Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:44Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10775a.pdf: 1931438 bytes, checksum: fb3a11003ba43c09b447f6ea1696ef2c (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:44Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10775a.pdf: 1931438 bytes, checksum: fb3a11003ba43c09b447f6ea1696ef2c (MD5) Publico-10775b.pdf: 1682906 bytes, checksum: f124bcedf8bfc29c924ec49679d33e2a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:44Z : No. of bitstreams: 3 Publico-10775a.pdf: 1931438 bytes, checksum: fb3a11003ba43c09b447f6ea1696ef2c (MD5) Publico-10775b.pdf: 1682906 bytes, checksum: f124bcedf8bfc29c924ec49679d33e2a (MD5) Publico-10775c.pdf: 1572132 bytes, checksum: 8590397c8daaf6f5780c084660de3854 (MD5) / Trypanosoma dionisii é um tripanosomatídeo de morcegos filogeneticamente muito próximo ao Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas que, segundo a Organização Mundial de Saúde, afeta 18 milhões de pessoas na América Latina além de ocorrer aproximadamente 300.000 novas infecções anualmente. Durante seu ciclo de vida, T. dionisii passa por diferentes formas evolutivas alternando entre hospedeiro vertebrado e invertebrado. As formas são: epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas no hospedeiro invertebrado e tripomastigotas sanguíneas e amastigotas no hospedeiro vertebrado. As formas tripomastigotas metacíclicas são capazes de invadir e se multiplicar in vitro em diversos tipos de células de mamíferos. O presente trabalho teve como objetivo observar características da ultraestrutura da espécie, alguns aspectos de seu mecanismo de invasão e identificar possível compartilhamento de epítopos entre as espécies T. dionisii e T. cruzi através de ensaios utilizando anticorpos monoclonais anti-T. cruzi. Assim como ocorre com T. cruzi, as formas tripomastigotas metacíclicas de T. dionisii recrutam lisossomos durante a invasão da célula hospedeira e permanecem em vacúolos LAMP-1 positivos por várias horas. Nossos resultados mostraram que aproximadamente 10% das formas tripomastigotas metacíclicas LAMP-1 positivas de T. dionisii, transformam-se em amastigotas em compartimentos LAMP-1 positivos, permanecendo nestes vacúolos por até 96 horas. Além disto, o pré-tratamento da célula hospedeira com nocodazol (composto que despolimeriza microtúbulos, impedindo o recrutamento lisossomal) não alterou a invasão do parasita, enquanto o prétratamento com wortmanina (composto que inibe a invasão via PI3-quinase e invaginação de membrana) inibiu significativamente a invasão. Estes dados sugerem que a fusão lisossomal talvez não seja um evento crítico para o estabelecimento de uma infecção bem sucedida de T. dionisii. A análise da expressão de epítopos definidos por anticorpos monoclonais anti-amastigotas de T. cruzi mostra uma maior proximidade imuno-reativa entre T. dionisii e T. cruzi da cepa G, pois T. dionisii reagiu com apenas um dos anticorpos anti-T. cruzi da cepa CL testados. Quanto à ultraestrutura T. dionisii é bastante semelhante a T. cruzi, com exceção do núcleo, que em T. dionisii apresenta um característico padrão de condensação da cromatina. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A apresentação de peptídeos endógenos pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) e seu reconhecimento pelos Linfócitos T Citotóxicos representa a etapa final de uma importante via intracelular. Esta via permite ao sistema imune realizar uma constante vigilância acerca do conteúdo citoplasmático de todas as células nucleadas do organismo, sendo um mecanismo central na defesa antitumoral e antiviral. A compreensão dos detalhes moleculares que levam um dado complexo peptídeo:MHC (pMHC) a estimularem uma população de linfócitos é vital para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias, tendo especial aplicação no entendimento da resposta imune ao Vírus da Hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus). Em um trabalho publicado em 2008, Paraskevi Fytili e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de um conjunto de variantes do epitopo imunodominante HCV-NS31073 (CV/INGVCWTV) frente a uma população de linfócitos previamente estimulada com o epitopo selvagem. Foram utilizadas tanto variantes naturais quanto sintéticas, tendo sido observado uma grande variação na produção de IFN-gama pelas células específicas contra o epitopo selvagem. O presente trabalho pretende avaliar esta variabilidade em um nível molecular, através do uso de ferramentas de bioinformática. A prévia identificação de padrões alelo específicos, adotados pelos epitopos na fenda do MHC, permitiu o desenvolvimento de uma estratégia in silico para a construção de complexos pMHC, através do uso combinado de Docking Molecular e Minimização de Energia (D1-EM-D2). Esta abordagem inovadora foi aplicada para a construção de 10 complexos apresentando peptídeos sintéticos e 28 complexos apresentando variantes naturais, todos no contexto do alelo de MHC humano HLAA* 02:01. A superfície destes complexos foi posteriormente avaliada quanto à topologia, distribuição de cargas e área acessível ao solvente. Os resultados foram utilizados para agrupar as variantes de acordo com a similaridade com o complexo apresentando o peptídeo selvagem, sendo estes agrupamentos confrontados com os resultados previamente observados in vitro por Fytili e colaboradores. Esta análise, corroborada pela utilização de métodos estatísticos multivariados, permitiu evidenciar o compartilhamento de características estruturais entre os complexos que estimulavam resposta in vitro, bem como identificar possíveis aspectos moleculares responsáveis pela abolição da resposta imune celular contra determinadas variantes de HCV. Este trabalho sugere a análise estrutural in silico de complexos pMHC como uma importante ferramenta no desenvolvimento de vacinas, permitindo a predição do impacto de mutações de escape viral e a seleção de epitopos com potencial para induzir respostas imunes poli-específicas (cross-reactive immune responses). / Recognition of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) is the final step of an important intracellular pathway, responsible for presenting endogenous peptides. This route allows the Immune System to perform a persistent surveillance of the cytoplasmic content of all nucleated cells, being a pivotal mechanism in antiviral and antitumoral defense. The understanding of molecular issues underlying the stimulation