Doctor en Bioquímica / El cáncer, una de las causas más frecuentes de muerte en el mundo, es un gran desafío para el desarrollo de terapias específicas anti-tumores o de sus metástasis. Ya sea la inmunoterapia anti-tumoral ó la terapia anti-angiogénica, son estrategias con un muy buen potencial en la lucha contra el cáncer. La primera busca activar la respuesta de linfocitos T tumor-específicos, mientras que la segunda bloquea o retarda el crecimiento del tumor al interferir con el abastecimiento adecuado de nutrientes y oxígeno y con la remoción de productos catabólicos tóxicos. La inmunoterapia requiere de la identificación de Antígenos Asociados Tumores (TAA) que se expresen preferencialmente en tejidos con alto nivel proliferativo, como los tumores. Un TAA adecuado para este tipo de terapia debe ser esencial para la mantención de la viabilidad del tumor y ser blanco de linfocitos T citotóxicos. Survivina (Surv), cumple con estos requisitos. Por otra parte, en vertebrados, Calreticulina (CRT), proteína altamente pleiotrópica, además de su participación en procesos de presentación antigénica en células presentadoras de antígeno (APCs), puede translocarse a la membrana externa e interactuar con C1 del complemento. A pesar de la enorme distancia evolutiva entre el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, y los mamíferos, CRT del parásito (TcCRT) comparte una gran cantidad de características estructurales y funcionales con sus homólogos vertebrados. Recientemente, hemos propuesto que el efecto anti-neoplásico asociado a la infección por T. cruzi, se debería, al menos parcialmente, a la capacidad anti-angiogénica de TcCRT, al interactuar con células endoteliales, interfiriendo con su multiplicación, movilidad y capacidad morfogénica capilar. En estas actividades, la proteína parasitaria es más efectiva que su contraparte humana. Por estas razones, nuestra Hipótesis de Trabajo propuso que, la inmunización genética con Surv y la administración concomitante de TcCRT, genera una actividad anti-tumoral mayor que con solo uno de estos productos. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) De acuerdo a lo esperado, rTcCRT no afecta la proliferación in vitro de células de un melanoma murino B16-F10, ii) la inmunización genética con pSurv, en conjunto con rTcCRT (ó su dominio R), retrasa el crecimiento del tumor, iii) aumentando la sobrevida de los animales tratados. iv) El tratamiento combinado pSurv-rTcCRT inhibe la angiogénesis tumoral. v) rTcCRT se une a los melanocitos, promueve la incorporación de C1q humano y la fagocitosis macrofágica y, vi) La combinación de la inmunización con pSurv y pSec-Surv, más la inoculación i.v. con rTcCRT, inhibe sinérgicamente la metástasis pulmonar. Es probable que una secuencia de eventos se desencadene primariamente por la actividad anti-angiogénica de TcCRT, en el tumor, generando una respuesta al estrés derivado, siendo translocada CRT de la célula tumoral a la membrana externa, donde captura C1, evento que promueve la fagocitosis de la célula tumoral, por parte de las APCs. La presentación de péptidos derivados de antígenos TAA debiera ocurrir (Surv incluida), con la consiguiente inducción de actividad inmune anti-tumor. Independientemente, Surv podría también mediar actividad inmune anti-células endoteliales. En consecuencia, el retardo en el crecimiento tumoral y aumento en la sobrevida de los animales tratados con pSurv-rTcCRT se debería a la combinación de efectos sobre distintos blancos moleculares, colaborando y potenciando el efecto final. / Cancer, the most frequent cause of death worldwide, is a great challenge for the development of specific anti-tumor and metastasis treatment. Either immune anti-tumor or anti-angiogenic therapies, are potentially promising in the struggle against cancer. Immune therapy seeks to activate the response of antigen-specific T lymphocytes, thus allowing selective elimination of tumor cells, while anti-angiogenesis blocks or delays tumor growth by interfering with nutrient or oxygen supply and with the removal of catabolic toxic products. Immune therapy for cancer treatment requires the identification of Tumor Associated Antigens (TAA), specifically expressed in tissues with high proliferative levels, such as tumors. A TAA useful for this therapy must be essential for tumor liability and also serve as a target for cytotoxic T lymphocytes. Survivin (Surv), fulfills these requirements. On the other hand, in vertebrates, Calreticulin (CRT), a highly pleiotropic protein, besides its participation in antigen presenting cells (APCs), can translocate to the external membrane and interact with complement C1. In spite of the great evolutionary distance between Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas´ disease, and mammals, parasite CRT (TcCRT) shares many structural and functional properties with its vertebrate counterparts. Recently, we have proposed that the anti-tumor effect associated to T. cruzi infection is at least partially due to the TcCRT anti-angiogenic capacity. Thus, upon interacting with endothelial cells, TcCRT interferes