Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-09T16:34:51Z No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-10T18:20:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T18:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Os anticorpos monoclonais são glicoproteínas especializadas com capacidade de reconhecer outras moléculas (antígenos). Eles são ferramentas importantes na clínica e biotecnologia e têm sido úteis no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas, inflamatórias, imunológicas e neoplásicas, assim como no estudo da interação patógeno/ hospedeiro, e na detecção e quantificação de diversas moléculas. Os anticorpos monoclonais murinos (mAb) apresentam aplicações terapêuticas limitadas devido à sua natureza heteróloga, que pode gerar respostas imunogênicas e consequente a perda de atividade. A incorporação de técnicas de biologia molecular, e engenharia genética e proteomica tem aumentado a produção e utilização de anticorpos monoclonais, desenvolvendo técnicas como hibridoma, quimerização, e humanização de anticorpos monoclonais totalmente humanos. Ao longo dos últimos anos, novas gerações de anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD20 têm sido desenvolvidas para potenciais vantagens sobre a clássica e primeira geração do mAb rituximabe, Apesar de seus sucessos, nem todos os pacientes respondem ao tratamento com rituximabe e quase todos tem um recaída em seu tratamento. Assim, melhorar as propriedades deste anticorpo para melhorar a sua eficácia é muito desejável. Comparado com o rituximabe, novos mAbs têm atividade anti-tumor melhorada, resultante do aumento da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e / ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Neste aspecto, cultivos de células animais são os sistemas de expressão para essas proteínas preferenciais, que requerem modificações póstradução. É assim que o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília tem se interessado pela produção de proteínas heterólogas de interesse clínico em células de mamíferos desde 2001. Este trabalho teve como objetivo a produção de novos anticorpos anti CD-20 na forma de fragmento recombinante FvFc em sistema de expressão heteróloga em células de ovário hamster chinês (CHO-K1) e em células de rim embrionário humano (HEK-293). A eficiência de transfecção para ambas as linhagens celulares foi avaliada comparativamente, bem como a expressão transiente. Os resultados indicam as células de mamífero como um sistema ótimo para a produção de proteínas heterólogas, Os segmentos dos genes correspondentes a três versões recombinantes humanizadas homologas ao anticorpo monoclonal quimérico rituximabe obtidas por CDR graffting (Zaparolli 2015) A, O, e L) e uma versão híbrida elecionada por VL shuffling (H), foram amplificados e clonados num vetor de expressão para células de mamífero. Os resultados mostraram uma eficiência de transfecção e produção de anticorpos menor na linhagem de células CHO-K1 em comparação com HEK-293, embora estas fossem estáveis para a produção de anticorpo em transfectomas estáveis. Os anticorpos recombinantes produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade, quantificados por ELISA, e analisados em relação a sua qualidade por SDS-PAGE, eletroforese capilar (Bioanalyzer) e Western Blotting. Os resultados deste projeto têm demostrado que fomos bem sucedidos na expressão e produção das construções humanizadas do anticorpo anti-CD20. / Monoclonal antibodies are specialized which have the ability to recognize other molecules (antigens). They are important tools in clinical practice and biotechnology and have been useful in the diagnosis and treatment of infectious, inflammatory, immunological and neoplasic diseases, as well as in the study of the host/pathogen interaction, and in the detection and quantification of diverse molecules. Murine monoclonal antibodies (mAb) present limited therapeutic applications because of their heterologous nature, which can generate immunogenic responses and consequent loss of activity. The incorporation of molecular biology, proteic and genetic engineering have extended the production and uses of monoclonal antibodies, finding techniques like hybridoma, chimerization, humanization and fully human monoclonal antibodies. Over the last few years, new generations of anti-CD20 monoclonal antibodies (mAbs) have been developed for potential benefits over the classical, first-generation mAb rituximabe. Despite its successes, not all patients respond to rituximabe therapy and virtually all relapse. Improving the properties of rituximabe to enhance its efficacy further is therefore highly desirable. Compared with rituximabe, new mAbs have enhanced antitumor activity resulting from increased complement-dependent cytotoxicity (CDC) and/or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). In this aspect animal cell, cultures are the preferential expression systems for those proteins, which require extensive posttranslational modifications. Our research group has been interested in the production of heterologous proteins in mammalian cells since 2001. This work aimed the production of new antibodies anti CD-20 as a recombinant FvFc fragment, in heterologous expression system Chinese hamster ovary cells (CHO-K1) and Human Embryonic Kidney cells (HEK-293) the transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression. The results indicate mammalian cells as an optimal system for the production of heterologous proteins, Were amplified and cloned into an expression vector for mammalian cells the corresponding gene segments the three recombinant versions humanized homologous to monoclonal quimeric Rituximabe antibody obtained by CDR graffting (Zaparolli 2015) A,O and L) and a hybrid version selected by VL shuffling (H) . The results showed a lower transfection efficiency and production of antibodies in the CHO-K1 cell lineage compared to HEK- 293 cells, although these were stable for the production of antibody in stable transfectomas. The antibodies were purified by affinity chromatography were analyzed by ELISA, SDS-PAGE, capillary electrophoresis (bioanalyzer) and Western Blotting, for the production and quality of intact immunoglobulin. The results of this project have shown that we have succeeded in the expression and production of humanized constructs anti-CD20 antibody.