of a given T cell population by a specific peptide:MHC (pMHC) complex is essential for vaccine development, having special application to study the immunity against Hepatits C Virus (HCV). In a recent work, Paraskevi Fytili and colleagues evaluated the immunogenicity of an HCV-NS31073 variants subset against a CTL population previously stimulated with the wild-type epitope. Both natural and synthetic variants were used, and a large variation of IFN-gamma production by wildtype- specific T cells was observed. In this work, we intend to evaluate this variability at molecular level, through bioinformatics approaches. The prior identification of allele-specific patterns, presented by epitopes in the MHC cleft, allowed the development of a strategy for in silico construction of pMHC complexes, combining Molecular Docking and Energy Minimization (D1- EM-D2). This innovative approach was used to build 10 complexes presenting synthetic peptides and 28 complexes presenting naturally occurring variants, all in the context of human MHC allele HLA-A*02:01. The molecular surface of these complexes was further evaluated regarding its topology, electrostatic potential and Accessible Surface Area (ASA). Resulting data was used to group the variants according to its similarity with the wild-type-presenting complex, being these groups confronted with in vitro data, previously published by Fytili et al. This analysis, corroborated by multivariate statistical methods, has highlighted the sharing of structural aspects among complexes that stimulate response in vitro, as well as possible molecular issues responsible for abrogation of cellular immune response against certain HCV variants. This work suggests structural in silico analysis of pMHC complexes as a reliable tool for vaccine development, affording to predict the impact of viral escape mutations and selection of epitopes with potential to induce cross-reactive immune responses.

Diariamente, o organismo humano é desafiado através da invasão de patógenos. No caso da invasão viral, o principal meio de defesa ocorre através do Receptor de Linfócito T (TCR), o qual interage com o peptídeo viral (epitopo) que é apresentado pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I (MHC-I). Dada a imensidão de epitopos possíveis e a limitação do organismo em possuir um único TCR para reconhecer cada antígeno, o sistema imunológico desenvolveu o mecanismo de reatividade cruzada, através do qual um mesmo TCR pode reconhecer diferentes epitopos virais. Nesse trabalho nos propomos a estudar a seqüência da proteína de nucleocapsídeo (proteína N) de diferentes espécies do gênero Hantavírus através de uma abordagem in silico, utilizando ferramentas de imunoinformática. No primeiro trabalho (capítulo dois) apresentamos uma revisão sobre o uso de ferramentas de imunoinformática na resolução de problemas relacionados à imunogenicidade. No terceiro capítulo, analisamos a seqüência de aminoácidos da proteína N de 34 espécies do gênero Hantavírus. Nossos resultados mostraram que epitopos murinos localizam-se preferencialmente em áreas conservadas dentro do alinhamento de sequencias da proteína N. Duas regiões da proteína N – N94-101 e N180-188 - de três espécies virais – Sin Nombre (SNV), Puumala (PUUV) e Hantaan (HTNV) - possuem aminoácidos com grande similaridade físico-química, mas geram respostas imunológicas diferenciadas. Portanto, no quarto capítulo, nosso objetivo foi construir os complexos pMHC referentes às regiões N94-101 e N180-188 da proteína N das espécies SNV, PUUV e HTNV através de uma abordagem in silico desenvolvida pelo nosso grupo e analisar as diferenças estruturais e moleculares que possam estar envolvidas na indução da resposta imunológica diferenciada observada in vitro. Nossos resultados mostram uma diferença no padrão de cargas entre os complexos pMHC de SNV/PUUV e HTNV referente à região N94-101 e uma diferença na topologia referente à região N180-188. Nosso trabalho foi o primeiro a analisar os mecanismos de reatividade cruzada entre epitopos da proteína N de espécies virais do gênero Hantavírus a partir da construção de complexos pMHC partindo da estrutura primária dos epitopos. Ainda, ao final da dissertação, é apresentado um trabalho que visa, através da docagem e dinâmica molecular, diferenciar bons e maus ligantes de MHC-I. / The human organism is constantly challenged against several pathogens. In the viral context, the main defense occurs through T Lymphocyte Receptor (TCR) which interacts with the viral peptide (epitope) presented by the Major Histocompatibility Complex of class I (MHC-I). Since there is an infinitude of epitopes and the organism could not be able to accommodate one single TCR for each epitope, the immune system developed the cross-reactivity response, where the same TCR could recognize several viral epitopes. In this work, we studied the nucleocapside (N) protein sequence from several species of the Hantavirus genus through an in silico approach, using immunoinformatics tools. In the first work (second chapter) we presented a review about the use of immunoinformatics tools to solve issues concerning immunogenicity. In the third chapter, we analyzed the N protein sequence from 34 hantaviruses species. Our results have shown that murine epitopes are preferentially localized over conserved areas of the N protein alignment. Two N protein regions – N94-101 and N180-188 – from three different species – Sin Nombre (SNV), Puumala (PUUV) and Hantaan (HTNV) – have remarkable physical-chemical similarity, however, generated different immunological responses. Based on that, in the fourth chapter we aimed to construct pMHC complexes from N94-101 and N180-188 regions from SNV, PUUV and HTNV, through an in silico approach developed by our research group, to analyze structural and molecular differences that would be involved in the differential immunological response induction observed in vitro. Our results point to a difference of the charges distribution on the pMHC complexes from SNV/PUUV and HTNV in the N94-101 region and topology differences in the N180-188 region. Our work was the first to analyze the cross-reactivity mechanisms among epitopes of the N protein from hantaviruses species through in silico construction of pMHC complexes from linear epitope sequence. Also, at the end, it will be presented a work that uses molecular docking and molecular dynamics, attempting to differentiate good and bad MHC-I ligands.

