MOREIRA FILHO, Renato Evando. Coccidioidomicose no Estado do Ceará : caracterização protéica, descrição de microepidemia, virulência in vitro e potencial imunoprotetor de antígeno isolado de Coccidioides posadasii. 2012. 120 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-03T12:10:23Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_remoreira filho.pdf: 2491729 bytes, checksum: 8762d6066fd649edcf1e81678a3329ae (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-04T16:14:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_remoreira filho.pdf: 2491729 bytes, checksum: 8762d6066fd649edcf1e81678a3329ae (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-04T16:14:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_remoreira filho.pdf: 2491729 bytes, checksum: 8762d6066fd649edcf1e81678a3329ae (MD5) Previous issue date: 2012 / Scientific researches seeking to use Coccidioides posadasii antigens are common in the literature, as relevant instruments to diagnosis and possible immunoprotector effect in humans. Thus, we performed biochemical characterization of protein antigen derived from C. posadasii, an active search for human cases of coccidioidomycosis in Ceará, as well as evaluation of immune response in vivo. To achieve these goals, the biochemical characterization of the antigen was performed by electrophoresis (SDS-PAGE and 2D-PAGE), detection of proteases, glycoproteins and N-terminal sequencing and we reported three human cases of coccidiodiomycosis in armadillo hunters with its clinical description and laboratory evaluation. Further, a murine model was described testing a possible imunoprotector effect with an in-house antigen. For biochemical analysis, it was observed delimitation bands in ranges 45-67 kDa and 67-97 kDa (SDS-PAGE), detection of glycoproteins, proteases and N-terminal sequencing demonstrating the bands being a β-glucosidase and a glutamine synthetase. In clinical cases, it was found pneumonic disease, direct mycological examination, sputum culture, double radial immunodiffusion (antigen in-house) and PCR positive for C. posadasii. In the murine model, the infected group, in the presence of antigen and adjuvant, showed, histologically, lung disorders smaller than the other groups, and increased splenic lymphoid stimulus. Regarding the cytokines (IL-6, IL-12 and TNF), there was no significant difference between groups, but a trend toward immunoprotective response. The infected group, without immunoprotection, showed greater weight loss. In the macroscopic analysis, the maximum commitment was the presence of 2 granulomas in the latter group. In the analysis of blood counts, the white run showed major differences between groups. In conclusion, the in-house antigen showed that it was a β-glucosidase and a glutamine synthetase which tended to stimulate cellular immunity in a murine model. Moreover, the description of human cases contributes to the spread of early diagnosis of coccidioidomycosis and requires additional laboratory investigations. / Pesquisas científicas buscando a utilização de antígenos de Coccidioides posadasii são comuns na literatura especializada, uma vez que, são instrumentos relevantes para diagnóstico e possível efeito imunoprotetor em humanos. Diante do exposto, foi realizada caracterização bioquímica de antígeno protéico oriundo de C. posadasii. busca ativa de casos humanos de coccidioidomicose no Estado do Ceará, bem como, avaliação da resposta imunológica in vivo. Para concretizar tais objetivos, a caracterização bioquímica do antígeno foi realizada por meio de eletroforese (SDS-PAGE e 2D-PAGE), detecção de proteases, glicoproteínas e sequenciamento N-terminal e foram buscados, ativamente, quadros de coccidiodiomicose em três caçadores de tatu com a respectiva descrição clínica e avaliação laboratorial. Ademais, foi descrito modelo murino de coccidioidomicose com testagem de possível efeito imunoprotetor do antígeno in-house. Quanto a análise bioquímica, observou-se delimitação de bandas nas faixas de 45-67 kDa e 67-97 kDa (SDS-PAGE), detecção de glicoproteínas, proteases e sequenciamento N-terminal demonstrando serem as bandas uma β-glucosidase e uma glutamina sintetase. Nos casos clínicos, foram encontrados queixas pneumônicas, exame micológico direto, cultivo de escarro, imunodifusão radial dupla (com antígeno in-house) e PCR positivos para C. posadasii. No modelo murino, o grupo infectado, na presença de antígeno e adjuvante, apresentou, na análise histopatológica, menores alterações pulmonares que os demais grupos, além de maior estímulo linfóide esplênico. No que concerne a dosagem de citocinas (IL-6, IL-12 e TNFα), não se observou diferença significativa entre os grupos, mas uma tendência à resposta imunoprotetora. O grupo infectado, sem imunoproteção, apresentou maior perda ponderal. Na análise macroscópica, o máximo comprometimento foi a presença de 2 granulomas, neste último grupo. Na análise dos hemogramas, a série branca demonstrou maiores diferenças entre os grupos. Em conclusão, o antígeno in-house se mostrou tratar-se de uma β-glicosidase e uma glutamina sintetase que tenderam a estimular a imunidade celular em modelo murino. Além disso, a descrição de casos humanos contribui para a difusão do diagnóstico precoce da coccidioidomicose e requer investigações laboratoriais complementares.