with their multiplication, mobility and capacity to generate capillaries. In all these activities, the parasite protein is more effective than its human counterpart. For these reasons, the Working Hypothesis proposes that genetic immunization with Surv and concomitant TcCRT administration, generates a greater anti-tumor activity than each of these products, administered separately. The principal results obtained indicate that: i) As expected, while rTcCRT does not affect the in vitro proliferation of B16-F10 tumor cells, ii) genetic immunization with pSurv, together with rTcCRT (or its R domain), slows the growth of the B16-F10 murine melanoma iii) increasing survival of treated animal. iv) pSurv-rTcCRT treatment inhibits tumor angiogenesis. v) rTcCRT binds to B16-F10 melanocytes, promotes the incorporation of human C1q and consequent macrophage phagocytosis and, vi) The combination of immunization with pSurv and pSecSurv plus rTcCRT i.v. inoculation, synergistically inhibits lung metastasis. Perhaps, a sequence of events is primarily unleashed by the TcCRT anti-angiogenic activity in the tumor. As a response to derived stress, tumor cell CRT is translocated to the external membrane, where it captures C1, an event that promotes tumor phagocytosis by APCs. TAA-derived antigen presentation (Surv included) should follow, with the induction of anti-tumor immune activity. Independently, Surv could also mediate anti-endothelial cell immune activity. Consequently, the slower tumor growth and increased survival of the animals treated with pSurv-rTcCRT is due to the combined effects on different molecular targets, collaborating and enhancing the overall effect. / Fondap

Taenia solium es un céstodo zoonótico cuyo hospedero definitivo es el hombre. Las tenias que infectan al hombre son T. solium y T. saginata, ambas de distribución cosmopolita y causantes de teniosis en el humano. Los métodos convencionales usados para el diagnóstico de esta enfermedad son: la microscopía, que presenta una baja sensibilidad (38% a 78%), el coproantígeno (95.7%) y técnicas moleculares que utilizan DNA del parásito (100% especifica). Sin embargo, este último método requiere equipos e infraestructura sofisticada. A fin de superar estos inconvenientes, en el presente estudio se ha evaluado la utilización del Western blot con el antígeno recombinante rES33 para el diagnóstico serológico de teniosis en humanos causado por T. solium. Así mismo se evaluó la presencia del parásito en muestras pre-tratamiento por microscopía y coproantígeno, resultados que fueron posteriormente comparados con los resultados de serología obtenidos por Western blot. Se trabajó con una población de 472 sueros de pacientes divididos en tres grupos: portadores de T. solium y de T. saginata (confirmados por eliminación del parásito mediante histología y PCR) y pacientes de zonas no endémicas del Perú. La sensibilidad del Western blot con el rES33 fue 97.5% (197/202) y la especificidad fue 100% (0/270). No se obtuvo reacción cruzada con sueros de pacientes positivos a T. saginata. En las muestras de heces pre-tratamiento de los pacientes que eliminaron T. solium, la microscopía y el coproantígeno tuvieron una sensibilidad de 87.8% (172/196) y 92% (150/163) respectivamente. Consideramos que la técnica del Western blot con el antígeno rES33 es una herramienta diagnóstica sensible y especifica para detectar o confirmar teniosis por T. solium. / Taenia solium is a zoonotic cestode whose definitive host is the human. The tapeworms that infect humans are T. solium and T. saginata, and are of cosmopolitan distribution. Conventional techniques for diagnosis of Taenia carriers include the use of microscopy to detect the presence of eggs in feces, a technique that is simple yet has a low sensitivity (38% a 78%), the use of coproantigen which has a grater sensitivity (95.7%) and the use of techniques based on DNA (100% specificity). However, techniques using DNA require sophisticated equipment and infrastructure, as well as the use of expensive reagents. Another alternative for taeniosis diagnosis is the detection of the serum antibody using Western Blot technique. The use of Western blot has been evaluated with the recombinant antigen rES33 for the serological diagnosis of taeniosis as a result of T. solium infection in humans. We collected serum samples from a population of 472 patients and subsequently divided the population into three groups: carriers that eliminated T. solium (202), carriers that eliminated T. saginata (20) and patients residing in non endemic zones of Peru who acted as negative controls (250). The resulting sensitivity of the test was 97.5% (197/202) with a specificity of 100% (0/270), whereas positive analysis by microscopy and coproantigen were 87.8% (172/196) and 92% (150/163) respectively. Furthermore the serum of carriers of T . saginata did not cross react with the recombinant antigen (0/20). Faeces samples were obtained pre-treatment from the patients who eliminated T. solium. We consider the use of the Western blot with rES33 to be an important and an interesting diagnostic tool that can be used to detect or to confirm the presence of taeniosis as a result of infection by T. solium. / Tesis