Diariamente, o organismo humano é desafiado através da invasão de patógenos. No caso da invasão viral, o principal meio de defesa ocorre através do Receptor de Linfócito T (TCR), o qual interage com o peptídeo viral (epitopo) que é apresentado pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I (MHC-I). Dada a imensidão de epitopos possíveis e a limitação do organismo em possuir um único TCR para reconhecer cada antígeno, o sistema imunológico desenvolveu o mecanismo de reatividade cruzada, através do qual um mesmo TCR pode reconhecer diferentes epitopos virais. Nesse trabalho nos propomos a estudar a seqüência da proteína de nucleocapsídeo (proteína N) de diferentes espécies do gênero Hantavírus através de uma abordagem in silico, utilizando ferramentas de imunoinformática. No primeiro trabalho (capítulo dois) apresentamos uma revisão sobre o uso de ferramentas de imunoinformática na resolução de problemas relacionados à imunogenicidade. No terceiro capítulo, analisamos a seqüência de aminoácidos da proteína N de 34 espécies do gênero Hantavírus. Nossos resultados mostraram que epitopos murinos localizam-se preferencialmente em áreas conservadas dentro do alinhamento de sequencias da proteína N. Duas regiões da proteína N – N94-101 e N180-188 - de três espécies virais – Sin Nombre (SNV), Puumala (PUUV) e Hantaan (HTNV) - possuem aminoácidos com grande similaridade físico-química, mas geram respostas imunológicas diferenciadas. Portanto, no quarto capítulo, nosso objetivo foi construir os complexos pMHC referentes às regiões N94-101 e N180-188 da proteína N das espécies SNV, PUUV e HTNV através de uma abordagem in silico desenvolvida pelo nosso grupo e analisar as diferenças estruturais e moleculares que possam estar envolvidas na indução da resposta imunológica diferenciada observada in vitro. Nossos resultados mostram uma diferença no padrão de cargas entre os complexos pMHC de SNV/PUUV e HTNV referente à região N94-101 e uma diferença na topologia referente à região N180-188. Nosso trabalho foi o primeiro a analisar os mecanismos de reatividade cruzada entre epitopos da proteína N de espécies virais do gênero Hantavírus a partir da construção de complexos pMHC partindo da estrutura primária dos epitopos. Ainda, ao final da dissertação, é apresentado um trabalho que visa, através da docagem e dinâmica molecular, diferenciar bons e maus ligantes de MHC-I. / The human organism is constantly challenged against several pathogens. In the viral context, the main defense occurs through T Lymphocyte Receptor (TCR) which interacts with the viral peptide (epitope) presented by the Major Histocompatibility Complex of class I (MHC-I). Since there is an infinitude of epitopes and the organism could not be able to accommodate one single TCR for each epitope, the immune system developed the cross-reactivity response, where the same TCR could recognize several viral epitopes. In this work, we studied the nucleocapside (N) protein sequence from several species of the Hantavirus genus through an in silico approach, using immunoinformatics tools. In the first work (second chapter) we presented a review about the use of immunoinformatics tools to solve issues concerning immunogenicity. In the third chapter, we analyzed the N protein sequence from 34 hantaviruses species. Our results have shown that murine epitopes are preferentially localized over conserved areas of the N protein alignment. Two N protein regions – N94-101 and N180-188 – from three different species – Sin Nombre (SNV), Puumala (PUUV) and Hantaan (HTNV) – have remarkable physical-chemical similarity, however, generated different immunological responses. Based on that, in the fourth chapter we aimed to construct pMHC complexes from N94-101 and N180-188 regions from SNV, PUUV and HTNV, through an in silico approach developed by our research group, to analyze structural and molecular differences that would be involved in the differential immunological response induction observed in vitro. Our results point to a difference of the charges distribution on the pMHC complexes from SNV/PUUV and HTNV in the N94-101 region and topology differences in the N180-188 region. Our work was the first to analyze the cross-reactivity mechanisms among epitopes of the N protein from hantaviruses species through in silico construction of pMHC complexes from linear epitope sequence. Also, at the end, it will be presented a work that uses molecular docking and molecular dynamics, attempting to differentiate good and bad MHC-I ligands.