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T12:58:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiazBardales_BlancaMaria_M.pdf: 2071877 bytes, checksum: e685ce6e7a1a0f113a1728d212489c56 (MD5) Previous issue date: 1998 / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-16T11:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_LauroMello_M.pdf: 13501745 bytes, checksum: 241a6a0bf3840742add2d6f9503401dd (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: A soro albumina equina (SAE), submetida à ação proteolítica da Catepsina D de braço de coelhos, foi cindida, em seu motivo antigênico, em pelo menos três sistemas precipitantes eletroforeticamente distintos. Neste digesto, pode-se demonstrar a existência de dois sistemas que, do ponto de vista imunológico diferem marcadamente quanto a seus determinantes antigênicos. Por cromatografia em DEAE ¿ celulose, pode-se isolar um fragmento de peso molecular estimado como sendo menor que 11000 daltons e incapaz de formar sistemas precipitante visível com sorosant-SAE, mas, capaz de reagir com estes antisoros como demonstrado por técnicas de hemaglutinação passiva e de inibição da hemaglutinação. Os dados apresentados permitem afirmar que este fragmento apresenta em sua estrutura um número reduzido de determinantes antigênicos. Uma demosntração clara da capacidade deste fragmento em reagir cruzadamente com soros anti-SAE não pode ser feita em função, principalmente, dos baixos títulos aglutinantes dos soros utilizados. Os resultados apresentados são estimulantes no sentido de se caracterizar melhor este fragmento para os estudos futuros sobre as bases químicas envolvidas na imunogenicidade deste fragmento e da molécula nativa de SAE e, no estudo das reações cruzadas desta proteína com outras imunologicamente relacionadas / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

A apresentação de peptídeos endógenos pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) e seu reconhecimento pelos Linfócitos T Citotóxicos representa a etapa final de uma importante via intracelular. Esta via permite ao sistema imune realizar uma constante vigilância acerca do conteúdo citoplasmático de todas as células nucleadas do organismo, sendo um mecanismo central na defesa antitumoral e antiviral. A compreensão dos detalhes moleculares que levam um dado complexo peptídeo:MHC (pMHC) a estimularem uma população de linfócitos é vital para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias, tendo especial aplicação no entendimento da resposta imune ao Vírus da Hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus). Em um trabalho publicado em 2008, Paraskevi Fytili e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de um conjunto de variantes do epitopo imunodominante HCV-NS31073 (CV/INGVCWTV) frente a uma população de linfócitos previamente estimulada com o epitopo selvagem. Foram utilizadas tanto variantes naturais quanto sintéticas, tendo sido observado uma grande variação na produção de IFN-gama pelas células específicas contra o epitopo selvagem. O presente trabalho pretende avaliar esta variabilidade em um nível molecular, através do uso de ferramentas de bioinformática. A prévia identificação de padrões alelo específicos, adotados pelos epitopos na fenda do MHC, permitiu o desenvolvimento de uma estratégia in silico para a construção de complexos pMHC, através do uso combinado de Docking Molecular e Minimização de Energia (D1-EM-D2). Esta abordagem inovadora foi aplicada para a construção de 10 complexos apresentando peptídeos sintéticos e 28 complexos apresentando variantes naturais, todos no contexto do alelo de MHC humano HLAA* 02:01. A superfície destes complexos foi posteriormente avaliada quanto à topologia, distribuição de cargas e área acessível ao solvente. Os resultados foram utilizados para agrupar as variantes de acordo com a similaridade com o complexo apresentando o peptídeo selvagem, sendo estes agrupamentos confrontados com os resultados previamente observados in vitro por Fytili e colaboradores. Esta análise, corroborada pela utilização de métodos estatísticos multivariados, permitiu evidenciar o compartilhamento de características estruturais entre os complexos que estimulavam resposta in vitro, bem como identificar possíveis aspectos moleculares responsáveis pela abolição da resposta imune celular contra determinadas variantes de HCV. Este trabalho sugere a análise estrutural in silico de complexos pMHC como uma importante ferramenta no desenvolvimento de vacinas, permitindo a predição do impacto de mutações de escape viral e a seleção de epitopos com potencial para induzir respostas imunes poli-específicas (cross-reactive immune responses). / Recognition of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) is the final step of an important intracellular pathway, responsible for presenting endogenous peptides. This route allows the Immune System to perform a persistent surveillance of the cytoplasmic content of all nucleated cells, being a pivotal mechanism in antiviral and antitumoral defense. The understanding of molecular issues underlying the stimulation of a given T cell population by a specific peptide:MHC (pMHC) complex is essential for vaccine development, having special application to study the immunity against Hepatits C Virus (HCV). In a recent work, Paraskevi Fytili and colleagues evaluated the immunogenicity of an HCV-NS31073 variants subset against a CTL population previously stimulated with the wild-type epitope. Both natural and synthetic variants were used, and a large variation of IFN-gamma production by wildtype- specific T cells was observed. In this work, we intend to evaluate this variability at molecular level, through