A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

A coevolução parasita-hospedeiro pode ser apontada como uma das principais responsáveis pela grande diversificação de genes envolvidos na resposta imunológica. A chamada “região do MHC” (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), localizada no braço curto do cromossomo 6 humano, é a região mais polimórfica e densa do nosso genoma. Os três genes mais polimórficos deste locus codificam a cadeia pesada de um complexo referido como MHC de classe I, responsável pela apresentação (na superfície celular) de peptídeos provenientes da degradação de proteínas intracelulares. Este mecanismo é central na resposta antiviral, permitindo que células infectadas sejam identificadas e eliminadas pelos Linfócitos T Citotóxicos. Apesar de estruturalmente similares, cada molécula de MHC apresenta maior afinidade por peptídeos com determinadas características bioquímicas. Assim, quanto maior a variabilidade de MHCs em uma dada população, menor o risco de que todos os indivíduos sejam incapazes de apresentar pelo menos alguns alvos derivados de um determinado vírus. Por outro lado, a resposta imunológica celular e a geração de memória contra este alvo apresentado pelo MHC, depende do reconhecimento específico deste complexo peptídeo:MHC (pMHC) por uma dada população de linfócitos. Neste trabalho empregamos ferramentas de bioinformática para realizar a análise estrutural de complexos pMHC, identificando propriedades envolvidas na estimulação da resposta imunológica celular. Nossos resultados in silico, corroborados por experimentos in vitro e ex vivo, sugerem que a similaridade estrutural de complexos pMHC (em termos de topografia e potencial eletrostático) desempenha um papel central na reatividade cruzada de linfócitos T, com implicações sobre imunidade heteróloga, imunopatologia e desenvolvimento de vacinas. / Host-pathogen coevolution can be implicated as one of the main features driving the great diversity of genes involved with immunological response. The so-called “MHC region” (Major Histocompatibility Complex), located at the short arm of human chromosome 6, is the most polymorphic and dense region of our genome. The three most polymorphic genes in this locus encode the heavy chain of a complex referred as MHC class I, which is responsible for presentation (at cell surface) of peptides derived from the digestion of cytosolic proteins. This mechanism plays a key role in antiviral immune response, allowing infected cells to be identified and eliminated by Cytotoxic T Lymphocytes. Although structurally similar, each MHC molecule presents higher affinity for peptides with certain biochemical properties. Therefore, the greater the variability of MHCs in a given population, the smaller the risk that all individuals are unable to present at least some targets derived from a given virus. On the other hand, cellular immune response and memory generation against the target presented by the MHC, depends on specific recognition of this peptide:MHC (pMHC) complex by a given T cell population. In this work, we use bioinformatics tools to perform structural analysis of pMHC complexes, identifying features involved in triggering cellular immune responses. Our in silico results, corroborated by in vitro and ex vivo experiments suggest that structural similarity among pMHC complexes (topography and electrostatic potential) plays a central role in cross-reactivity of cytotoxic T cells, with implications over heterologous immunity, immunopathology and vaccine development.

