Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-29T13:38:11Z No. of bitstreams: 1 juan_cs_arcila_ioc_bp_0018_2010.pdf: 3623203 bytes, checksum: 95b546b53817b404a7cd799e059899a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-29T13:38:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juan_cs_arcila_ioc_bp_0018_2010.pdf: 3623203 bytes, checksum: 95b546b53817b404a7cd799e059899a1 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq e PEC-PG / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças antropozoonóticas, endêmicas em 88 países e presentes em quase todos os estados brasileiros. O desenvolvimento de uma vacina contra das leishmanioses é altamente desejável já que a terapia e as características biológicas e ecoepidemiólogicas dos parasitos e seus vetores associados não facilitam o controle da doença. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) é uma molécula candidata a vacina contra as leishmanioses. Utilizando ferramentas in vitro e in silico, foi avaliada a antigenicidade de 13 peptídeos sintéticos abrangendo a sequência inteira de KMP-11. Para os estudos in vitro foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes com leishmaniose cutânea (LC) do estado do Rio de Janeiro. Estas células foram empregadas para testar a antigenicidade dos 13 peptídeos individualmente e da proteína integral KMP-11 recombinante, através de ensaios de ELISA e ELISPOT. Na dosagem de citocinas por ELISA observamos que a proteína KMP-11 recombinante estimulou respostas de citocinas quase sempre superiores às induzidas pelos peptídeos isolados. No que se refere a IFN-, dois dos 13 peptídeos (P9 e P10) estimularam níveis desta citocina significativamente (p<0,05) mais baixos do que os observados com a proteína inteira. Dez peptídeos (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e P13) apresentaram níveis de IL-10 e TNF-α significativamente inferiores aos observados com a proteína inteira. KMP-11 mostrou-se um potente indutor de IL-10 em PBMC de pacientes com LC, confirmando resultados anteriormente publicados, mas também foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e altos níveis de TNF-α, em níveis superiores aos dos peptídeos estudados. Na avaliação da razão IFN-γ/IL-10 observou-se um acentuado contraste entre a maioria dos peptídeos e a proteína KMP-11. As respostas a 11 dos 13 peptídeos mostraram um claro viés de resposta de tipo 1 (IFN-γ>IL-10), a exceção dos peptídeos P1 e P10 (IFN-γ<IL-10). Na resposta à proteína recombinante KMP-11 houve um forte predomínio da produção de IL-10 sobre a de IFN-γ. Observou-se uma grande variação na produção de citocinas estimuladas pelos peptídeos entre os pacientes envolvidos nas análises. Foi realizado um estudo in silico para predizer quais as sequências de KMP-11 que teriam maior potencial antigênico através do algoritmo SYFPEITHI, que revelou que os peptídeos estudados são promíscuos para a maioria dos alelos de HLA de classe I e II analisados. Para HLA de classe II, P4 mostrou scores significativamente maiores em relação a todos os outros peptídeos (p<0,05), exceto P10 e P12. Para HLA de classe I os valores de score para o peptídeo P1 foram significativamente mais altos que os valores dos peptídeos P4, P10 e P11 (p<0,05). Por outro lado, os valores de score para o peptídeo P11 foram significativamente mais baixos que os dos peptídeos P1, P2, P5, P6, P12 e P13 (p<0,05). Os peptídeos P3, P4 e P11 apresentaram valores negativos de score, indicando que eles contêm, dentro das respectivas sequências, aminoácidos que interferem ou que desfavorecem a interação e ligação com os diferentes alelos de HLA I. Adicionalmente, foram utilizadas as ferramentas PAPROC, MAPP e NetChop que possibilitaram predizer que sequências contidas em P1, P5 e P6 seriam produzidas naturalmente pela maquinaria proteolítica. O algoritmo PHYRE predisse que KMP-11 apresentava uma conformação de “grampo” com hélices-α ligadas por uma alça. Adicionalmente este programa predisse a estrutura tridimensional da proteína. O algoritmo PROTSCALE mostrou que KMP-11 possui três regiões de alta polaridade entre os aminoácidos 14-29, 34-36 e 44-71. o que estaria relacionado com a estrutura tridimensional já