bioinformatics approaches. The prior identification of allele-specific patterns, presented by epitopes in the MHC cleft, allowed the development of a strategy for in silico construction of pMHC complexes, combining Molecular Docking and Energy Minimization (D1- EM-D2). This innovative approach was used to build 10 complexes presenting synthetic peptides and 28 complexes presenting naturally occurring variants, all in the context of human MHC allele HLA-A*02:01. The molecular surface of these complexes was further evaluated regarding its topology, electrostatic potential and Accessible Surface Area (ASA). Resulting data was used to group the variants according to its similarity with the wild-type-presenting complex, being these groups confronted with in vitro data, previously published by Fytili et al. This analysis, corroborated by multivariate statistical methods, has highlighted the sharing of structural aspects among complexes that stimulate response in vitro, as well as possible molecular issues responsible for abrogation of cellular immune response against certain HCV variants. This work suggests structural in silico analysis of pMHC complexes as a reliable tool for vaccine development, affording to predict the impact of viral escape mutations and selection of epitopes with potential to induce cross-reactive immune responses.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Objetivos: Analisar o desfecho perinatal da Aloimunização eritrocitária não-relacionada ao antígeno RhD. De forma complementar, confrontar os resultados perinatais com os da Aloimunização RhD e com aqueles de gestantes Rh- não-sensibilizadas. Método: Estudo observacional descritivo realizado no período de Janeiro de 2000 a Julho de 2005. Foram avaliadas 15 gestantes sensibilizadas por anticorpos não-D (grupo A), 55 grávidas Rhsensibilizadas pelo anti-D (grupo B) e 130 gestantes Rh- não-sensibilizadas (grupo controle C). Foram apurados os seguintes parâmetros relativos à gestante e ao recémnascido: título do anticorpo, alterações ultra-sonográficas ao longo do acompanhamento pré-natal, transfusão intra-uterina, via de parto, idade gestacional ao nascimento, peso ao nascimento, índice de Apgar no quinto minuto, hematócrito do recém-nascido, necessidade de transfusão e/ou exsanguino transfusão no período neonatal, tempo de internação no berçário, natimortalidade e mortalidade no período neonatal. Resultados: No grupo A encontramos sete gestantes sensibilizadas por anticorpos do sistema Lewis, três por anticorpos do sistema Kell, três por anticorpos relacionados ao sistema MNS e duas pelo sistema Diego. Título de anticorpo ≥ 1/16 foi encontrado em todas as pacientes do grupo B e em 27% do grupo A. As alterações ultra-sonográficas estiveram presentes de maneira semelhante entre as grávidas dos grupos A e B (20% e 25%). Transfusão intra-uterina, embora mais freqüente no grupo B, em relação ao grupo A (20% e 7%), não apresentou significância estatística. O parto cesáreo foi realizado de forma crescente nos grupos C, A e B (44%, 53% e 78%). O parto pré-termo teve maior incidência no grupo B em comparação aos grupos A e C (40%, 27% e 7%), assim como o baixo peso ao nascer (39%, 27% e 7%). Índice de Apgar < 7 no 5º minuto foi semelhante entre os três grupos. O hematócrito médio, obtido de sangue do cordão umbilical, foi significativamente maior entre os recém-nascidos do grupo A, em relação ao grupo B (43% e 40,5%). Transfusão e/ou exsanguino transfusão foram indicadas mais vezes nos infantes do grupo B em relação àqueles dos grupos A e C (69%, 14% e 1%). Internação prolongada no berçário (maior que três dias) foi mais encontrada também no grupo B, quando comparada aos grupos A e C ( 75%, 14% e 2%). Verificaram-se quatro óbitos intra-uterinos, um no grupo A, dois no grupo B e um no grupo C. Nenhum óbito foi registrado no período neonatal entre infantes dos grupos A e C, enquanto no grupo B, três recém-nascidos tiveram êxito letal. Conclusões: A Aloimunização eritrocitária não-relacionada ao antígeno D pode determinar quadro de Doença hemolítica perinatal grave, com necessidade de tratamento intra-uterino. Em comparação à Aloimunização RhD, no entanto, determina melhor desfecho perinatal, considerando-se o hematócrito ao nascimento, a necessidade de transfusão e/ou exsanguino transfusão no período neonatal, o tempo de internação no berçário e o decesso perinatal. / Objectives: Evaluate perinatal outcomes of non-D alloimmunization. Additionally to compare perinatal results with those of D alloimmunized pregnancies and RhD negative not sensitized. Methods: Descriptive observational study with a control group. The study involved 200 women examined between January 2000 and July 2005. Patients were divided in three groups: 15 non-D alloimmunized pregnant (group A), 55 D alloimmunized pregnant (group B) and 130 RhD negative women not sensitized (control group – C). Obstetric and neonatal variables analyzed were: antibody titer, ultrasound findings during pregnancy, intrauterine transfusion, mode and timing of delivery, birthweight, 5-minute Apgar score, neonatal hematocrit, need for neonatal transfusion or exchange transfusion, duration of neonatal stay, intrauterine and neonatal death. Results: Group A comprised 7 patients with Lewis sensitization, 3 with Kell sensitization, 3 with MNS sensitization and 2 with antibodies against Diego system antigens. Antibody titer ≥ 1/16 were seen in all group B patients and in 27% of group A pregnant. Abnormal ultrasound findings were similar between group A and B (20% and 25%). Intrauterine transfusion although more frequent in group B, compared to group A, did not reach statistically significance (20% e 7%). Rate