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LimaNeto_DanielFerreira_D.pdf: 8189026 bytes, checksum: 64631e8e2ed546b6da6a944505049080 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

S. pneumoniae pode causar infecções do trato respiratório. Uma alternativa às vacinas conjugadas, que conferem proteção sorotipo-específica, seria uma vacina baseada em epitopos de diferentes variantes de antígenos como PspA e PspC. O objetivo deste trabalho foi a identificação de epitopos de variantes de PspA e PspC, utilizando a técnica peptide array, visando a síntese de um antígeno composto por múltiplos epitopos. Os resultados obtidos indicaram que anticorpos contra epitopos lineares de PspA reconhecem as regiões inicial N-terminal e rica em prolinas, mas estes epitopos parecem ser apenas marcadores de exposição ao pneumococo e epitopos conformacionais seriam os de fato protetores, como observado nos experimentos realizados com os Frags de 100 aminoácidos construídos a partir do PspARx1, especialmente aqueles presentes nas regiões dos Frags 2 e 4. Epitopos lineares de PspC parecem ser importantes na região de ligação à sIgA e FH. Assim, uma vacina proteica de ampla cobertura, poderia conter as regiões do Frag 2 de PspA e de ligação de sIgA e FH de PspC. / S. pneumoniae can cause respiratory tract infections. An alternative to the conjugate vaccines, which confer serotype-specific protection, would be a vaccine based on epitopes of variants of antigens such as PspA and PspC. The objective of this study was to identify epitopes of variants of PspA and PspC, using the peptide array technique, aiming at the synthesis of a multi-epitope antigen. The results obtained with peptide arrays indicated that antibodies against linear epitopes of PspA recognize the initial N-terminal and proline-rich regions, but these epitopes seem to be only markers of exposure to pneumococcus and conformational epitopes would be in fact protective, as observed in the experiments with fragments of 100 amino acids constructed from PspARx1, especially those present in Frags 2 and 4. Linear epitopes of PspC seem to be important in the regions of sIgA and FH binding. Thus, a protein-based vaccine with broad coverage could contain the regions of Frag 2 of PspA and the regions of sIgA and FH binding of PspC.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-29T13:38:11Z No. of bitstreams: 1 juan_cs_arcila_ioc_bp_0018_2010.pdf: 3623203 bytes, checksum: 95b546b53817b404a7cd799e059899a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-29T13:38:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juan_cs_arcila_ioc_bp_0018_2010.pdf: 3623203 bytes, checksum: 95b546b53817b404a7cd799e059899a1 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq e PEC-PG / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças antropozoonóticas, endêmicas em 88 países e presentes em quase todos os estados brasileiros. O desenvolvimento de uma vacina contra das leishmanioses é altamente desejável já que a terapia e as características biológicas e ecoepidemiólogicas dos parasitos e seus vetores associados não facilitam o controle da doença. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) é uma molécula candidata a vacina contra as leishmanioses. Utilizando ferramentas in vitro e in silico, foi avaliada a antigenicidade de 13 peptídeos sintéticos abrangendo a sequência inteira de KMP-11. Para os estudos in vitro foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes com leishmaniose cutânea (LC) do estado do Rio de Janeiro. Estas células foram empregadas para testar a antigenicidade dos 13 peptídeos individualmente e da proteína integral KMP-11 recombinante, através de ensaios de ELISA e ELISPOT. Na dosagem de citocinas por ELISA observamos que a proteína KMP-11 recombinante estimulou respostas de citocinas quase sempre superiores às induzidas pelos peptídeos isolados. No que se refere a IFN-, dois dos 13 peptídeos (P9 e P10) estimularam níveis desta citocina significativamente (p<0,05) mais baixos do que os observados com a proteína inteira. Dez peptídeos (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e P13) apresentaram níveis de IL-10 e TNF-α significativamente inferiores aos observados com a proteína inteira. KMP-11 mostrou-se um potente indutor de IL-10 em PBMC de pacientes com LC, confirmando resultados anteriormente publicados, mas também foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e altos níveis de TNF-α, em níveis superiores aos dos peptídeos estudados. Na avaliação da razão IFN-γ/IL-10 observou-se um acentuado contraste entre a maioria dos peptídeos e a proteína KMP-11. As respostas a 11 dos 13 peptídeos mostraram um claro viés de resposta de tipo 1 (IFN-γ>IL-10), a exceção dos peptídeos P1 e P10 (IFN-γ<IL-10). Na resposta à proteína recombinante KMP-11 houve um forte predomínio da produção de IL-10 sobre a de IFN-γ. Observou-se uma grande variação na produção de citocinas estimuladas pelos peptídeos entre os pacientes envolvidos nas análises. Foi realizado um estudo in silico para predizer quais as sequências de KMP-11 que teriam maior potencial antigênico através do algoritmo SYFPEITHI, que revelou que os peptídeos estudados são promíscuos para a maioria dos alelos de HLA de classe I e II analisados. Para HLA de classe II, P4 mostrou scores significativamente maiores em relação a todos os