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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-09T16:34:51Z No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-10T18:20:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T18:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Os anticorpos monoclonais são glicoproteínas especializadas com capacidade de reconhecer outras moléculas (antígenos). Eles são ferramentas importantes na clínica e biotecnologia e têm sido úteis no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas, inflamatórias, imunológicas e neoplásicas, assim como no estudo da interação patógeno/ hospedeiro, e na detecção e quantificação de diversas moléculas. Os anticorpos monoclonais murinos (mAb) apresentam aplicações terapêuticas limitadas devido à sua natureza heteróloga, que pode gerar respostas imunogênicas e consequente a perda de atividade. A incorporação de técnicas de biologia molecular, e engenharia genética e proteomica tem aumentado a produção e utilização de anticorpos monoclonais, desenvolvendo técnicas como hibridoma, quimerização, e humanização de anticorpos monoclonais totalmente humanos. Ao longo dos últimos anos, novas gerações de anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD20 têm sido desenvolvidas para potenciais vantagens sobre a clássica e primeira geração do mAb rituximabe, Apesar de seus sucessos, nem todos os pacientes respondem ao tratamento com rituximabe e quase todos tem um recaída em seu tratamento. Assim, melhorar as propriedades deste anticorpo para melhorar a sua eficácia é muito desejável. Comparado com o rituximabe, novos mAbs têm atividade anti-tumor melhorada, resultante do aumento da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e / ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Neste aspecto, cultivos de células animais são os sistemas de expressão para essas proteínas preferenciais, que requerem modificações póstradução. É assim que o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília tem se interessado pela produção de proteínas heterólogas de interesse clínico em células de mamíferos desde 2001. Este trabalho teve como objetivo a produção de novos anticorpos anti CD-20 na forma de fragmento recombinante FvFc em sistema de expressão heteróloga em células de ovário hamster chinês (CHO-K1) e em células de rim embrionário humano (HEK-293). A eficiência de transfecção para ambas as linhagens celulares foi avaliada comparativamente, bem como a expressão transiente. Os resultados indicam as células de mamífero como um sistema ótimo para a produção de proteínas heterólogas, Os segmentos dos genes correspondentes a três versões recombinantes humanizadas homologas ao anticorpo monoclonal quimérico rituximabe obtidas por CDR graffting (Zaparolli 2015) A, O, e L) e uma versão híbrida elecionada por VL shuffling (H), foram amplificados e clonados num vetor de expressão para células de mamífero. Os resultados mostraram uma eficiência de transfecção e produção de anticorpos menor na linhagem de células CHO-K1 em comparação com HEK-293, embora estas fossem estáveis para a produção de anticorpo em transfectomas estáveis. Os anticorpos recombinantes produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade, quantificados por ELISA, e analisados em relação a sua qualidade por SDS-PAGE, eletroforese capilar (Bioanalyzer) e Western Blotting. Os resultados deste projeto têm demostrado que fomos bem sucedidos na expressão e produção das construções humanizadas do anticorpo anti-CD20. / Monoclonal antibodies are specialized which have the ability to recognize other molecules (antigens). They are important tools in clinical practice and biotechnology and have been useful in the diagnosis and treatment of infectious, inflammatory, immunological and neoplasic diseases, as well as in the study of the host/pathogen interaction, and in the detection and quantification of diverse molecules. Murine monoclonal antibodies (mAb) present limited therapeutic applications because of their heterologous nature, which can generate immunogenic responses and consequent loss of activity. The incorporation of molecular biology, proteic and genetic engineering have extended the production and uses of monoclonal antibodies, finding techniques like hybridoma, chimerization, humanization and fully human monoclonal antibodies. Over the last few years, new generations of anti-CD20 monoclonal antibodies (mAbs) have been developed for potential benefits over the classical, first-generation mAb rituximabe. Despite its successes, not all patients respond to rituximabe therapy and virtually all relapse. Improving the properties of rituximabe to enhance its efficacy further is therefore highly desirable. Compared with rituximabe, new mAbs have enhanced antitumor activity resulting from increased complement-dependent cytotoxicity (CDC) and/or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). In this aspect animal cell, cultures are the