of cesarean deliveries was crescent in C, A and B groups (44%, 53% and 78%). Prematurity was more incident in group B, compared to A and C groups (40%, 27% and 7%), and the same was found related to the low birthweight (39%, 27% e 7%). There were no significant differences regarding the 5-minute Apgar score between all groups. Mean neonatal hematocrit was higher in group B than in group A (43% and 40,5%). The need for neonatal transfusion or exchange transfusion was higher among group B infants, compared to A and C groups (69%, 14% and 1%). Neonatal stay was longer in group B newborn, in comparison to A and C groups (75%, 14% and 2%). There were 4 intrauterine deaths, one in group A, two in group B and one in group C. No death in the neonatal period was registered in group A and C infants while it occurred in three liveborns of group B. Conclusions: Non-D alloimmunization may cause hemolytic disease severe enough to require intrauterine treatment. Compared to D alloimmunization, yelds better perinatal results taking into consideration neonatal hematocrit, need for neonatal transfusion or exchange transfusion, duration of neonatal stay and perinatal mortality / BV UNIFESP: Teses e dissertações

LEAL, Joames Kauffimann Freitas. Diagnóstico da esquistossomose mansoni em área de baixa endemicidade através do POC-CCA : comparação com outros métodos e avaliação pós-tratamento. 2014. 94 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-09T15:31:37Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_jkfleal.pdf: 1375247 bytes, checksum: 86a7095d3b51d1061a42cbd65c20b9fa (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-09T15:48:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_jkfleal.pdf: 1375247 bytes, checksum: 86a7095d3b51d1061a42cbd65c20b9fa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-09T15:48:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_jkfleal.pdf: 1375247 bytes, checksum: 86a7095d3b51d1061a42cbd65c20b9fa (MD5) Previous issue date: 2014 / The detection of circulating antigens has been an alternative to the problems with the diagnosis of schistosomiasis, the disease that affects approximately 200 million people in 74 countries, worldwide. A newly developed immunoassay to detection of CCA (POC-CCA, point- of-care) in urine have shown high sensitivity and specificity for the schistosomiasis study . However, the most of all studies was carryed in areas of high endemicity in Africa, and there is a need for more studies to verify this test’s diagnostic accuracy in low endemic areas and their geographical differences. Our aim was to evaluate the effectiveness of POC-CCA as diagnostic of schistosomiasis, comparing it with a parasitological method and a linked immunosordent method and to evaluate how the POC-CCA behaves after chemotherapy, in residents of an area of low endemicity. The study was conducted for six months in Banananeiras, a village in Capistrano, Ceará, Brazil. Stool (Kato-Katz), blood (SWAP-ELISA) and urine (POC-CCA) were used to perform the tests. The community had 297 inhabitants, 285 of these agreed to participate in the study, and 258 (190 adults and 68 children) gave the three samples. Before treatment, the prevalence of S. mansoni, as determined by triplicate Kato-Katz, POC-CCA considering “P=trace”, POC-CCA considering “N=trace” and SWAP-ELISA was 1,6%, and 40,7%, respectively. The Kato-Katz method had a sensitivity lower than was expected and SWAP-ELISA showed up discordant results. Nevertheless, the results of our study show high sensitivity and specificity of POC-CCA, however, the gold standard chosen for the comparisons may have influenced the results. The patients were treated and re-evaluated by immunoassay, three and six weeks after treatment. POC-CCA used in the post-treatment evaluation and when we compared “P=trace” against “N=trace”, we found a higher percentage of individuals that became negative, considering “P=trace”; although all adults had negated, considering N=trace. Although, six weeks proved to be the best time for reassessment after treatment. / A detecção de antígenos circulante vem se mostrando uma alternativa para os problemas com o diagnóstico da esquistossomose, doença que acomete cerca de 200 milhões de pessoas em 74 países. Um teste imunocromatográfico recém-desenvolvido para a detecção de CCA (POC-CCA, point-of-care) na urina mostrou-se de alta sensibilidade bem como de alta especificidade para o estudo da esquistossomose. A maioria dos estudos ocorreu em zonas de alta endemicidade, na África, e há a necessidade de mais trabalhos para se verificar a precisão diagnóstica do teste em zonas de baixa endemicidade para a esquistossomose e suas diferenças geográficas. Nosso objetivo foi avaliar a eficácia deste kit de diagnóstico para esquistossomose mansoni que detecta o CCA (antígeno Catódico Circulante), em comparação com um método parasitológico e um imunológico, e avaliá-lo como diagnóstico após tratamento quimioterápico, em moradores de uma área de baixa endemicidade. O estudo foi realizado na localidade de Bananeiras, Capistrano, Ceará num período de cerca de seis meses desde a entrada na comunidade até o resultado da 2ª reavaliação. Para a realização dos testes foram usados fezes (Kato-Katz), sangue (SWAP-ELISA) e urina (POC-CCA). A comunidade é composta por 297 habitantes, 285 destes aceitaram participar do estudo e 258 entregaram as três amostras - 118 indivíduos do sexo masculino e 140 do sexo feminino. enquanto que 4 indivíduos (1,6%) se apresentaram positivos segundo o método de Kato-Katz e 105 (40,7%) reativaram no ELISA-SWAP. A técnica POC-CCA é um método prático e rápido, assim se tornando uma ferramenta útil em campo. Os resultados obtidos em nosso estudo mostram alta sensibilidade e especificidade do método, entretanto o padrão-ouro escolhido para as comparações pode ter influenciado os resultados. Os pacientes foram tratados e reavaliados pelo teste imunocromatográfico, três e seis semanas após o tratamento. Utilizado o POC-CCA na avaliação pós-tratamento e comparando T=P com T=N, verificamos que um maior percentual de indivíduos negativou, quando T=P; embora todos os adultos tenham negativado, quando T=N.