mencionada. Finalmente, a análise de nível de conservação de KMP-11 confirmou que esta molécula é bem conservada nos cinetoplastídeos, porém possibilitou discriminar as sequências dos genes codificadores da proteína no gênero Leishmania das existentes nos gênero Trypanosoma e Crithidia. Os resultados obtidos na análise bioinformática estavam, em parte, de acordo com os obtidos na parte experimental (imunológica) do presente estudo e em estudos anteriores sobre KMP-11. / Leishmaniases are a group of antropozoonotic diseases, endemic in 88 countries and present in almost all Brazilian states. The development of vaccines against leishmaniasis is highly desirable because neither the therapy nor the biological and ecoepidemiologic characteristics of parasites and their associated vectors facilitate the disease control. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) is a vaccine candidate molecule against leishmaniasis. Using in vitro and in silico tools, we evaluated the antigenicity of 13 synthetic overlapping peptides covering the entire sequence of KMP-11. For the in vitro experiments we used peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with cutaneous leishmaniasis (LC) from Rio de Janeiro State. These cells were employed to test the antigenicity of the 13 peptides individually, using ELISA and ELISPOT. By using ELISA we observed that recombinant KMP-11 induced higher cytokine responses than most of the individual peptides. Concerning IFN-γ two peptides (P9 and P10) induced cytokine levels significantly lower (p<0.05) than the entire protein. Ten peptides (P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 e and P13) induced significantly lower IL-10 and TNF-α levels than those observed with the entire protein. KMP- 11 was a potent inducer of IL-10 production in PBMC cultures from LC patients, confirming previously published observations. It was also capable of inducing higher levels of IFN-γ and TNF-α as compared to the studied peptides. In the evaluation of the IFN-γ/IL-10 ratio, we observed a marked contrast between most of the peptides and KMP-11. The responses to 11 out of 13 peptides presented a clear type 1 bias (IFN-γ>IL-10), except P1 and P10, which showed a type 2 response (IFN-γ<IL-10). The response with the entire recombinant protein IL-10 production predominated over that of IFN-γ. High variability in cytokine production among the patients was observed. An in silico study was made to predict KMP-11 sequences with antigenic potential with the SYFPEITHI algorithm. This analysis has revealed that the studied peptides were promiscuous for most of the class I and class II HLA alleles analyzed. For class II HLA, P4 showed scores significantly higher than the other peptides (p<0.05), except those of P10 and P12. For class I HLA, the score values for P1 were significantly higher than those for P4, P10 and P11 (p<0.05). On the other hand, the score values for the P11 were significantly lower than those for P1, P2, P5, P6, P12 and P13 (p<0.05). The P3, P4 and P11 peptides showed negative score values, indicating that they contain amino acids that interfere with the binding to HLA I molecules. In addition to this, we used the PAPROC, MAPP and NetChop tools that have predicted that sequences contained in P1, P5 and P5 would be naturally produced by the proteolytic machinery. The PHYRE algorithm has predicted that KMP-11 has a "hairpin" conformation with two alpha-helixes joined together by a loop. Additionally this software has predicted the tridimensional structure of the protein. The PROTSCALE algorithm revealed three regions of high polarity in the KMP-11 molecule (at the positions 14-29, 34-36 and 44-71), what would be related to the tridimensional structure already mentioned. Finally, the analysis of KMP-11 conservation confirmed that this molecule is highly conserved in Kinetoplastidae, However, it was able to distinguish the sequences of the KMP-11-coding genes in the genus Leishmania from those existent in Trypanosoma and Crithidia. The results obtained in the bioinformatic analysis were partially in agreement with those obtained in the experimental (immunologic) part of the present study and in previous studies on KMP-11.