preferential expression systems for those proteins, which require extensive posttranslational modifications. Our research group has been interested in the production of heterologous proteins in mammalian cells since 2001. This work aimed the production of new antibodies anti CD-20 as a recombinant FvFc fragment, in heterologous expression system Chinese hamster ovary cells (CHO-K1) and Human Embryonic Kidney cells (HEK-293) the transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression. The results indicate mammalian cells as an optimal system for the production of heterologous proteins, Were amplified and cloned into an expression vector for mammalian cells the corresponding gene segments the three recombinant versions humanized homologous to monoclonal quimeric Rituximabe antibody obtained by CDR graffting (Zaparolli 2015) A,O and L) and a hybrid version selected by VL shuffling (H) . The results showed a lower transfection efficiency and production of antibodies in the CHO-K1 cell lineage compared to HEK- 293 cells, although these were stable for the production of antibody in stable transfectomas. The antibodies were purified by affinity chromatography were analyzed by ELISA, SDS-PAGE, capillary electrophoresis (bioanalyzer) and Western Blotting, for the production and quality of intact immunoglobulin. The results of this project have shown that we have succeeded in the expression and production of humanized constructs anti-CD20 antibody.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-12T17:32:30Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Luciana Santos Cardoso.pdf: 5958883 bytes, checksum: 032370973ff19d5545228b830334d728 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-12T17:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Luciana Santos Cardoso.pdf: 5958883 bytes, checksum: 032370973ff19d5545228b830334d728 (MD5) / A prevalência das doenças alérgicas vem aumentando nas últimas três décadas, representando um grande problema de saúde pública. A infecção pelo Schistosoma mansoni tem sido associada com a proteção contra alergias. Os mecanismos envolvidos nesta associação incluem a produção de células e citocinas regulatórias. Objetivo: Avaliar a resposta imune induzida pelos antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 in vitro em células de indivíduos asmáticos e em modelo experimental de asma induzida por OVA. Métodos: Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos asmáticos não infectados foram estimuladas in vitro com Sm22.6, PIII e Sm29 para caracterizar o perfil de citocinas induzido por estes antígenos. A frequência de células produtoras de IL-10 e a habilidade destes antígenos em modularem a resposta do tipo Th2 alérgeno-específica foram também avaliadas. As citocinas foram mensuradas em sobrenadantes pela técnica de ELISA e os fenótipos das células produtoras de IL-10 foram determinados usando citometria de fluxo. Para o estudo experimental, foi utilizado o modelo de asma induzido por ovalbumina (OVA). Os camundongos receberam três doses dos diferentes antígenos do S. mansoni. A histopatologia e a atividade da peroxidase eosinofílica do pulmão foram avaliadas, assim como a celularidade no lavado brônquio-alveolar (BAL) e os níveis séricos de IgE e de citocinas no BAL. Adicionalmente, foi avaliada a frequência de células TCD4+ expressando Foxp3+ e IL-10+ em culturas estimuladas com OVA. Resultados: Foi observado uma alta produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos não infectados em resposta aos antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 (451 ± 350 pg/mL, 364 ± 289 pg/mL e 712 ± 368 pg/mL, respectivamente), comparados às culturas não estimuladas. Não houve diferença significativa nos níveis de IFN-g, IL-5 e IL-13 após estímulo com os diferentes antígenos. As células CD4+CD25+ e CD14+ foram as principais fontes de IL-10 nas culturas estimuladas com os antígenos do S. mansoni. Além disso, a adição destes antígenos às culturas estimuladas com Der p1 levou a um aumento significativo nos níveis de IL-10 (p<0,0001 para todos os antígenos) e redução nos níveis de IL-5 (p<0,05 para culturas estimuladas com Der p1 e Sm22.6 ou Sm29, comparadas com Der p1 apenas). No modelo murino de asma a imunização com Sm22.6, PIII e Sm29 levou a uma redução no número de células totais e eosinófilos no BAL e nos níveis de IgE específica para OVA, comparados aos camundongos não imunizados. Adicionalmente, os níveis de IL-4 e IL-5 no BAL dos camundongos imunizados com PIII e Sm22.6 foram diminuídos, enquanto que os níveis de IL-10 foram maiores em camundongos imunizados com Sm22.6. A frequência de células TCD4+Foxp3+ foi maior no grupo de camundongos que receberam Sm22.6, Sm29 e PIII, sendo a freqüência de células TCD4+IL-10+ elevada apenas em camundongos imunizados com Sm22.6. Conclusão: Os antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 possuem a habilidade para modular os mediadores inflamatórios alérgicos in vitro por CMSP de indivíduos asmáticos e em modelo murino de asma. Estes antígenos podem representar futuras estratégias para prevenir doenças alérgicas.