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-24T15:13:59Z No. of bitstreams: 1 2016_TarcilaZuleicaZaparolliLopes.pdf: 1936810 bytes, checksum: 868908728b6e0749bcb8cd9988271b4c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-02T13:05:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_TarcilaZuleicaZaparolliLopes.pdf: 1936810 bytes, checksum: 868908728b6e0749bcb8cd9988271b4c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-02T13:05:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_TarcilaZuleicaZaparolliLopes.pdf: 1936810 bytes, checksum: 868908728b6e0749bcb8cd9988271b4c (MD5) / Em 1997, foi aprovado especificamente para o tratamento de pacientes com LNH de baixo grau (folicular) ou linfomas foliculares agressivos non-Hodgkin, o anticorpo recombinante anti-CD20: Rituximabe (MabThera®, Rituxan). Esse anticorpo, causa uma depleção seletiva e transitória de ambas subpopulações de células B CD20 positivas, normais ou malignas, dentro de etapas chaves da ontogenia das células B. Neste trabalho, objetivou-se a expressão, produção e purificação de fragmentos de anticorpos na forma FvFc específicos para o antígeno humano CD20, por meio de células de ovário de hamster chinês versão K1 (CHO-K1). Foram selecionadas duas versões scFvs humanizadas, contendo as CDRs do anticorpo monoclonal quimérico Rituximabe e uma versão scFv murina similar ao anticorpo original. Posteriormente, essas versões foram transferidas para o vetor de expressão em células de mamíferos pCOMIRES∆600. Esse vetor possui os genes que codificam os domínios CH2 e CH3 do fragmento cristalizável de imunoglobulina humana IgG, de forma que a proteína liberada pela célula de mamífero corresponda ao fragmento FvFc do anticorpo. Após a finalização das etapas de clonagens, as células CHO-K1 foram utilizadas como sistema de expressão e produção de anticorpos. Essas células foram mantidas na presença do antibiótico geneticina para a seleção da população mista de células CHO-K1 produtoras dos FvFcs recombinantes. Os sobrenadantes de cultura foram avaliados quanto á presença de FvFc por meio de imunodetecção ELISA. Posteriormente, foram submetidos a uma cromatografia de afinidade, utilizando a coluna HITRAP protein A HP. Após a purificação as frações coletadas da coluna, foram analisadas quanto ao grau de pureza destes fragmentos por meio do gel SDS-PAGE e Wersten-Blot. Com esses resultados foi possível realizar análises da capacidade de ligação das proteínas recombinantes por meio de citometria de fluxo. Os resultados também sugerem que é possível propor avaliações das proteínas recombinantes quanto à estabilidade conformacional, e em relação as funções efetoras realizadas pelo rituximabe. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In 1997 was approved specifically for treating patients with low-grade NHL (follicular) or aggressive follicular non-Hodgkin lymphomas, anti-CD20 recombinant antibody: Rituximab (MabThera, Rituxan). This antibody causes a selective and transient depletion of both subpopulations of CD20 positive, normal or malignant, within key steps of B cell ontogeny This study aimed to expression, production and purification of antibody fragments in the form FvFc specific to human CD20 antigen, using Chinese hamster ovary cells version K1 (CHO-K1). Two versions of humanized scFvs were selected, containing the CDRs of the chimeric monoclonal antibody Rituximab and a scFv version similar to the original murine antibody. Subsequently, these versions were transferred to the expression vector into mammalian cells pCOMIRES∆600. This vector has the gene encoding the CH2 and CH3 domains of the crystallizable fragment of human immunoglobulin IgG, so that the protein released from the mammalian cell FvFc corresponds to the fragment of the antibody. After completion of cloning steps, the CHO-K1 cells were used as expression system and production of antibodies. These cells were maintained in the presence of the antibiotic geneticin for selecting the mixed population of CHO-K1 cells producing the recombinant FvFcs. The culture supernatants were evaluated for the presence of FvFc by immunodetection ELISA. Subsequently, they were subjected to affinity chromatography using a HiTrap Protein A HP column. After purification the fractions collected from the column were analyzed for purity of these fragments by means of SDS-PAGE and gel blot Wersten. With these results it was possible to perform analyzes of the binding capacity of the recombinant proteins by flow cytometry. The results also suggest that it is possible to propose reviews of recombinant proteins for the conformational stability, and for the effector functions performed by rituximab.