outros peptídeos (p<0,05), exceto P10 e P12. Para HLA de classe I os valores de score para o peptídeo P1 foram significativamente mais altos que os valores dos peptídeos P4, P10 e P11 (p<0,05). Por outro lado, os valores de score para o peptídeo P11 foram significativamente mais baixos que os dos peptídeos P1, P2, P5, P6, P12 e P13 (p<0,05). Os peptídeos P3, P4 e P11 apresentaram valores negativos de score, indicando que eles contêm, dentro das respectivas sequências, aminoácidos que interferem ou que desfavorecem a interação e ligação com os diferentes alelos de HLA I. Adicionalmente, foram utilizadas as ferramentas PAPROC, MAPP e NetChop que possibilitaram predizer que sequências contidas em P1, P5 e P6 seriam produzidas naturalmente pela maquinaria proteolítica. O algoritmo PHYRE predisse que KMP-11 apresentava uma conformação de “grampo” com hélices-α ligadas por uma alça. Adicionalmente este programa predisse a estrutura tridimensional da proteína. O algoritmo PROTSCALE mostrou que KMP-11 possui três regiões de alta polaridade entre os aminoácidos 14-29, 34-36 e 44-71. o que estaria relacionado com a estrutura tridimensional já mencionada. Finalmente, a análise de nível de conservação de KMP-11 confirmou que esta molécula é bem conservada nos cinetoplastídeos, porém possibilitou discriminar as sequências dos genes codificadores da proteína no gênero Leishmania das existentes nos gênero Trypanosoma e Crithidia. Os resultados obtidos na análise bioinformática estavam, em parte, de acordo com os obtidos na parte experimental (imunológica) do presente estudo e em estudos anteriores sobre KMP-11. / Leishmaniases are a group of antropozoonotic diseases, endemic in 88 countries and present in almost all Brazilian states. The development of vaccines against leishmaniasis is highly desirable because neither the therapy nor the biological and ecoepidemiologic characteristics of parasites and their associated vectors facilitate the disease control. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) is a vaccine candidate molecule against leishmaniasis. Using in vitro and in silico tools, we evaluated the antigenicity of 13 synthetic overlapping peptides covering the entire sequence of KMP-11. For the in vitro experiments we used peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with cutaneous leishmaniasis (LC) from Rio de Janeiro State. These cells were employed to test the antigenicity of the 13 peptides individually, using ELISA and ELISPOT. By using ELISA we observed that recombinant KMP-11 induced higher cytokine responses than most of the individual peptides. Concerning IFN-γ two peptides (P9 and P10) induced cytokine levels significantly lower (p<0.05) than the entire protein. Ten peptides (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e and P13) induced significantly lower IL-10 and TNF-α levels than those observed with the entire protein. KMP- 11 was a potent inducer of IL-10 production in PBMC cultures from LC patients, confirming previously published observations. It was also capable of inducing higher levels of IFN-γ and TNF-α as compared to the studied peptides. In the evaluation of the IFN-γ/IL-10 ratio, we observed a marked contrast between most of the peptides and KMP-11. The responses to 11 out of 13 peptides presented a clear type 1 bias (IFN-γ>IL-10), except P1 and P10, which showed a type 2 response (IFN-γ<IL-10). The response with the entire recombinant protein IL-10 production predominated over that of IFN-γ. High variability in cytokine production among the patients was observed. An in silico study was made to predict KMP-11 sequences with antigenic potential with the SYFPEITHI algorithm. This analysis has revealed that the studied peptides were promiscuous for most of the class I and class II HLA alleles analyzed. For class II HLA, P4 showed scores significantly higher than the other peptides (p<0.05), except those of P10 and P12. For class I HLA, the score values for P1 were significantly higher than those for P4, P10 and P11 (p<0.05). On the other hand, the score values for the P11 were significantly lower than those for P1, P2, P5, P6, P12 and P13 (p<0.05). The P3, P4 and P11 peptides showed negative score values, indicating that they contain amino acids that interfere with the binding to HLA I molecules. In addition to this, we used the PAPROC, MAPP and NetChop tools that have predicted that sequences contained in P1, P5 and P5 would be naturally produced by the proteolytic machinery. The PHYRE algorithm has predicted that KMP-11 has a "hairpin" conformation with two alpha-helixes joined together by a loop. Additionally this software has predicted the tridimensional structure of the protein. The PROTSCALE algorithm revealed three regions of high polarity in the KMP-11 molecule (at the positions 14-29, 34-36 and 44-71), what would be related to the tridimensional structure already mentioned. Finally, the analysis of KMP-11 conservation confirmed that this molecule is highly conserved in Kinetoplastidae, However, it was able to distinguish the sequences of the KMP-11-coding genes in the genus Leishmania from those existent in Trypanosoma and Crithidia. The results obtained in the bioinformatic analysis were partially in agreement with those obtained in the experimental (immunologic) part of the present study and in previous studies on KMP-11.