Orientador : Christiane Pienna Soares / Banca: Raquel Alves dos Santos / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Banca: André Gonzaga dos Santos / Banca: Luis Octávio Regasini / Resumo: As atividades biológicas e farmacológicas dos biflavonoides são diversas incluindo suas propriedades imunossupressivas, anticancerígenas, antioxidantes, antiangiogênicas, antibacterianas, antivirais e antifúngicas. No presente estudo, avaliou-se a potencial capacidade do biflavonoide morelloflavona, isolada de Garcinia xanthochymus, em modular a expressão de HLA-G (Human Leukocyte Antigen- G), bem como seu potencial efeito quimiopreventivo. Inicialmente, foi avaliado o índice de morte celular causado pela morelloflavona por meio do ensaio de Anexina V - Iodeto de proídio em PBMC (Células mononucleares do sangue periférico), o qual apresentou índices de morte celular significantes. Através da citometria de fluxo observou-se um aumento da expressão de HLA-G vinculado à membrana celular em linhagens de melanoma (FON) (p < 0,001). Pôde-se observar a indução de HLA-G solúvel em linhagens de melanoma transfectada (M8-HLA-G1) (p < 0,001), sem alteração para os demais tipos celulares estudados, pelo ensaio imunoenzimático- ELISA. A expressão de RNAm de HLA-G também foi induzida pela morelloflavona, observada pela RT- PCR, em células de melanoma M8 que não expressam HLA-G constitutivamente. Ainda, foi avaliada a atividade quimiopreventiva da morelloflavona. Observou-se a duplicação da atividade da enzima quinona redutase na linhagem de hepatocarcinoma celular (Hepa1c1c7) por meio do ensaio quinona redutase. Pelo ensaio do cometa foi possível verificar a capacidade genotóxica e antigenotóxica. Em relação à antigenotoxicidade, a morelloflavona causou dano de DNA no pré-tratamento. No pós-tratamento foi observado que a morelloflavona pode ter a capacidade de reverter danos de DNA causados pelo peróxido de hidrogênio. Sendo assim, os dados demonstrados revelam que a morelloflavona induz a expressão de HLA-G e possui efeito quimiopreventivo. / Abstract: The biological and pharmacological activities of biflavonoids are diverse, including their immunosuppressive, anticancer, antioxidant, antiangiogenic, antibacterial, antiviral and antifungal properties. In the present study we assessed the potential ability of morelloflavone, a biflavonoid isolated from Garcinia xanthochymus in modulating the expression of HLA-G (Human Leukocyte Antigen-G), as well as their potential chemopreventive effect. First, we measured the rate of cell death by morelloflavone using Annexin V - Propidium iodide assay in PBMC (peripheral blood mononuclear cells), which showed significant levels of cell death. By flow cytometry was observed the increased expression of HLA-G membrane bound in melanoma cells line (FON) (p < 0.001). Also, was observed the induction of HLA-G soluble in transfected melanoma cells line (M8-HLA-G1) (p < 0.001), with no change to other cell types studied by Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA. The expression of HLA-G mRNA was also induced by morelloflavone, observed by RT-PCR, in melanoma cells (M8) that do not express HLA-G constitutively. Still, we evaluated the chemopreventive activity of morelloflavone. We observed a doubling of quinone reductase enzyme activity in hepatocellular carcinoma cells line (Hepa1c1c7) by quinone reductase assay. By comet assay we were able to verify the genotoxic and antigenotoxic capacity. Regarding antigenotoxicity, morelloflavone caused DNA damage pre treatment. In the posttreatment was observed that morelloflavone may be capable of reversing DNA damage caused by hydrogen peroxide. Thus, the data show that morelloflavone induces the expression of HLA-G and has chemopreventive effect. / Doutor

Resumo não disponível

A epidemia da aids é caracterizada por uma alta heterogeneidade no curso clínico da infecção pelo HIV-1. Enquanto alguns indivíduos progridem para aids em até três anos após a soroconversão, uma pequena parcela, chamada de progressores lentos, permanece assintomática e mantém seus níveis de T-CD4+ estáveis por mais de 10 anos. O papel das moléculas de HLA classe I, tais como HLA-A e HLA-B tem sido investigado para tentar explicar as diferenças observadas na progressão da infecção pelo HIV-1. Estudos recentes têm chamado a atenção para o papel dos genes de classe I não clássicos, como HLA-G, visto que esta molécula está envolvida na supressão da resposta do sistema imunológico durante as infecções virais. No presente estudo, noventa e oito pacientes com critérios bem definidos de progressão à aids foram selecionados, dos quais 48 foram classificados como progressores crônicos, 29 como progressores lentos e 21 como progressores rápidos. Nossos resultados suportam o papel do genótipo homozigoto para HLA na rápida progressão