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:13:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448197-Texto+Completo-0.pdf: 1838361 bytes, checksum: 7924b0b15d7d6da94d6a3c9d188d1048 (MD5) Previous issue date: 2013 / Two species of parasites nematode of Angiostrongylidae family, genus Angiostrongylus intra-arterial localization are capable of human desease production: Angiostrongylus costaricensis and Angiostrongylus cantonensis. Both species are rodent’s parasites and the human infection is considered incidental. On humans, A. cantonensis cause eosinophilic meningitis and A. costaricensis cause abdominal angiostrongiliase. Since there is no elimination of parasitic forms in human infection, diagnosis becomes difficult and molecular methods are necessary. After years of discovery of angiostrongilíases, there are still many efforts in the study and development of a specific and sensitive diagnostic test capable of discriminating Angiostrongyliases of the other parasites. In this context, cross-reactivity becomes a problem in specificity of serologic tests. The main objective of this study was to analyze the sharing of antigens between Angiostrongylus spp. and parasites Strongyloides spp. , Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta and Toxocara canis, and identify these molecules shared.To obtain antigens, some rats were captures and their feces analyzed by the method of Baerman addition to being seeded Agar Plates. Were obtained larvae of Strongyloides spp. and Angiostrongylus spp. In pulmonary arteries were found 11 female worms and 2 male worms of A. cantonensis, which led to the first report of the occurrence of this parasite in Rio Grande do Sul. In the small intestine was obtained a Strongyloides spp worm and analysis of small intestine were obtained Hymenolepis diminuta worms. From the adult worms of parasites were obtained antigens used in this study. Furthermore, we used antigens of allergens such as peanut, tomato, strawberry and pollen. To identify shared antigens, proteins were separated by one and two dimensional electrophoresis technique assayed by Western blot using sera of patients with angiostrongyliases. All antigens were recognized by sera from patients infected with angiostrongyliases, being a total of fourteen bands identified as being immunogenic.The fourteen bands were cut out of polyacrylamide gels and analyzed by mass spectrometry. The proteins identified were: Phosphoenolpyruvate carboxykinase, heat shock protein 70 (HSP70), DAPPUDRAFT hypothetical protein, 60 kDa Chaperonin 5, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, sigma class GST Chain A, Glucose-6-phosphate isomerase, pyruvate dehydrogenase subunit E1, Glutamate dehydrogenase 2, arachin Ahy-1, Full = Allergen Ara h 1, clone P41B, Gly1. The data generated in this study show that there is sharing of antigens between organisms of different taxonomic groups, but also with allergens tested. Moreover, the description and analysis of shared molecular components can help in understanding the evolutionary history and phylogeny of these organisms. / Duas espécies de parasitos nematódeos da família Angiostrongylidae, do gênero Angiostrongylus de localização intra-arterial são capazes de produzir doença em humanos: Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis. Ambas as espécies são parasitos próprios de roedores e a infecção humana é considerada acidental. No homem, A. cantonensis é o causador da meningite eosinofílica e A. costaricensis causador da angiostrongilíase abdominal. Como não há eliminação de formas parasitárias na infecção humana, o diagnóstico se torna difícil e métodos moleculares se tornam necessários. Depois de anos da descoberta das angiostrongilíases, ainda há muitos esforços no estudo e desenvolvimento de um teste de diagnóstico específico e sensível capaz de discriminar as Angiostrongilíases de outras parasitoses. Neste contexto, a reatividade cruzada se torna um problema na especificidade de testes sorológicos. O objetivo principal deste trabalho foi analisar o compartilhamento de antígenos entre Angiostrongylus spp. e os parasitos Strongyloides spp. , Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis diminuta e Toxocara canis, assim como identificar essas moléculas compartilhadas.Para obtenção de antígenos, algumas ratazanas foram capturas e suas fezes analisadas através do método de Baerman além de terem sido semeadas em Placas de Ágar. Foram obtidas larvas de Strongyloides spp. e Angiostrongylus spp. Nas artérias pulmonares de uma ratazana foram encontrados 11 vermes fêmeas e 2 vermes machos de A. cantonensis, que deu origem ao primeiro relato da ocorrência deste parasito no Rio Grande do Sul. No intestino delgado foi obtido um verme de Strongyloides spp e da análise do intestino delgado foram obtidos vermes de Hymenolepis diminuta. A partir dos vermes adultos dos parasitos, foram obtidos os antígenos utilizados neste trabalho. Além disso, foram utilizados antígenos de alergenos como o amendoim, tomate, pólen e morango. Para identificação dos antígenos compartilhados, as proteínas foram separadas por eletroforese uni e bidimensional ensaiadas pela técnica de Western-Blot utilizando-se soro de pacientes com angiostrongilíases.Todos os antígenos foram reconhecidos pelo soro de pacientes infectados com angiostrongilíases, sendo um total de quatorze bandas identificadas como imunogênicas. As quartorze bandas foram recortadas dos géis de poliacrilamida e analisadas por espectrometria de massas. As proteínas identificadas foram: Fosfoenolpiruvato carboxiquinase, Proteína de choque térmico 70 (HSP70), Proteína hipotética DAPPUDRAFT, 60 kDa Chaperonina 5, Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, Cadeia A sigma classe GST, Glucose-6-fosfato isomerase, Piruvato desidrogenase subunidade E1, Glutamato desidrogenase 2 , arachin Ahy-1, Full=Allergen Ara h 1, clone P41B , Gly1. Os dados gerados no presente trabalho demonstram que há compartilhamento de antígenos entre organismos de diferentes grupos taxonômicos, como também com os alergenos testados. Além disso, a descrição e a análise de componentes moleculares compartilhados podem ajudar na compreensão da história evolutiva e da filogenia destes organismos.