A apresentação de peptídeos endógenos pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) e seu reconhecimento pelos Linfócitos T Citotóxicos representa a etapa final de uma importante via intracelular. Esta via permite ao sistema imune realizar uma constante vigilância acerca do conteúdo citoplasmático de todas as células nucleadas do organismo, sendo um mecanismo central na defesa antitumoral e antiviral. A compreensão dos detalhes moleculares que levam um dado complexo peptídeo:MHC (pMHC) a estimularem uma população de linfócitos é vital para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias, tendo especial aplicação no entendimento da resposta imune ao Vírus da Hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus). Em um trabalho publicado em 2008, Paraskevi Fytili e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de um conjunto de variantes do epitopo imunodominante HCV-NS31073 (CV/INGVCWTV) frente a uma população de linfócitos previamente estimulada com o epitopo selvagem. Foram utilizadas tanto variantes naturais quanto sintéticas, tendo sido observado uma grande variação na produção de IFN-gama pelas células específicas contra o epitopo selvagem. O presente trabalho pretende avaliar esta variabilidade em um nível molecular, através do uso de ferramentas de bioinformática. A prévia identificação de padrões alelo específicos, adotados pelos epitopos na fenda do MHC, permitiu o desenvolvimento de uma estratégia in silico para a construção de complexos pMHC, através do uso combinado de Docking Molecular e Minimização de Energia (D1-EM-D2). Esta abordagem inovadora foi aplicada para a construção de 10 complexos apresentando peptídeos sintéticos e 28 complexos apresentando variantes naturais, todos no contexto do alelo de MHC humano HLAA* 02:01. A superfície destes complexos foi posteriormente avaliada quanto à topologia, distribuição de cargas e área acessível ao solvente. Os resultados foram utilizados para agrupar as variantes de acordo com a similaridade com o complexo apresentando o peptídeo selvagem, sendo estes agrupamentos confrontados com os resultados previamente observados in vitro por Fytili e colaboradores. Esta análise, corroborada pela utilização de métodos estatísticos multivariados, permitiu evidenciar o compartilhamento de características estruturais entre os complexos que estimulavam resposta in vitro, bem como identificar possíveis aspectos moleculares responsáveis pela abolição da resposta imune celular contra determinadas variantes de HCV. Este trabalho sugere a análise estrutural in silico de complexos pMHC como uma importante ferramenta no desenvolvimento de vacinas, permitindo a predição do impacto de mutações de escape viral e a seleção de epitopos com potencial para induzir respostas imunes poli-específicas (cross-reactive immune responses). / Recognition of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) is the final step of an important intracellular pathway, responsible for presenting endogenous peptides. This route allows the Immune System to perform a persistent surveillance of the cytoplasmic content of all nucleated cells, being a pivotal mechanism in antiviral and antitumoral defense. The understanding of molecular issues underlying the stimulation of a given T cell population by a specific peptide:MHC (pMHC) complex is essential for vaccine development, having special application to study the immunity against Hepatits C Virus (HCV). In a recent work, Paraskevi Fytili and colleagues evaluated the immunogenicity of an HCV-NS31073 variants subset against a CTL population previously stimulated with the wild-type epitope. Both natural and synthetic variants were used, and a large variation of IFN-gamma production by wildtype- specific T cells was observed. In this work, we intend to evaluate this variability at molecular level, through bioinformatics approaches. The prior identification of allele-specific patterns, presented by epitopes in the MHC cleft, allowed the development of a strategy for in silico construction of pMHC complexes, combining Molecular Docking and Energy Minimization (D1- EM-D2). This innovative approach was used to build 10 complexes presenting synthetic peptides and 28 complexes presenting naturally occurring variants, all in the context of human MHC allele HLA-A*02:01. The molecular surface of these complexes was further evaluated regarding its topology, electrostatic potential and Accessible Surface Area (ASA). Resulting data was used to group the variants according to its similarity with the wild-type-presenting complex, being these groups confronted with in vitro data, previously published by Fytili et al. This analysis, corroborated by multivariate statistical methods, has highlighted the sharing of structural aspects among complexes that stimulate response in vitro, as well as possible molecular issues responsible for abrogation of cellular immune response against certain HCV variants. This work suggests structural in silico analysis of pMHC complexes as a reliable tool for vaccine development, affording to predict the impact of viral escape mutations and selection of epitopes with potential to induce cross-reactive immune responses.