para a aids, assim como a o efeito protetor do alelo HLA-A*3 no tempo de progressão da infecção. Além disso, este é o primeiro trabalho que investiga a influência dos polimorfismos 14pb inserção/deleção e +3142 G/C do gene HLA-G na progressão para a aids e os resultados obtidos apontam para um importante papel desta molécula na progressão da doença. A ausência de marcadores genéticos classicamente envolvidos com a progressão rápida e lenta para a aids, neste grupo de pacientes HIV positivos, enfatiza a importância de estudos genéticos em diferentes populações. / The AIDS epidemic is characterized by an extreme heterogeneity in the clinical course of HIV-1 infection. Whereas some individuals progress to AIDS within three years after seroconversion, a small percentage, called long-term nonprogressors, remain asymptomatic and maintain stable T-CD4+ cell counts for more than 10 years. The role of HLA class I molecules, such as HLA-A and HLA-B, have been investigated to explain the differences observed on progression to AIDS. Recent studies have focused on the potential effect of non-classical HLA I genes, as HLA- G, since this molecule is involved in the suppression of immune responses against viral infections. In the present study, ninety-eight patients with well defined criteria of clinical progression to AIDS were selected, of which 48 subjects were classified as chronic progressors, 29 as long-term nonprogressors and 21 as rapid progressors. Our results support the role of HLA homozygous genotypes on rapid progression to AIDS as well as the protective effect of the HLA-A*3 allele in the progression of the infection. Furthermore, this is the first study that assessed the influence of the HLA-G polymorphisms 14bp insertion/deletion and +3142 G/C on AIDS progression and the results obtained indicate an important role of this molecule on AIDS progression. The absence of classical genetic markers related to rapid and long-term nonprogression to AIDS in this group of HIV-infected patients emphasizes the importance of study genetic diversity among different populations.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-01T01:06:28Z No. of bitstreams: 1 Tese Mestrado MT 2010 Viviane F Meneses.pdf: 1266674 bytes, checksum: 3a1ab36412880125693e28ed53b23715 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-01T01:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Mestrado MT 2010 Viviane F Meneses.pdf: 1266674 bytes, checksum: 3a1ab36412880125693e28ed53b23715 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema de saúde pública, não somente no Brasil, mas em todo o mundo. A disponibilidade de testes diagnósticos data de 1989, quando foi caracterizado o genoma do HCV. A partir desses estudos foi possível o desenvolvimento de testes que permitem a detecção de anticorpos contra o HCV, como os testes imunoenzimáticos (ELISA ou enzyme-linked immunosorbent assay) e RIBA (recombinant immunoblot assay), bem como técnicas para detecção qualitativa e quantitativa do RNA do HCV por meio da reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas para determinação dos genótipos do HCV. Recentemente, foi lançado um teste comercial de detecção simultânea de anticorpos anti-HCV e antígeno core do HCV, cujos estudos têm demonstrado uma redução significativa no período de janela imunológica quando comparado à detecção de anticorpos anti-HCV, tornando-o de grande eficácia para o diagnóstico precoce. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar o desempenho do teste imunoenzimático baseado na detecção simultânea de anticorpos anti-HCV e antígenos core do HCV (Murex HCV Combinação Ag/Ac) no diagnóstico de pacientes com infecção aguda e crônica pelo HCV. A partir da análise do banco de dados do Programa de Diagnóstico Molecular da Hepatite C, foram selecionadas amostras de soro de pacientes com infecção crônica e com resultados inconclusivos de anti-HCV, além de amostras negativas para controle negativo e de um painel de casos agudos de hepatite C. Estas amostras foram submetidas ao teste Murex HCV Combinação Ag/Ac, ao teste de detecção de anticorpos anti-HCV (HCV Ab; RADIM) e testes de detecção qualitativa e quantitativa do HCV-RNA (COBAS AMPLICOR HCV Detection v2.0 e COBASTM AMPLICOR HCV MONITOR v2.0). Os resultados foram registrados em banco de dados criado no programa Access e analisados com auxílio do programa estatístico EpiInfo versão 3.3.2. O teste Murex HCV Combinação Ag/Ac, além de ser de fácil e rápida execução, demonstrou ótimo desempenho em comparação com os outros testes sorológicos e moleculares analisados, sendo 100% eficiente na detecção de amostras reativas independente do genótipo e do subtipo infectante. O teste Murex HCV Combinação Ag/Ac forneceu resultados 100% concordantes com os resultados obtidos pelos outros testes realizados nos diferentes