A apresentação de peptídeos endógenos pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) e seu reconhecimento pelos Linfócitos T Citotóxicos representa a etapa final de uma importante via intracelular. Esta via permite ao sistema imune realizar uma constante vigilância acerca do conteúdo citoplasmático de todas as células nucleadas do organismo, sendo um mecanismo central na defesa antitumoral e antiviral. A compreensão dos detalhes moleculares que levam um dado complexo peptídeo:MHC (pMHC) a estimularem uma população de linfócitos é vital para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias, tendo especial aplicação no entendimento da resposta imune ao Vírus da Hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus). Em um trabalho publicado em 2008, Paraskevi Fytili e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de um conjunto de variantes do epitopo imunodominante HCV-NS31073 (CV/INGVCWTV) frente a uma população de linfócitos previamente estimulada com o epitopo selvagem. Foram utilizadas tanto variantes naturais quanto sintéticas, tendo sido observado uma grande variação na produção de IFN-gama pelas células específicas contra o epitopo selvagem. O presente trabalho pretende avaliar esta variabilidade em um nível molecular, através do uso de ferramentas de bioinformática. A prévia identificação de padrões alelo específicos, adotados pelos epitopos na fenda do MHC, permitiu o desenvolvimento de uma estratégia in silico para a construção de complexos pMHC, através do uso combinado de Docking Molecular e Minimização de Energia (D1-EM-D2). Esta abordagem inovadora foi aplicada para a construção de 10 complexos apresentando peptídeos sintéticos e 28 complexos apresentando variantes naturais, todos no contexto do alelo de MHC humano HLAA* 02:01. A superfície destes complexos foi posteriormente avaliada quanto à topologia, distribuição de cargas e área acessível ao solvente. Os resultados foram utilizados para agrupar as variantes de acordo com a similaridade com o complexo apresentando o peptídeo selvagem, sendo estes agrupamentos confrontados com os resultados previamente observados in vitro por Fytili e colaboradores. Esta análise, corroborada pela utilização de métodos estatísticos multivariados, permitiu evidenciar o compartilhamento de características estruturais entre os complexos que estimulavam resposta in vitro, bem como identificar possíveis aspectos moleculares responsáveis pela abolição da resposta imune celular contra determinadas variantes de HCV. Este trabalho sugere a análise estrutural in silico de complexos pMHC como uma importante ferramenta no desenvolvimento de vacinas, permitindo a predição do impacto de mutações de escape viral e a seleção de epitopos com potencial para induzir respostas imunes poli-específicas (cross-reactive immune responses). / Recognition of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) is the final step of an important intracellular pathway, responsible for presenting endogenous peptides. This route allows the Immune System to perform a persistent surveillance of the cytoplasmic content of all nucleated cells, being a pivotal mechanism in antiviral and antitumoral defense. The understanding of molecular issues underlying the stimulation of a given T cell population by a specific peptide:MHC (pMHC) complex is essential for vaccine development, having special application to study the immunity against Hepatits C Virus (HCV). In a recent work, Paraskevi Fytili and colleagues evaluated the immunogenicity of an HCV-NS31073 variants subset against a CTL population previously stimulated with the wild-type epitope. Both natural and synthetic variants were used, and a large variation of IFN-gamma production by wildtype- specific T cells was observed. In this work, we intend to evaluate this variability at molecular level, through bioinformatics approaches. The prior identification of allele-specific patterns, presented by epitopes in the MHC cleft, allowed the development of a strategy for in silico construction of pMHC complexes, combining Molecular Docking and Energy Minimization (D1- EM-D2). This innovative approach was used to build 10 complexes presenting synthetic peptides and 28 complexes presenting naturally occurring variants, all in the context of human MHC allele HLA-A*02:01. The molecular surface of these complexes was further evaluated regarding its topology, electrostatic potential and Accessible Surface Area (ASA). Resulting data was used to group the variants according to its similarity with the wild-type-presenting complex, being these groups confronted with in vitro data, previously published by Fytili et al. This analysis, corroborated by multivariate statistical methods, has highlighted the sharing of structural aspects among complexes that stimulate response in vitro, as well as possible molecular issues responsible for abrogation of cellular immune response against certain HCV variants. This work suggests structural in silico analysis of pMHC complexes as a reliable tool for vaccine development, affording to predict the impact of viral escape mutations and selection of epitopes with potential to induce cross-reactive immune responses.