A apresentação de peptídeos endógenos pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) e seu reconhecimento pelos Linfócitos T Citotóxicos representa a etapa final de uma importante via intracelular. Esta via permite ao sistema imune realizar uma constante vigilância acerca do conteúdo citoplasmático de todas as células nucleadas do organismo, sendo um mecanismo central na defesa antitumoral e antiviral. A compreensão dos detalhes moleculares que levam um dado complexo peptídeo:MHC (pMHC) a estimularem uma população de linfócitos é vital para o desenvolvimento de vacinas e imunoterapias, tendo especial aplicação no entendimento da resposta imune ao Vírus da Hepatite C (HCV, do inglês Hepatitis C Virus). Em um trabalho publicado em 2008, Paraskevi Fytili e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de um conjunto de variantes do epitopo imunodominante HCV-NS31073 (CV/INGVCWTV) frente a uma população de linfócitos previamente estimulada com o epitopo selvagem. Foram utilizadas tanto variantes naturais quanto sintéticas, tendo sido observado uma grande variação na produção de IFN-gama pelas células específicas contra o epitopo selvagem. O presente trabalho pretende avaliar esta variabilidade em um nível molecular, através do uso de ferramentas de bioinformática. A prévia identificação de padrões alelo específicos, adotados pelos epitopos na fenda do MHC, permitiu o desenvolvimento de uma estratégia in silico para a construção de complexos pMHC, através do uso combinado de Docking Molecular e Minimização de Energia (D1-EM-D2). Esta abordagem inovadora foi aplicada para a construção de 10 complexos apresentando peptídeos sintéticos e 28 complexos apresentando variantes naturais, todos no contexto do alelo de MHC humano HLAA* 02:01. A superfície destes complexos foi posteriormente avaliada quanto à topologia, distribuição de cargas e área acessível ao solvente. Os resultados foram utilizados para agrupar as variantes de acordo com a similaridade com o complexo apresentando o peptídeo selvagem, sendo estes agrupamentos confrontados com os resultados previamente observados in vitro por Fytili e colaboradores. Esta análise, corroborada pela utilização de métodos estatísticos multivariados, permitiu evidenciar o compartilhamento de características estruturais entre os complexos que estimulavam resposta in vitro, bem como identificar possíveis aspectos moleculares responsáveis pela abolição da resposta imune celular contra determinadas variantes de HCV. Este trabalho sugere a análise estrutural in silico de complexos pMHC como uma importante ferramenta no desenvolvimento de vacinas, permitindo a predição do impacto de mutações de escape viral e a seleção de epitopos com potencial para induzir respostas imunes poli-específicas (cross-reactive immune responses). / Recognition of the Major Histocompatibility Complex (MHC) by Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs) is the final step of an important intracellular pathway, responsible for presenting endogenous peptides. This route allows the Immune System to perform a persistent surveillance of the cytoplasmic content of all nucleated cells, being a pivotal mechanism in antiviral and antitumoral defense. The understanding of molecular issues underlying the stimulation of a given T cell population by a specific peptide:MHC (pMHC) complex is essential for vaccine development, having special application to study the immunity against Hepatits C Virus (HCV). In a recent work, Paraskevi Fytili and colleagues evaluated the immunogenicity of an HCV-NS31073 variants subset against a CTL population previously stimulated with the wild-type epitope. Both natural and synthetic variants were used, and a large variation of IFN-gamma production by wildtype- specific T cells was observed. In this work, we intend to evaluate this variability at molecular level, through bioinformatics approaches. The prior identification of allele-specific patterns, presented by epitopes in the MHC cleft, allowed the development of a strategy for in silico construction of pMHC complexes, combining Molecular Docking and Energy Minimization (D1- EM-D2). This innovative approach was used to build 10 complexes presenting synthetic peptides and 28 complexes presenting naturally occurring variants, all in the context of human MHC allele HLA-A*02:01. The molecular surface of these complexes was further evaluated regarding its topology, electrostatic potential and Accessible Surface Area (ASA). Resulting data was used to group the variants according to its similarity with the wild-type-presenting complex, being these groups confronted with in vitro data, previously published by Fytili et al. This analysis, corroborated by multivariate statistical methods, has highlighted the sharing of structural aspects among complexes that stimulate response in vitro, as well as possible molecular issues responsible for abrogation of cellular immune response against certain HCV variants. This work suggests structural in silico analysis of pMHC complexes as a reliable tool for vaccine development, affording to predict the impact of viral escape mutations and selection of epitopes with potential to induce cross-reactive immune responses.

Diariamente, o organismo humano é desafiado através da invasão de patógenos. No caso da invasão viral, o principal meio de defesa ocorre através do Receptor de Linfócito T (TCR), o qual interage com o peptídeo viral (epitopo) que é apresentado pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I (MHC-I). Dada a imensidão de epitopos possíveis e a limitação do organismo em possuir um único TCR para reconhecer cada antígeno, o sistema imunológico desenvolveu o mecanismo de reatividade cruzada, através do qual um mesmo TCR pode reconhecer diferentes epitopos virais. Nesse trabalho nos propomos a estudar a seqüência da proteína de nucleocapsídeo (proteína N) de diferentes espécies do gênero Hantavírus através de uma abordagem in silico, utilizando ferramentas de imunoinformática. No primeiro trabalho (capítulo dois) apresentamos uma revisão sobre o uso de ferramentas de imunoinformática na resolução de problemas relacionados à imunogenicidade. No terceiro capítulo, analisamos a seqüência de aminoácidos da proteína N de 34 espécies do gênero Hantavírus. Nossos resultados mostraram que epitopos murinos localizam-se preferencialmente em áreas conservadas dentro do alinhamento de sequencias da proteína N. Duas regiões da proteína N – N94-101 e N180-188 - de três espécies virais – Sin Nombre (SNV), Puumala (PUUV) e Hantaan (HTNV) - possuem aminoácidos com grande similaridade físico-química, mas geram respostas imunológicas diferenciadas. Portanto, no quarto capítulo, nosso objetivo foi construir os complexos pMHC referentes às regiões N94-101 e N180-188 da proteína N das espécies SNV, PUUV e HTNV através de uma abordagem in silico desenvolvida pelo nosso grupo e analisar as diferenças estruturais e moleculares que possam estar envolvidas na indução da resposta imunológica diferenciada observada in vitro. Nossos resultados mostram uma diferença no padrão de cargas entre os complexos pMHC de SNV/PUUV e HTNV referente à região N94-101 e uma diferença na topologia referente à região N180-188. Nosso trabalho foi o primeiro a analisar os mecanismos de reatividade cruzada entre epitopos da proteína N de espécies virais do gênero Hantavírus a partir da construção de complexos pMHC partindo da estrutura primária