invertebrados se basa en un conjunto de elementos del sistema inmune innato, donde los péptidos antimicrobianos (AMPs) juegan un importante rol. Los AMPs son moléculas anfifílicas que se almacenan en el interior de los hemocitos o circulan libremente en la hemolinfa. Su efectividad en la defensa innata se basa en su baja especificidad, actuando contra un amplio rango de microorganismos; su pequeño tamaño y baja toxicidad abren potenciales aplicaciones como nuevos antibióticos, con la ventaja de que no hay evidencia de bacterias resistentes a ellos. Considerando la diversidad de moluscos marinos en nuestras costas, la hipótesis de este trabajo ha sido que existen AMPs en la hemolinfa o hemocitos de moluscos chilenos comestibles. Mediante ensayos en medio sólido, encontramos que extractos de hemocitos de Concholepas y especies de Lapas del género Fissurellidae, exhiben actividad AM contra V. parahaemolyticus y E. coli, ambas cepas Gram negativas. A través de análisis mediante microscopia electrónica, caracterizamos los hemocitos y encontramos al menos dos tipos celulares que presentan diferentes tipos de gránulos electrón-densos en su citoplasma, que de acuerdo a lo descrito en la literatura podrían almacenar AMPs. La caracterización y purificación de los extractos de hemocitos mediante métodos electroforéticos mostró un péptido principal de 3,7 kDa, y los estudios cromatográficos indican la presencia de AMPs de naturaleza hidrofóbica. La identificación de estos péptidos esta en progreso, y se espera a futuro iniciar su utilización en alguna aplicación biomédica o biotecnológica / The immune response of invertebrates relies on elements of the innate immune system, among them, antimicrobials peptides (AMPs) play a relevant role. They are amphiphilic molecules that are accumulated inside the hemocytes or are circulating freely in the hemolymph. Their effectiveness in the innate defence relay in their low specificity, thus acting on a wide range of microorganism; its small size and low toxicity open potential applications as new antibiotics, with the advantage that there are no evidence of building resistant bacteria. Considering the diversity of Chilean mollusc marine species, we hypothesized that there are AMPs in hemolymph or hemocytes of Chilean commercial molluscs. Using solid agar plate assays, we found that extracts of hemocytes from Concholepas and limpets of the Fissurellidae genus, exhibit antibacterial activity against Vibrio parahaemolyticus and Escherichia coli both Gram negative bacteria. Through electron microscopic analysis, we characterized the hemocytes and found at least two cellular types bearing different kind of electron-dense granules, according to literature, these granules may contain AMPs. The characterization and purification of hemocytes extracts through electrophoresis showed the presence of a principal peptide of 3,7 kDa, and chromatographic methods indicate the presence of AMPs with hydrophobic nature. The identification of these peptides is in progress to assess their utilization in some biomedical and biotechnological applications / Fundación COPEC-Pontificia Universidad Católica CQ057 Fondecyt

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La microcina E492 es un antibiótico peptídico de 7,9 kDa producido por Klebsiella pneumoniae RYC492 que mediante la formación de canales iónicos produce la despolarización de la membrana citoplasmática de bacterias gram negativo como E. coli, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Mediante estudios de clonamiento y expresión en E. coli se estableció que los determinantes genéticos implicados en la producción de microcina activa están contenidos en un segmento de 13 Kpb ubicado en el cromosoma de Klebsiella pneumoniae RYC492. La microcina E492 es exportada por un sistema de transporte de tipo I constituido por un transportador ABC (MceG), una proteína accesoria (MceH) y una proteína de membrana externa (TolC). El sistema de exportación de microcina E492 y el sistema de exportación de colicina V comparten alrededor de un 90% de similitud entre ellos. Estudios preliminares indicaron que el sistema de exportación de colicina V no reemplaza la función del sistema de exportación de microcina E492, y que la especificidad del transporte estaba relacionada con la presencia del gen mceF. El objetivo central de esta tesis consistió en estudiar los mecanismos de especificidad del sistema I de exportación para lo cual se usará como modelo los exportadores que permiten la secreción de colicina V y microcina E492. Mediante estudios de mutagénesis se determinó que MceF es prescindible en la exportación de microcina E492, y que más bien este producto génico participaría en la regulación de esta bacteriocina. Así, se determinó que MceF regula negativamente la expresión de la inmunidad de la microcina E492 y, posiblemente a través de este