S. pneumoniae pode causar infecções do trato respiratório. Uma alternativa às vacinas conjugadas, que conferem proteção sorotipo-específica, seria uma vacina baseada em epitopos de diferentes variantes de antígenos como PspA e PspC. O objetivo deste trabalho foi a identificação de epitopos de variantes de PspA e PspC, utilizando a técnica peptide array, visando a síntese de um antígeno composto por múltiplos epitopos. Os resultados obtidos indicaram que anticorpos contra epitopos lineares de PspA reconhecem as regiões inicial N-terminal e rica em prolinas, mas estes epitopos parecem ser apenas marcadores de exposição ao pneumococo e epitopos conformacionais seriam os de fato protetores, como observado nos experimentos realizados com os Frags de 100 aminoácidos construídos a partir do PspARx1, especialmente aqueles presentes nas regiões dos Frags 2 e 4. Epitopos lineares de PspC parecem ser importantes na região de ligação à sIgA e FH. Assim, uma vacina proteica de ampla cobertura, poderia conter as regiões do Frag 2 de PspA e de ligação de sIgA e FH de PspC. / S. pneumoniae can cause respiratory tract infections. An alternative to the conjugate vaccines, which confer serotype-specific protection, would be a vaccine based on epitopes of variants of antigens such as PspA and PspC. The objective of this study was to identify epitopes of variants of PspA and PspC, using the peptide array technique, aiming at the synthesis of a multi-epitope antigen. The results obtained with peptide arrays indicated that antibodies against linear epitopes of PspA recognize the initial N-terminal and proline-rich regions, but these epitopes seem to be only markers of exposure to pneumococcus and conformational epitopes would be in fact protective, as observed in the experiments with fragments of 100 amino acids constructed from PspARx1, especially those present in Frags 2 and 4. Linear epitopes of PspC seem to be important in the regions of sIgA and FH binding. Thus, a protein-based vaccine with broad coverage could contain the regions of Frag 2 of PspA and the regions of sIgA and FH binding of PspC.

A persistência de células T de memória funcionais é importante para garantir uma imunidade protetora na infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). As células T de memória têm sido subdivididas em memória central (TCM), memória efetora (TEM) e memória efetora altamente diferenciada (TEMRA) com base na expressão de moléculas de superfície como CCR7 e CD45RA, e na capacidade de produzir citocinas e proliferar. Recentemente, identificamos 18 peptídeos derivados de seqüências do consenso B do HIV-1, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR e amplamente reconhecidos por linfócitos T de sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV. Diante disso e considerando a importância das células T de memória na manutenção da resposta imune específica, nosso objetivo foi caracterizar fenotípica e funcionalmente as subpopulações de células T de memória de indivíduos infectados pelo HIV envolvidas no reconhecimento in vitro desses epitopos. Foram incluídos 14 indivíduos controles sadios e 61 pacientes HIV+ com contagem de linfócitos T CD4+ maior que 250 células/mm3. Os pacientes HIV+ foram divididos em seis diferentes grupos clínicos de acordo com o estágio da infecção, carga viral (CV) plasmática e uso de terapia anti-retroviral (ART): não progressores por longo tempo (LTNP), avirêmicos em uso de ART (AV-ART), virêmicos em uso de ART (VI-ART), virêmicos sem uso de ART (VI sem ART), virêmicos recéminfectados sem uso de ART (VI-RI) e controladores. Células mononucleares do sangue periférico dos indivíduos do estudo foram estimuladas com o conjunto de peptídeos do HIV-1 e com um conjunto de peptídeos do Citomegalovírus (CMV). A freqüência de células de memória produtoras de IFN- e IL-2 e a proliferação celular antígeno-específica foram detectadas por citometria de fluxo de multiparâmetros. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de ativar subpopulações funcionais de memória TCM, TEM e TEMRA secretoras de IFN- e IL-2 em 100% dos pacientes HIV+ dos diferentes grupos clínicos. O conjunto de peptídeos do HIV-1 também induziu proliferação das subpopulações de linfócitos T de memória. As freqüências de TEMRA CD4+IFN-+, TEMRA CD4+IFN-+ total, TCM CD8+IFN-+, TCM CD8+IFN-+ total, TEM CD8+IFN-+, TEM CD8+IFN-+ total e TEMRA CD8+IFN-+ correlacionaram-se negativamente com a carga viral do HIV em pacientes virêmicos. Esses dados sugerem que essas subpopulações de memória funcionais são importantes no controle da viremia. Comparando as respostas HIV e CMVespecíficas observamos freqüências mais elevadas de células T de memória produtoras de IL-2, IFN-/IL-2 e IFN- em respostas ao pool de peptídeos do HIV. Esses dados sugerem que esse conjunto de peptídeos derivados de seqüências do HIV-1 ativa respostas polifuncionais de subpopulações de linfócitos T de memória. Nossos resultados mostraram que o conjunto de peptídeos do HIV-1 foi capaz de estimular diferentes subpopulações distintas de linfócitos T de memória produtores de IFN-, IFN-,/IL-2 e IL-2 de indivíduos em diferentes estágios da infecção pelo HIV e sugerem o envolvimento de subpopulações de memória funcionais no controle da viremia. Estes achados fortalecem a possibilidade de uso desses peptídeos em uma formulação vacinal bem-sucedida em humanos / The persistence of functional memory T cell is important to ensure a protective immunity to Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection. Memory T cells have been subdivided into central memory (TCM), effector memory (TEM) and highly differentiated effector memory (TEMRA) based on the expression of surface molecules such as CCR7 and CD45RA, and the ability to produce cytokines and proliferate. Recently, we identified 18 peptides derived from B consensus sequences of HIV-1 that bind to multiple HLA-DR molecules and are widely recognized by peripheral blood T lymphocytes from HIV-infected patients. Given this and considering the importance of memory T cells in the maintenance of specific immune response, our objective was to characterize phenotypic and functionally memory T cell subsets from HIV-infected individuals involved in the recognition of these epitopes in vitro. The study included 14 healthy control subjects and 61 HIV+ patients with CD4+ lymphocytes counts higher than 250 cells/mm3. The HIV+ patients were divided into six different clinical groups according to the stage of infection, plasma viral load (VL) and antiretroviral therapy use (ART): long-term non-progressors (LTNP), aviremic under ART (AV-ART), viremic under ART (VI-ART), viremic without using ART (VI without ART), recently infected viremic without using ART (VI-RI) and controllers. Peripheral blood mononuclear cells from study subjects were stimulated with HIV-1 peptide pool and with a cytomegalovirus (CMV) peptide pool. The frequencies of IFN- and IL-2 producing memory cells and antigenspecific cell proliferation were detected by multiparametric flow cytometry. Our results showed that the HIV-1 set of peptides was able to activate TCM, TEM and TEMRA functional memory subsets that secrete IFN- and IL-2 in 100% of the HIV patients from the different clinical groups. The HIV-1 set of peptides also induced memory T lymphocyte subsets proliferation. TEMRA CD4+IFN-+, total TEMRA CD4+IFN-+, TCM CD8+IFN-+, total TCM CD8+IFN-+, total TEM CD8+IFN-+, TEM CD8+IFN-+ and TEMRA CD8+IFN- + frequencies negatively correlated with HIV viral load in viremic patients. These data suggest that these functional memory subsets are important to control the viremia. When comparing the HIV and CMV-specific responses we observed higher frequencies of IL-2, IFN-/IL-2 and IFN- producing memory T cells in response to HIV peptide pool. These data suggest that this set of HIV sequence derived peptides activates polyfunctional response of memory T lymphocyte subsets. Our results showed that the HIV-1 peptide set was able to stimulate different IFN-, IFN-/IL-2 e IL-2 producing memory T lymphocytes from individuals in different stages of HIV infection and suggest the involvement of functional memory subsets in the control of viremia. These findings strengthen the possibility of using these peptides in a successful vaccine formulation in humans