dos epitopos. Ainda, ao final da dissertação, é apresentado um trabalho que visa, através da docagem e dinâmica molecular, diferenciar bons e maus ligantes de MHC-I. / The human organism is constantly challenged against several pathogens. In the viral context, the main defense occurs through T Lymphocyte Receptor (TCR) which interacts with the viral peptide (epitope) presented by the Major Histocompatibility Complex of class I (MHC-I). Since there is an infinitude of epitopes and the organism could not be able to accommodate one single TCR for each epitope, the immune system developed the cross-reactivity response, where the same TCR could recognize several viral epitopes. In this work, we studied the nucleocapside (N) protein sequence from several species of the Hantavirus genus through an in silico approach, using immunoinformatics tools. In the first work (second chapter) we presented a review about the use of immunoinformatics tools to solve issues concerning immunogenicity. In the third chapter, we analyzed the N protein sequence from 34 hantaviruses species. Our results have shown that murine epitopes are preferentially localized over conserved areas of the N protein alignment. Two N protein regions – N94-101 and N180-188 – from three different species – Sin Nombre (SNV), Puumala (PUUV) and Hantaan (HTNV) – have remarkable physical-chemical similarity, however, generated different immunological responses. Based on that, in the fourth chapter we aimed to construct pMHC complexes from N94-101 and N180-188 regions from SNV, PUUV and HTNV, through an in silico approach developed by our research group, to analyze structural and molecular differences that would be involved in the differential immunological response induction observed in vitro. Our results point to a difference of the charges distribution on the pMHC complexes from SNV/PUUV and HTNV in the N94-101 region and topology differences in the N180-188 region. Our work was the first to analyze the cross-reactivity mechanisms among epitopes of the N protein from hantaviruses species through in silico construction of pMHC complexes from linear epitope sequence. Also, at the end, it will be presented a work that uses molecular docking and molecular dynamics, attempting to differentiate good and bad MHC-I ligands.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-15T17:56:02Z No. of bitstreams: 1 thatiane_s_simone_ioc_bcm_0011_2010.pdf: 9522536 bytes, checksum: fa6d5ea74828d496e73423373aedb60d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T17:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thatiane_s_simone_ioc_bcm_0011_2010.pdf: 9522536 bytes, checksum: fa6d5ea74828d496e73423373aedb60d (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Este estudo apresenta os resultados da identificação de epitopos consecutivos responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune humoral em todas as proteínas estruturais (C, prM / M e E) e não-estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5) dos vírus dengue (DENV) tipos 1,2 e 3 circulantes no Brasil. A metodologia de síntese paralela de peptídeos (do inglês Spot synthesis) foi utilizada para a construção de uma biblioteca composta por 2007 peptídeos e, a tiragem utilizando pool de soros de pacientes com dengue, previamente confirmados através de técnicas laboratoriais, permitiu a identificação de 96 epitopos para os DENV-1, 103 epitopos para os DENV-2 e 106 epitopos para os DENV-3. Tais resultados foram comparados com métodos computacionais que permitem a predição de regiões imunogênicas (DNASTAR e IEDB) e demonstrou que, apesar de serem considerados bons indicadores de antigenecidade de uma proteína, os métodos computacionais requerem mais do que um parâmetro de predição para a confiabilidade dos resultados. Por sua vez, a síntese paralela provou ser altamente sensível e eficiente no mapeamento de epitopos consecutivos, permitindo a síntese em nano-escala de um grande número de peptídeos, de forma simultânea e reprodutível.. A fim de avaliar a capacidade em discriminar as infecções causadas pelos sorotipos de dengue daqueles negativos para esta patologia, foi realizado um teste de reação cruzada dos peptídeos identificados com pool de soros de pacientes com DENV-1, DENV-2 ou DENV-3, seguido pela avaliação utilizando pool de soros negativos para dengue, pool de soro de voluntários previamente vacinados para a febre amarela e pool de soros de pacientes com rubéola, sarampo, leptospirose, malária varíola e indicaram a existência de um total de 195 epitopos comuns ao grupo dengue e 3 epitopos específicos para os DENV-1, 9 para os DENV-2 e 11 para os DENV-3. A modelagem molecular das proteínas dos DENV permitiu a confirmação da localização dos epitopos na superfície da molécula. Esses resultados constituem a primeira descrição completa de epitopos contínuos dos DENV e poderão contribuir para a compreensão da interação anticorpo-epítopo em nível molecular e, conseqüentemente, a patogenicidade do dengue, bem como servir de base para a construção racional de vacinas preventivas e para o desenvolvimento de testes de diagnóstico sorológicas vírus-específicos. / This study shows the results of identification of epitopes responsible for consecutive triggering of humoral immune response in all structural proteins (C, prM / M, and E) and non-structural (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4A, NS4B and NS5) of dengue virus (DENV) types 1,2 and 3 circulating in Brazil. The methodology for parallel synthesis of peptides (English Spot synthesis) was used to construct a library comprising peptides and 2007, using the pull pool of sera from patients with dengue previously confirmed by laboratory techniques allowed the identification of 96 epitopes for DENV-1, 103 epitopes for DENV-2 and 106 epitopes for DENV-3. These results were compared with computational methods which allow predicting immunogenic regions (DNASTAR and iedb) and demonstrated that, although they are considered good predictors of antigenicity of a protein, computational methods require more than one parameter for predicting the reliability of results. In turn, the parallel synthesis proved to be highly sensitive and efficient in the epitope mapping consecutive allowing the nano-scale synthesis of large numbers of peptides, simultaneously and reproducible .. In order to assess the ability to discriminate infections caused by serotypes of dengue those negative for this disease, we performed a test cross-reactivity of peptides identified with pooled sera from patients with DENV-1, DENV-2 and DENV-3, followed by evaluation using pool negative sera to Dengue, pool of serum from subjects previously vaccinated for yellow fever and pool of sera from patients with rubella, measles, leptospirosis, malaria, smallpox and indicated the existence of a total of 195 epitopes common to the group 3 and dengue-specific epitopes for DENV-1, 9 for DENV-2 and 11 for DENV-3. Molecular modeling of the proteins of DENV allowed confirmation of the location of epitopes on the surface of the molecule. These results provide the first complete description of continuous epitopes of DENV and may contribute to the understanding of the interaction of antibody-epitope at the molecular level and, consequently, the pathogenicity of dengue, as well as serve as a basis for the rational construction of preventive vaccines and to development of serological diagnostic tests virus-specific.

