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Variabilidad de la resuesta de las células dendríticas humanas ante distintos serotipos de Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Yáñez Figueroa, Juan Pablo January 2012 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto complete de su tesis en el programa de tesis Electrónicas / Las periodontitis son enfermedades infecciosas cuya causa es la interacción entre el biofilm patogénico que coloniza el microambiente subgingival y la respuesta inmuno-inflamatoria del hospedero. Esta interacción provoca la destrucción de los tejidos de soporte periodontal: cemento radicular, ligamento periodontal y hueso alveolar, y eventualmente puede llevar a la pérdida de los dientes. Aggregatibacter actinomycetemcomitans es una bacteria ampliamente asociada al inicio, progresión y severidad de las periodontitis. Sin embargo, aunque esta bacteria puede causar daño directo a los tejidos periodontales, es la respuesta inmune del hospedero inducida ante los periodontopatógenos el principal determinante del carácter destructivo de la enfermedad. Sobre la base de la antigenicidad del polisacárido O componente del LPS, en A. actinomycetemcomitans se describen 6 serotipos bacterianos distintos y entre ellos se ha especulado una virulencia variable y una distinta patogenicidad. Con el objeto de establecer diferencias de inmunogenicidad que contribuirían a explicar esta variable virulencia y patogenicidad, en este trabajo de investigación se analizó la respuesta de las células dendríticas humanas al ser estimuladas in vitro con los distintos serotipos de A. actinomycetemcomitans, definiendo mediante PCR el tipo de receptores CCR expresado y mediante ELISA el patrón de citoquinas secretado. Los datos obtenidos en este trabajo de investigación permiten establecer que los niveles de expresión de CCRs y de secreción de citoquinas son diferentes en las células dendríticas humanas cuando son estimuladas con los distintos serotipos de A. actinomycetemcomitans, con mayores niveles de secreción de IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23, IFN-γ y TNF-α cuando el microorganismo estimulante fue la cepa ATCC® 43718™ (serotipo b). Por lo tanto, es factible especular que el serotipo b de A. actinomycetemcomitans induciría predominantemente un patrón de respuesta inmune tipo Th1 y/o Th17 durante las periodontitis.
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Variabilidad de la resuesta de las células dendríticas humanas ante distintos serotipos de Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Yáñez Figueroa, Juan Pablo January 2012 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Las periodontitis son enfermedades infecciosas cuya causa es la interacción entre el biofilm patogénico que coloniza el microambiente subgingival y la respuesta inmuno-inflamatoria del hospedero. Esta interacción provoca la destrucción de los tejidos de soporte periodontal: cemento radicular, ligamento periodontal y hueso alveolar, y eventualmente puede llevar a la pérdida de los dientes. Aggregatibacter actinomycetemcomitans es una bacteria ampliamente asociada al inicio, progresión y severidad de las periodontitis. Sin embargo, aunque esta bacteria puede causar daño directo a los tejidos periodontales, es la respuesta inmune del hospedero inducida ante los periodontopatógenos el principal determinante del carácter destructivo de la enfermedad. Sobre la base de la antigenicidad del polisacárido O componente del LPS, en A. actinomycetemcomitans se describen 6 serotipos bacterianos distintos y entre ellos se ha especulado una virulencia variable y una distinta patogenicidad. Con el objeto de establecer diferencias de inmunogenicidad que contribuirían a explicar esta variable virulencia y patogenicidad, en este trabajo de investigación se analizó la respuesta de las células dendríticas humanas al ser estimuladas in vitro con los distintos serotipos de A. actinomycetemcomitans, definiendo mediante PCR el tipo de receptores CCR expresado y mediante ELISA el patrón de citoquinas secretado. Los datos obtenidos en este trabajo de investigación permiten establecer que los niveles de expresión de CCRs y de secreción de citoquinas son diferentes en las células dendríticas humanas cuando son estimuladas con los distintos serotipos de A. actinomycetemcomitans, con mayores niveles de secreción de IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23, IFN-γ y TNF-α cuando el microorganismo estimulante fue la cepa ATCC® 43718™ (serotipo b). Por lo tanto, es factible especular que el serotipo b de A. actinomycetemcomitans induciría predominantemente un patrón de respuesta inmune tipo Th1 y/o Th17 durante las periodontitis.