Uma das estratégias mais promissoras para a biotecnologia de vacinas é o desenvolvimento de linhagens precisamente atenuadas, e que possam ser usadas como carregadoras de antígenos heterólogos. Mutantes de <i}>Salmonella Typhimurium têm sido extensivamente utilizados com essa fmalidade. A flagelina, monômero constituinte do filamento flagelar, vem sendo empregada como carregadora de antígenos heterólogos, inseridos na região central, hipervariável (região IV). Inserções nessa região são freqüentemente funcionais, e levam à exposição do epitopo na superfície do filamento. O presente trabalho explora o potencial de outras regiões da molécula para a inserção de epitopos. Nós inserimos a mesma seqüência usada anteriomente (epitopo da proteína M de S. pyogenes, Tipo 5) em regiões com diferentes níveis de homologia (III e VI), e em região totalmente conservada (VIII). Também foram feitas inserções duplas em regiões que se mostraram toleráveis (III e IV; IV e VI). Todas as proteínas híbridas foram sintetizadas pela Salmonella, como demonstrado em imunoblots, usando anticorpo contra a flagelina e contra o peptídeo. Todas as regiões, exceto a VIII, aceitaram a inserção sem perda de motilidade, apesar de, em alguns casos, ela ter sido extremamente reduzida. A imunogenicidade foi avaliada pela imunização de camundongos com bactérias vivas, inativadas ou, quando possível, flagelina purificada. Os resultados foram similares aos descritos na literatura para inserções envolvendo a região IV, obtendo-se um elevado título de anticorpos contra flagelina. Um baixo nível de anticorpo contra o peptídeo também foi detectado para todas as novas linhagens testadas. Nossos resultados com imunização de bactérias vivas sugerem uma resposta levemente melhor ao peptídeo quando duas cópias estão presentes, mas os dados não são conclusivos. / One of the most promising strategies for the biotechnology of vaccines is the development of precisely attenuated strains, which could be used as carriers of heterologous antigens. Mutants of Salmonella Typhimurium have been extensively explored to this effect, since the infection ofmice by S. Typhimurium mimics the infection of humans by S. Typhi, and the genetics of the species is extremely well known, making it easy the obtention of defined mutants with reduced pathogenicity. Mutants with auxotrofy in genes of the aromatic pathway are particularly attractive, since they need PABA and DHB to grow, and these compounds are unavailable in mammalian tissues. Flagellin, the monomer which constitutes the flagellar filament, has been used as a carrier for heterologous epitopes, inserted in a central, hypervariable region (region IV). Insertions in this region are often functional, and lead to exposition of the epitope at the filament\' s surface. The present work explored the potential of the other regions ofthe molecule for the insertion of epitopes. We inserted the same reporter sequence (MS epitope from S. pyogenes M protein) in regions with different levels of homology (III and VI), and totally conserved (VIII). We also made double insertions in regions shown to be permissive (III and IV; IV and VI). All hybrid proteins were synthesized by Salmonella, as demonstrated by immunoblots using antibody against flagellin and against the synthetic peptide. All regions, except the highly conserved region VIII, accepted the insertions without loss of motility, albeit, in some cases, motility was seriously reduced. Immunogenicity of the hydrids was evaluated by immunization with live bacteria, killed bacteria, and purified flagellin (when possible). Results obtained with the new constructs were similar to the ones published for insertions involving region IV, in the sense that antibody titers to the carrier protein were very high. A low level of antibody to the inserted peptide was also detected in all groups of animals. Our results with live immunization suggest a slightly better response to the peptide when two copies are present, but the data are not conclusive.