A apresentação de peptídeos endógenos pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) e seu reconhecimento pelos Linfócitos T Citotóxicos representa a etapa final de uma importante via intracelular. Esta via permite ao sistema imune realizar uma constante vigilância acerca do conteúdo citoplasmático de todas as células nucleadas do organismo, sendo um mecanismo central na defesa antitumoral e antiviral. A compreensão dos detalhes moleculares que levam um dado complexo peptídeo:MHC (pMHC) a estimularem uma população de linfócitos é vital para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias, tendo especial aplicação no entendimento da resposta imune ao Vírus da Hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus). Em um trabalho publicado em 2008, Paraskevi Fytili e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de um conjunto de variantes do epitopo imunodominante HCV-NS31073 (CV/INGVCWTV) frente a uma população de linfócitos previamente estimulada com o epitopo selvagem. Foram utilizadas tanto variantes naturais quanto sintéticas, tendo sido observado uma grande variação na produção de IFN-gama pelas células específicas contra o epitopo selvagem. O presente trabalho pretende avaliar esta variabilidade em um nível molecular, através do uso de ferramentas de bioinformática. A prévia identificação de padrões alelo específicos, adotados pelos epitopos na fenda do MHC, permitiu o desenvolvimento de uma estratégia in silico para a construção de complexos pMHC, através do uso combinado de Docking Molecular e Minimização de Energia (D1-EM-D2). Esta abordagem inovadora foi aplicada para a construção de 10 complexos apresentando peptídeos sintéticos e 28 complexos apresentando variantes naturais, todos no contexto do alelo de MHC humano HLAA* 02:01. A superfície destes complexos foi posteriormente avaliada quanto à topologia, distribuição de cargas e área acessível ao solvente. Os resultados foram utilizados para agrupar as variantes de acordo com a similaridade com o complexo apresentando o peptídeo selvagem, sendo estes agrupamentos confrontados com os resultados previamente observados in vitro por Fytili e colaboradores. Esta análise, corroborada pela utilização de métodos estatísticos multivariados, permitiu evidenciar o compartilhamento de características estruturais entre os complexos que estimulavam resposta in vitro, bem como identificar possíveis aspectos moleculares responsáveis pela abolição da resposta imune celular contra determinadas variantes de HCV. Este trabalho sugere a análise estrutural in silico de complexos pMHC como uma importante ferramenta no desenvolvimento de vacinas, permitindo a predição do impacto de mutações de escape viral e a seleção de epitopos com potencial para induzir respostas imunes poli-específicas (cross-reactive immune responses). / Recognition of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) is the final step of an important intracellular pathway, responsible for presenting endogenous peptides. This route allows the Immune System to perform a persistent surveillance of the cytoplasmic content of all nucleated cells, being a pivotal mechanism in antiviral and antitumoral defense. The understanding of molecular issues underlying the stimulation of a given T cell population by a specific peptide:MHC (pMHC) complex is essential for vaccine development, having special application to study the immunity against Hepatits C Virus (HCV). In a recent work, Paraskevi Fytili and colleagues evaluated the immunogenicity of an HCV-NS31073 variants subset against a CTL population previously stimulated with the wild-type epitope. Both natural and synthetic variants were used, and a large variation of IFN-gamma production by wildtype- specific T cells was observed. In this work, we intend to evaluate this variability at molecular level, through bioinformatics approaches. The prior identification of allele-specific patterns, presented by epitopes in the MHC cleft, allowed the development of a strategy for in silico construction of pMHC complexes, combining Molecular Docking and Energy Minimization (D1- EM-D2). This innovative approach was used to build 10 complexes presenting synthetic peptides and 28 complexes presenting naturally occurring variants, all in the context of human MHC allele HLA-A*02:01. The molecular surface of these complexes was further evaluated regarding its topology, electrostatic potential and Accessible Surface Area (ASA). Resulting data was used to group the variants according to its similarity with the wild-type-presenting complex, being these groups confronted with in vitro data, previously published by Fytili et al. This analysis, corroborated by multivariate statistical methods, has highlighted the sharing of structural aspects among complexes that stimulate response in vitro, as well as possible molecular issues responsible for abrogation of cellular immune response against certain HCV variants. This work suggests structural in silico analysis of pMHC complexes as a reliable tool for vaccine development, affording to predict the impact of viral escape mutations and selection of epitopes with potential to induce cross-reactive immune responses.