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-20T16:07:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-03T17:53:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-03T17:53:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Atualmente no Brasil ocorrem cerca de 20.000 acidentes ofídicos anuais, sendo 90% deles causados por serpentes do gênero Bothrops. A soroterapia ainda é o tratamento mais comum para acidentes com animais peçonhentos, apesar da toxicidade gerada pela utilização de anticorpos eqüinos. Esse tratamento pode induzir inflamação, falência renal e até choque anafilático. Entretanto atualmente vários estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de minimizar esses efeitos colaterais, incluindo o desenvolvimento de anticorpos mais específicos e menos imunogênicos, que poderiam substituir ou até mesmo atuar em conjunto com a soroterapia convencional. A fosfolipase A2 (PLA2) é o principal antígeno encontrado no veneno da serpente Bothrops atrox e é o responsável pela miotoxicidade, inflamação e necrose. Anticorpos monoclonais (mAbs) contra esse antígeno foram produzidos em camundongos e se mostraram capazes de neutralizar eficientemente a atividade miotóxica dessa PLA2 (Kanashiro et al., 2002). O objetivo desse trabalho foi então humanizar o anticorpo anti-PLA2 A85/9-4 produzido por Kanashiro e colaboradores (2002), visando o seu uso clínico no tratamento de envenenamentos com essa serpente. Inicialmente os genes codificadores das cadeias variáveis leve e pesada do mAb foram seqüenciadas a partir da clonagem do cDNA de imunoglobulina vindo do hibridoma. Para humanizar esse anticorpo as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) murinas foram transferidas para arcabouços humanos germinais escolhidos em bancos de dados devido a sua alta similaridade com as seqüências murinas. A porção variável (Fv) humanizada proposta tem apenas 16 resíduos de aminoácidos não-humanos na cadeia leve e 9 na cadeia pesada. As seqüências codificadoras das porções variáveis foram sintetizadas e clonadas na forma de scFv (fragmento variável de cadeia única) em vetor de expressão em Pichia pastoris. Entretanto, durante a expressão do scFv verificou-se a formação de agregados no sobrenadante de cultura, dificultando sua purificação e comprometendo o rendimento. Para diminuir essa agregação as porções variáveis do anti-PLA2 foram então clonadas e expressas na forma de FvFc o que tornou possível a purificação e a realização dos testes de afinidade do anticorpo humanizado. O fragmento FvFc recombinante se mostrou capaz de reconhecer tanto o extrato bruto da peçonha quanto a fosfolipase purificada, além de ter sua ligação inibida pela presença do mAb original. Os testes in vitro sugerem que os FvFcs humanizados possam apresentar desempenho similar ao mAb em futuros testes de neutralização in vivo. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nowadays in Brazil there are about 20000 snake accidents annualy and 90% of them are with the Bothrops species. The serotherapy is the commonest treatment to animal poison accidents, despite of the toxicity triggered by equine antibody utilization. This conduct can induce inflammation, kidney failure and anaphylactic shock. Nowadays several studies have been developed to minimize these collateral effects included the developing of more especific and less immunogenic antibodies that could be used to substitute the conventional serotheraphy or in association with this treatment. The Phospholipase A2 (PLA2) is the principal antigen found in the Bothrops atrox venom and causes miotoxicity, inflammation and necrosis. Monoclonal antibodies (mAbs) against this antigen were produced in mice and were able to neutralize the miotoxic activity of PLA2 efficiently (Kanashiro et al., 2002). The objective of this work was to develop a humanized form of the antibody anti-PLA2 A85/9-4 produced by Kanashiro et al (2002), aiming its clinical use for snake poisoning treatment. Initially the light and heavy chains of the mAb were determined by cloning Ig cDNA from mAb´s hybridoma. To humanize this antibody, the light and heavy chain’s CDRs of the murine mAb were transferred to a human framework, chose on the database of human germline V genes because their high similarity with the murine sequences. The proposed Fv has 16 non-human residues in the light chain and 9 in the heavy chain. The sequences of the variables regions were synthesized and initialy cloned as a scFv (single chain variable fragment) in expression vector for Pichia pastoris heterologous expressions. But during the expression this form induced agregation and couldn’t be purified. To minimize this agregation the variable regions of the anti-PLA2 were cloned as a FvFc fragment and in this form was possible the purification and tests of afinity of the humanized form. The recombinant FvFc antibody fragment was able to recognize the total venom and the purified PLA2. And was inhibit by the original mAb. The results of the in vitro tests suggest that the humanized FvFcs can be similar results of the original mAb in in vivo neutralization tests.