O reconhecimento e interação intermoleculares são cruciais na patogênese de doenças desmielinizantes autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). A EM é uma doença que acomete o sistema nervoso central (SNC) e leva à desmielinização e axonopatia. Os alvos da resposta não são claros, mas proteínas da mielina, como a glicoproteína oligodendrocítica da mielina (MOG) e a proteína básica da mielina (MBP), são potenciais candidatas ao reconhecimento por células e autoanticorpos durante o processo autoimune. Assim, métodos de modelagem e simulações de dinâmica molecular (MD) e steered molecular dynamics (SMD) foram empregados para detalhar o reconhecimento e ligação do domínio externo da MOG e do peptídeo imunogênico MBP85-99 por anticorpos específicos. Para a obtenção das estruturas 3D dos anticorpos, particularmente do anti-MBP, um protocolo computacional envolvendo mutações sequenciais da região determinante de complementaridade (CDR) de estruturas-molde foi proposto. Dados obtidos evidenciaram grande contribuição das ligações de hidrogênio na manutenção dos complexos antígeno-anticorpo. Treze resíduos da MOG foram identificados como âncoras da ligação com o anti-MOG, os quais se relacionaram a peptídeos importantes descritos na literatura, principalmente o MOG92-106. No caso da MBP, os resíduos do MBP85-99 com maior interação com o anti-MBP envolveram a Arginina 99, Lisina 93, Asparagina 94 e Histidina 90, corroborando achados na literatura acerca da resposta celular e análises do anti-MBP em casos postmortem. Dados de SMD envolvendo os sistemas moleculares foram confirmados por dados de microscópio de força atômica, sugerindo grande participação do peptídeo MOG92-106 na manutenção da ligação com o anti-MOG. Com relação à MBP, os estudos computacionais indicaram que o ponto de interação da região da Arginina 99 é muito importante para a ligação com o anti-MBP. A consonância entre dados computacionais e dados experimentais resultantes de décadas de pesquisas da MOG e a MBP, bem como com dos experimentos de AFM, ficou evidente. Desta forma, as aproximações teórico-experimentais aplicadas neste trabalho para a caracterização de moléculas ainda não estudadas é uma via em potencial para otimização de passos iniciais e pré-clínicos de investigações de doenças autoimunes, guiando experimentos, reduzindos custos e o uso de modelos animais. / Intermolecular recognition and interaction are crucial in autoimmune demyelinating diseases pathogenesis as multiple sclerosis (MS). MS causes demyelination and axonopathy in the central nervous system (CNS). The targets of immune cells and autoantibodies are not clear, but myelin proteins, such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP), are potential candidates. Thus, methods of molecular modeling, molecular dynamics (MD), and steered molecular dynamics (SMD) simulation were applied to detail the recognition and binding of MOG external domain and the immunogenic MBP85-99 peptide by specific antibodies. A computational protocol based on mutations of complement determinant regions (CDR) in template structures was proposed to obtain antibodies 3D structures, especially the anti-MBP. The obtained data evidenced a significant contribution of hydrogen bonds in the maintenance of antigen-antibody complexes. Thirteen anchor residues were found in the MOG structure. These residues were related to three well-known epitopes recognized by immunologic components, mainly MOG92-106. In the case of MBP, the most interactive residues of the MBP85-99 with the anti-MBP were Arginine 99, Lysine 93, Asparagine 94, and Histidine 90. These data complied with several studies concern cellular recognition of MBP and postmortem cases involving anti-MBP. SMD information of both molecular systems was confirmed by atomic force microscopy and suggested the MOG92-106 acting as an anchor for the complex with the anti-MOG. Regarding MBP, the computational force study evidenced the importance of Arginine 99 interaction region for the antigen-antibody binding. The agreement between the obtained computational data and experimental information resulted of decades of MOG and MBP research was evident. In this context, theoretical and experimental approaches application as described here for characterizing novel molecules in autoimmune disease is a potential pathway to optimize early-stage and pre-clinical steps of investigations, guiding experiments, reducing costs, and animal model usage.