grupos, excetuando-se apenas o grupo de amostras de pacientes com resultados inconclusivos de anti-HCV, onde o teste Murex HCV Combinação Ag/Ac teve uma concordância de 96,4% em relação à detecção de anticorpos anti-HCV. Contudo, o teste Murex HCV Combinação Ag/Ac pode ser uma alternativa para o diagnóstico molecular da infecção pelo HCV em países em desenvolvimento, onde a utilização dos testes baseados em NAT ainda é pouco exequível. / A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema de saúde pública, não somente no Brasil, mas em todo o mundo. A disponibilidade de testes diagnósticos data de 1989, quando foi caracterizado o genoma do HCV. A partir desses estudos foi possível o desenvolvimento de testes que permitem a detecção de anticorpos contra o HCV, como os testes imunoenzimáticos (ELISA ou enzyme-linked immunosorbent assay) e RIBA (recombinant immunoblot assay), bem como técnicas para detecção qualitativa e quantitativa do RNA do HCV por meio da reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas para determinação dos genótipos do HCV. Recentemente, foi lançado um teste comercial de detecção simultânea de anticorpos anti-HCV e antígeno core do HCV, cujos estudos têm demonstrado uma redução significativa no período de janela imunológica quando comparado à detecção de anticorpos anti-HCV, tornando-o de grande eficácia para o diagnóstico precoce. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar o desempenho do teste imunoenzimático baseado na detecção simultânea de anticorpos anti-HCV e antígenos core do HCV (Murex HCV Combinação Ag/Ac) no diagnóstico de pacientes com infecção aguda e crônica pelo HCV. A partir da análise do banco de dados do Programa de Diagnóstico Molecular da Hepatite C, foram selecionadas amostras de soro de pacientes com infecção crônica e com resultados inconclusivos de anti-HCV, além de amostras negativas para controle negativo e de um painel de casos agudos de hepatite C. Estas amostras foram submetidas ao teste Murex HCV Combinação Ag/Ac, ao teste de detecção de anticorpos anti-HCV (HCV Ab; RADIM) e testes de detecção qualitativa e quantitativa do HCV-RNA (COBAS AMPLICOR HCV Detection v2.0 e COBASTM AMPLICOR HCV MONITOR v2.0). Os resultados foram registrados em banco de dados criado no programa Access e analisados com auxílio do programa estatístico EpiInfo versão 3.3.2. O teste Murex HCV Combinação Ag/Ac, além de ser de fácil e rápida execução, demonstrou ótimo desempenho em comparação com os outros testes sorológicos e moleculares analisados, sendo 100% eficiente na detecção de amostras reativas independente do genótipo e do subtipo infectante. O teste Murex HCV Combinação Ag/Ac forneceu resultados 100% concordantes com os resultados obtidos pelos outros testes realizados nos diferentes grupos, excetuando-se apenas o grupo de amostras de pacientes com resultados inconclusivos de anti-HCV, onde o teste Murex HCV Combinação Ag/Ac teve uma concordância de 96,4% em relação à detecção de anticorpos anti-HCV. Contudo, o teste Murex HCV Combinação Ag/Ac pode ser uma alternativa para o diagnóstico molecular da infecção pelo HCV em países em desenvolvimento, onde a utilização dos testes baseados em NAT ainda é pouco exequível.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Leishmania (Viannia) braziliensis é o agente etiológico de mais de 90% dos casos de leishmanioses cutânea e mucocutânea no Brasil. Apesar da alta freqüência no Brasil, poucos estudos de vacinação estão descritos utilizando esta espécie de Leishmania. Com intuito de iniciar os estudos de vacinação experimental contra as leishmanioses cutânea e mucocutânea causada por L. (V.) braziliensis, isolamos os genes que codificam os antígenos LACK, TSA, LeIF e LbSTI1 desta espécie. Os genes foram caracterizados segundo sua seqüência de DNA e transcrição de mRNA nas diferentes formas do parasita. Observamos alta conservação na seqüência predita de aminoácidos quando comparamos as espécies L. (V.) braziliensis e L. (L.) major com identidades de 83% a 96%. Observamos também a presença de mRNA tanto nas formas promastigotas como amastigotas de L. (V.) braziliensis. Em seguida, inserimos estes genes em vetores para expressão em células eucarióticas e procarióticas. As proteínas recombinantes bacterianas foram inicialmente utilizadas para imunização de camundongos. Os anticorpos específicos foram utilizados para confirmar a expressão destes antígenos nas formas promastigotas e amastigotas de L. (V.) braziliensis. Posteriormente, observamos que a imunização de camundongos com plasmídios e proteínas recombinantes dos respectivos antígenos, induziu a produção de anticorpos específicos, com diferenças na magnitude e tipos de subclasse de anticorpo, assim como linfócitos produtores de IFN-γ. Por fim, analisamos a imunidade protetora após o desafio com formas promastigotas