Made available in DSpace on 2014-12-22T16:33:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 claudia_pizzini_ipec_dout_2013.pdf: 1825173 bytes, checksum: 02ac3def251a87a7d621295df91231c8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é uma infecção que apresenta amplo espectro clínico, variando desde forma leves, a graves e disseminadas. O diagnóstico da histoplasmose baseia-se nos aspectos clínicos, radiológicos e epidemiológicos. A confirmação se dá pelo isolamento e identificação do Histoplasma capsulatum através de procedimentos microbiológicos. Diferentes metodologias já foram descritas no diagnóstico sorológico da histoplasmose, porém limitações relacionadas a reações cruzadas e limiar de detecção das técnicas empregadas podem dificultar o diagnóstico. O antígeno M obtido do extrato antigênico histoplasmina é considerado um antígeno imunodominante para produção de anticorpos, sendo reconhecido em cerca de 90% dos soros dos pacientes com histoplasmose, sendo assim nosso grupo vem trabalhando a vários anos em estudos para um melhor conhecimento desta molécula e aplicação no diagnóstico.Um Modelo molecular do antigeno M foi desenvolvido através de sua sequência, tendo então confirmada sua natureza biológica como catalase, sendo observado também que esta molécula apresentava regiões comuns bem como especificas quando comparadas a catalases de organismos eucariotas. No presente estudo procuramos determinar a presença de possíveis epitopos antigênicos na proteína M empregando ferramentas proteômicas, para posterior emprego em ensaios imunoenzimáticos. Para tal foi utilizada a combinação da técnica de coimunoprecipitação com espectometria de massas e posteriormente a técnica de Spot synthesis Com o emprego do anticorpo monoclonal (mAb 1A7) produzido contra a proteína M recombinante foi possível detectar uma sequência que foi comum as duas metodologias empregadas (PTKIIPEELVPFTP). Esta sequência encontra-se localizada na região onde em estudos anteriores por análise in silico foi apontada como a região mais antigênica desta molécula. Foi realizada a síntese desta sequência, e diferentes desenhos foram utilizados, extensão de resíduos de lisina e adição da molécula de biotina em ambas as extremidades, carboxi e amino terminal, bem como a síntese da sequência sem adição de outras moléculas. Diferentes desenhos de ensaios imunoenzimáticos foram realizados, um ELISA empregando microesferas carboxiladas, ELISA indireto empregando placas de microtitulação revestidas com estreptoavidina e um ELISA sandwich. A sequência não apresentou resultados satisfatórios nos diferentes ensaios. Observamos que apenas no ensaio onde utilizamos o peptídeo ligado a molécula de biotina 1-a e 1-b, foi possível obter um poder discriminatório entre o grupos de pacientes com histoplasmose e o grupos de indivíduos hígidos, o ponto de corte foi obtido pela media das DOs das amostras de indivíduos hígidos mais duas vezes o desvio padrão, onde este teste apresentou uma boa sensibilidade(100 - 95%), porém a especificidade encontrada não foi satisfatória (27 - 20%). Estes resultados não foram concordantes com a análise feita in silico da sequência sintetizada. O antígeno M recombinante foi testado em um ELISA de captura de antígeno, onde os resultados preliminares apresentaram-se promissores necessitando de novos testes para avaliarmos parâmetros como sensibilidade e especificidade / Histoplasmosis is a worldwide distribution infection with several clinical spectrum, from as ymptomatic to severe and disseminated disease . The diagnosis of histoplasmosis is based on clinical, radiological and epidemiological findings. The laboratory diagnosis of histoplasmosis is based on fungus isolation by culture, direct examination in tissue or other clinical specimens. However, such procedures have limitations and are time - consuming . For these reasons serological tests play an important role on presumptive diagnosis . Although different methodologies have been described for serological diagno sis of histoplasmosis , cross - reactions and low sensitivity could difficult the final result. The M antigen is obtain by the antigenic extract histoplasmin and is considered as an immunodominant antigen recognized by 90% of sera from patients with histoplas mosis, For a better understanding of the molecule biological nature and its application in diagnosis methodologies our group has been working for several years. The molecular analysis of the M antigen was based on the sequence protein and confirmed as a ca talase. It was also observed that this molecule showed specific and common polypeptide regions when compared to catalases from others eukaryotic organisms. In this study we evaluated the possible presence of antigenic epitopes in the M protein sequence tha t could represent potential candidate as diagnostic markers for histoplasmosis. For this reason we used the combining co - immunoprecipitations and mass spectrometry and spot synthesis technique. The application of a monoclonal antibody against to the M anti gen (mAb 1A7) produced by our group allowed the detection of a same sequence in both employed methodologies ( PTKIIPEELVPFTP) . This was synthesized with different conformations, addition lysine residues and biotin molecules in both amino and carboxy term inal regions. Different immunoassays were performed, carboxylated microspheres, ELISA indireta with microplate coated with streptoavidin and ELISA sandwich . The sequence did not show good specificity and sensibility in different tests. A good discriminator y power was possible when the peptide biotin molecule bind (P1 - a and P1 - b) was used in serum samples from groups of histoplasmosis patients and healthy controls. This test showed a high sensitivity (100 - 95%), however the specificity was not satisfactory ( 27 - 20%) respectevily. The ELISA ́s cut - off points were established as the mean of absorbances plus two standard deviation of the healthy controls. The immunoassay ́s results were discordant when compared on in silico analysis using as antigen the synthesize d sequence. In another approach, the M antigen was tested in an antigen - capture enzyme - linked immunosorbent assay (ELISAs) and promising results were observed, but further studies must be done in order to evaluate parameters such as sensitivity and specifi city