mecanismo, la expresión de la microcina E492. Para estudiar los determinantes de la especificidad de la exportación se clonaron los sistemas de exportación de microcina E492 (mceHG) y colicina V (cvaAB). Se determinó que el sistema de exportación de colicina no complementa la exportación de microcina E492. Mediante la construcción de sistemas de exportación híbridos entre las proteínas ABC y accesoria de los sistemas de microcina E492 y colicina V se estableció que el transportador de colicina V (CvaB) no permite la exportación de microcina E492. La construcción de transportadores quimeras entre los dominios del transportador de colicina V y microcina E492 permitió establecer que el dominio ABC del sistema de exportación de colicina V determina la exportación específica de su bacteriocina. Para entender los mecanismos moleculares de los determinantes de especificidad se generaron modelos 3D del transportador de microcina E492. Este modelo ayudó a predecir la importancia del residuo D121 en el procesamiento del péptido líder de la microcina E492, lo cual se comprobó experimentalmente. El modelo de MceG también permitió establecer que las diferencias entre los dominios ABC de los transportadores de microcina E492 y colicina V se localizan en una región específica. El modelo 3D también permitió entender la importancia de los cuatro últimos aminoácidos del transportador en el proceso de exportación, lo cual fue verificado experimentalmente. Esta región interactúa directamente con el nucleótido, elemento indispensable para energizar el sistema. Finalmente, se estudió mediante western blot de extractos celulares totales y extractos extracelulares de mutantes en los dominios peptidasa y ABC, el acoplamiento que existe entre el procesamiento de la bacteriocina y su exportación. Estos estudios indicaron que el procesamiento ocurre concomitante con la exportación y que el dominio ABC es necesario para activar a la peptidasa / Microcin E492 is peptide antibiotic of 7,9 kDa produced by Klebsiella pneumoniae RYC492 that through the formation of ion channels produces depolarization of cytoplasmatic membrane of gram-negative strains such as E. coli, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter and Klebsiella. Through the cloning and expression in E. coli has been established that the genetic determinants involved in microcin E492 production are encoded in a 13 Kpb DNA segment from the chromosome of K. pneumoniae RYC492. Microcin E492 is secreted by a type I exporter system. This system is formed by an ABC transporter (MceG), an accessory protein (MceH), and the outer membrane protein TolC. The microcin E492 exporter system has more than 90% of similarity with the colicin V system. Preliminary studies showed that colicin V system is unable to replace the function of microcin E492 exporter, and this specificity was related to the mceF gene. The main goal of this thesis was to study the mechanisms of specificity in type I protein export system using as models colicin V and microcin E492 exporter systems. The use of mutants in MceF allowed to establish that MceF was not necessary to export microcin E492, and that this protein would participate in the regulation of microcin E492 expression. Thus, it was established that microcin E492 immunity is negatively regulated by MceF, and probably through this mechanism the expression of microcin E492 could be controlled. To study the elements that are involved in the specificity of export, the microcin E492 (mceHG) and colicin V (cvaAB) exporter systems were cloned. The colicin V exporter system was unable to complement the export of microcin E492. Through the construction of a hybrid between the accessory and exporter proteins of microcin E492 and colicin V exporter systems it was established that CvaB was unable to export microcin E492. The construction of chimeric proteins between the domains of microcin E492 and colicin V exporters showed that the ABC domain of colicin V exporter confers the specificity in the exportation of this bacteriocin. To understand the molecular mechanism of the specificity, 3D models of microcin E492 exporter were generated. These models helped to determine the importance of D121 residue in the processing of microcin E492 leader peptide. The 3D model of MceG allowed locate the region where the differences between the ABC domain of colicin V and microcin E492 exporters reside. The 3D model also permitted to assess the importance of MceG Cterminal region in the processing and export of microcin E492. This region also interacts directly with the nucleotide, a key step to energize the system. Finally, the coupling between microcin E492 processing and export was analyzed through western blot using intracellular and extracellular extracts of mutants in the ABC or peptidase domains. These studies showed that ABC domain is necessary to activate the peptidase