de L. (V.) braziliensis. Observamos que a resposta imune desencadeada pela imunização não foi suficiente para reduzir a lesão primária da infecção experimental. Desta parte de nossos estudos concluímos que: i) os quatro antígenos por nós clonados de L. (V.) braziliensis possuem potencial para utilização em estratégias de imunização contra infecção experimental por parasitas do gênero Leishmania; ii) as diferentes estratégias de imunização utilizadas não foram capazes de induzir significativa imunidade contra a infecção experimental com L. (V.) braziliensis. Em paralelo, estudamos o papel da molécula “glucocorticoid-induced tumor necrosis factor family-related receptor” (GITR) durante a infecção experimental com L. (L.) major. Inicialmente, observamos que camundongos geneticamente deficientes que não expressam a molécula GITR foram mais resistentes à infecção, quando comparados ao grupo de animais selvagens. Este aumento na resistência correlacionou com o aumento no número de células T CD4+ produtoras de IFN-γ presente no sítio de infecção. Complementamos estes experimentos, estudando o efeito do tratamento com anticorpos anti-GITR nesta infecção. Observamos que o tratamento com este anticorpo levou a diminuição do número de parasitas no sítio da lesão quando comparado ao grupo controle de animais. Este fenômeno foi correlacionado com a quantidade de IFN-γ produzida por células do linfonodo de drenagem. Destes experimentos pudemos concluir que a molécula GITR tem um papel crítico durante a leishmaniose cutânea causada por L. (L.) major, e que anticorpos anti-GITR tem um potencial para serem utilizados em estratégias de vacinação contra a leishmaniose cutânea potencializando a resposta imune específica. / Leishmania (Viannia) braziliensis is responsible for more than 90% of the cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Brazil. In spite of the high frequency of this parasite in Brazil, few studies of vaccination using this species of Leishmania are described. Aiming at initiating these studies of experimental vaccination against cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis caused by L. (V.) braziliensis, we isolated the genes encoding the antigens LACK, TSA, LeIF e LbSTI1. The genes were characterized according to their DNA sequence and mRNA transcription in the different forms of the parasite. We observed a high conservation in the predicted amino acid sequences when we compared the species L. (V.) braziliensis and L. (L.) major. The identities varied from 83% to 96%. We also observed the presence of mRNA in both forms of L. (V.) braziliensis (promastigotes and amastigotes). Subsequently, we cloned these genes into vectors which allowed their expression into eukaryotic or prokaryotic cells. The bacterial recombinant proteins were initially used to immunize mice. Specific antibodies were used to confirm the expression of these antigens in promastigotes and amastigotes of L. (V.) braziliensis. Subsequently, we observed that the immunization of mice with recombinant plasmids and recombinant proteins representing the distinct antigens induced specific antibodies and IFN-γ producing T cells. Finally, we evaluated the degree of protective immunity after a challenge with promastigotes forms of L. (V.) braziliensis. We observed that the immune response induced by immunization was not sufficient to reduce the primary lesion caused by infection. From these results we concluded that: i) all four antigens isolated from L. (V.) braziliensis have the potential to be used for immunization against experimental infection by different species of Leishmania; ii) the different strategies of immunization used were not capable of inducing significant immunity to experimental infection with L. (V.) braziliensis. In parallel, we studied the role of the glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor family-related protein (GITR) during infection with L. (L.) major. Initially, we observed that genetically deficient mice which do not express GITR were more resistant to infection when compared to wild type animals. The resistance correlated with the increased number of IFN-γ producing CD4+ T cells in the infection site. We complemented these experiments, studying the effect of the treatment with antibodies to GITR during infection. We observed that treatment with these antibodies led to reduction in the number of parasites in the lesion site when compared to control animals. The reduction was correlated with the amount of IFN-γ produced by lymph node cells. From these experiments we concluded that GITR has a critical role during cutaneous leishmaniasis caused by L. (L.) major and that antibodies to GITR may have a potential to be used for vaccination against cutaneous leishmaniasis improving the specific immune response. / BV UNIFESP: Teses e dissertações