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T17:57:16Z No. of bitstreams: 1 Franklin Souza da Silva_Dissertação.pdf: 2017504 bytes, checksum: 0bb3de10c14f9cc14cda994594ad320a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T17:57:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franklin Souza da Silva_Dissertação.pdf: 2017504 bytes, checksum: 0bb3de10c14f9cc14cda994594ad320a (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Leishmania spp são modelos de parasitas intracelulares de macrófagos que apresentam uma série de peculiaridades adaptativas nesta fase do seu ciclo biológico. A nossa hipótese é que fragmentos peptídicos da região COOH-terminal das cisteínas proteinases B de Leishmania (Leishmania) amazonensis atuem como uma dessas peculiaridades, modulando a resposta imune do hospedeiro vertebrado. Nesse trabalho, propomos definir a região bioativa (fragmento peptídico indutor da resposta imune) de dois peptídeos descritos como imunomoduladores durante a infecção experimental por L. (L.) amazonensis. Utilizando o servidor online SYFPEITHI, a partir dos peptídeos P1 (VMVEQVICFD) e P6 (EFCLGGGLCL) foi possível triar sequências peptídicas (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) que apresentaram um potencial de ligação favorável (escore > 8) aos dímeros de H-2 (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk e H-2Ld). Os epítopos preditos foram sintetizados quimicamente e utilizados em ensaios ex vivo e in vitro com as linhagens de camundongos C57BL/6 (H-2Db) e BALB/c (H-2Ld). Os ensaios de quantificação dos linfócitos T CD8+ com o dimeric, H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig complexadas aos peptídeos previstos, indicaram a presença de clones deste tipo celular para todos os peptídeos previstos, exceto para o P6.5 na linhagem C57BL/6, nos linfonodos drenantes da infecção. A propriedade de induzir proliferação de linfócitos T CD8+ in vitro foi observada apenas para sete peptídeos previstos (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 e P1.10) nos ensaios com BALB/c e apenas dois epítopos (P1.7 e P1.10) nos ensaios com C57BL/6. Adicionalmente foram realizados ensaios de interação entre o H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig e os peptídeos sintéticos, em tempo real, pela técnica de ressonância plasmônica de superfície. Os peptídeos testados com H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 e P1.10) e H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 e P1.8 e P1.9) indicaram valores de Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) e de Kd ( ∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1) favoráveis para formar complexos com os dímeros H-2Db e H-2Lb em pH neutro. Os valores de G < 0 destes complexos (em ambos os haplotipos), sugeriram que os mesmos existam durante a resposta imune acarretada pela infecção por L. (L.) amazonensis em camundongos. / Leishmania spp are models of intracellular macrophage parasites that show several adaptive peculiarities during that particular phase of the biological cycle. We hypothesized that peptide fragments from the COOH-terminal region of a cysteine proteinase B from Leishmania (Leishmania) amazonensis act in such peculiar way by modulating the immune response of vertebrate hosts. The aim of this work is the determination of the bioactive region (peptide fragment inducer of immune response) of two peptides described as immunomodulating during experimental infection by L. (L.) amazonensis. Using the online server Syfpeithi for P1(VMVEQVICFD) and P6(EFCLGGGLCL) peptides, we selected short sequences (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) with favorable binding potential (score > 8) to H-2 dimmers (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk and H-2Ld). The predicted epitopes were chemically synthesized and used for ex vivo and in vitro assays with isogenic mice C57BL6 (H-2Db) and BALB/C (H-2Ld). We have also performed a quantification assay of CD8+ T lymphocytes in draining lymph node from lesion. In this assay, we used dimeric, H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig, complexed to predicted peptides. The results indicated the presence of CD8+ T lymphocytes clones, for all tested peptides, excep for P6.5 in C57BL/6 mice. The capacity to induce CD8+ T lymphocytes blastogenesis, in vitro, was only observed for seven predicted peptides (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 and P1.10) in the assay with BALB/c mice cells and only for two peptides (P1.7 and P1.10) in C57BL/6 mice cell assay. Additionally, we performed a binding assay between H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig and the synthetic peptides, in real time, by surface plasmon resonance. The peptides tested with H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 and P1.10) and H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.8 and P1.9) indicated values of Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) and Kd (∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1 ) favorable to form complexes with H-2Db e H-2Lb dimmers at neutral pH. The G < 0 values of these complexes (for both haplotypes), suggest that they can exist during the immune response caused by L. (L.) amazonensis infection in mice.