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Células dendríticas inductoras de una respuesta tolerogénica

Aravena Madariaga, Octavio Alexis January 2006 (has links)
Memoria para optar al título de Bioquímico / Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno (APC) profesionales que juegan un papel principal en la iniciación de la respuesta inmune primaria y secundaria. Se encuentran en distintos estados funcionales. En estado inmaduro residen en tejidos no linfoides y poseen una alta capacidad para capturar y procesar el antígeno. Una vez que han sido expuestas a un ambiente inflamatorio o presencia de lipopolisacárido (LPS), disminuyen su capacidad de capturar el antígeno, incrementan la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y de moléculas co estimuladoras como CD80 y CD86. El antígeno es presentado como un complejo péptido-MHC clase I y/o II que es reconocido por células T CD8+ y CD4+, respectivamente. Hemos logrado obtener DCs derivadas de médula ósea (BMDC) de ratones DBA1/lacJ tras 7 días de cultivo en presencia de factor estimulante de colonias monocíticas y macrofágicas (GM-CSF) caracterizándolas fenotípica y funcionalmente en tres estados de maduración o diferenciación. El estado inmaduro de las DCs se obtuvo por pre tratamiento en cultivo con IL-10, éstas poseen una alta capacidad fagocítica representado por su propiedad de capturar un péptido sintético marcado (Dextran-FITC). Poseen bajos niveles de expresión de la molécula coestimuladora CD86 y de CD40, alta secreción de citoquinas anti inflamatorias como IL-10 y baja producción de IL-12p70. Bajo estimulación con LPS de E. coli por 24 horas, las DCs muestran un fenotipo maduro, caracterizado por una baja capacidad de capturar Dextran-FITC, una regulación positiva de CD40 y CD86, disminución en la secreción de IL-10 y un aumento de IL-12p70. Finalmente, se obtuvo un estado intermedio mediante un estímulo de LPS de E.coli por 4 horas, que al igual que con TNFa por 24 horas, exhibe características fenotípicas y funcionales indicadoras de un estado semi-maduro. Esta última población corresponde a DCs con características reguladoras o tolerogénicas capaces generar una respuesta in vivo en el modelo murino de artritis inducida por colágeno bovino tipo II (CIA), que se demostró por la inoculación intraperitoneal post inducción de la CIA, con BMDC estimuladas con LPS por 4 horas y cargadas con CII. Se midieron parámetros clínicos de inflamación como edema e índice artrítico en las extremidades de los animales sometidos a la inmunoterapia, logrando una disminución de estos parámetros en los ratones inoculados con BMDC comparados con controles CIA y CIA inoculados con BMDC estimuladas por 4 horas con LPS sin cargar. Estos hallazgos sugieren un re establecimiento de la tolerancia al CII inductor del proceso autoinmune. / Dendritics cells (DC) are professional antigen presenting cells (APC), that play a main role in the initiation of the primary and secondary immune responses. DCs can be found in different functional stages. In an immature state they reside in lymphoid nodes, presenting a high capacity to capture and process the antigen. Once they have been exposed to danger signals like lipopolisacaride (LPS), DCs show an increases expression of the major complex histocompatibility (MHC), co stimulatory molecules (CD80 y CD86) and CD40, and a reduction in their antigen capture capability. Antigens are presented as peptides complexed MHC class I and II molecules which are recognized by CD8+ and CD4+T cells, respectively. We have generated bone marrow derived DC (BMDC) from DBA1/lacJ mice after 7 days of culture in the presence of GM-CSF. These DCs were characterized phenotypically and functionally displayed three stages according the stimulus that were subjected characterized maturation. Immature stage was obtained by the pre treatment of BMDC with IL-10. These DCs have a high endocitic capacity given by their ability to capture a synthetic peptide (Dextran-FITC), They also show low levels of CD40 and CD86, high secretion of anti inflammatory cytokine, IL-10 and, a low production of IL-12p70. Under stimulation with LPS from E. coli for 24 hours, BMDC show a diminished capacity to capture Dextran-FITC, up-regulate CD40 and CD86 expression, a reduce IL-10 secretion and increase IL-12p70 secretion. An intermediate phenotypic and functional stage was obtained when BMDC were pre-treated with a single stimulus of LPS for E. coli by 4 hours, or with TNFα for 24 hours. These semi-mature BMDC with tolerogenic characteristics allows us to perform in vivo challenge. Thus, using the murine model of type II collage-induced arthritis (CIA), we demonstrate by single ip. Inoculation of 4 hours LPSstimulated BMDC, that unlike BMDC without CII, CII pulsed BMDC interfere with arthritis progression. The clinical parameters evaluated were arthritis index and edema in all mouse. Both parameters showed better scores when compared to CIA controls or group of mice inoculated with 4 hours LPS-stimulated BMDC unloaded with CII. These findings suggest a CII tolerance reestablishment responsible of the autoimmune process
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Rol de caveolina-1 en la quimiotaxis de las células dendríticas hacia los nódulos linfáticos

Cruz Gómez, Sebastián Matías January 2017 (has links)
Tesis para optar al grado de Magister en Bioquímica / Las células dendríticas (DCs) son células presentadoras de antígeno capaces de capturar y procesar antígenos que luego son presentados a linfocitos T específicos en órganos linfoides. Para activar a los linfocitos T, las DCs deben pasar por un proceso de maduración y migración hacia los nódulos linfáticos. Para esto, las DCs deben percibir el rastro de quimioquinas como CCL21, a través de receptores como CCR7, que las dirigen hacia los vasos linfáticos y finalmente al nódulo linfático. Dicho proceso se denomina quimiotaxis y es dependiente de la formación protrusiones celulares formadas por haces de filamentos de actina, que están especializadas en percibir el medio por el cual transita la célula. Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, la cual se ha relacionado con la migración celular, regulando a las GTPasas pequeñas Rac-1 y Cdc42, por lo tanto incidiendo en la capacidad de la célula de reorganizar el citoesqueleto y formar protrusiones celulares. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que caveolina-1 aumenta su expresión en DCs al ser estimuladas con LPS y que juega un rol fundamental en la llegada de las DC al nódulo linfático, así como en la generación de la respuestas de linfocitos T CD8+ citotóxicos in vivo. Sin embargo, caveolina-1 no participa en la maduración de las DCs ni en su capacidad de activar linfocitos T CD8+ in vitro. En este trabajo postulamos que caveolina-1 promueve la llegada de DCs al nódulo linfático regulando su capacidad quimiotáctica a través de la generación de filopodios vía Rac-1 o Cdc42. A través de ensayos de tinción cutánea con FITC, observamos que las DCs Cav-1-/- llegan en menor número al nódulo linfático en comparación a las DCs silvestres. Además, se evidenció que las DCs Cav-1-/- poseen una capacidad quimiotáctica disminuída en respuesta a CCL21 en cámaras de Boyden, no así en matrices de colágeno. A nivel molecular, se observó que las DCs Cav-1 -/- poseen menos actividad de Rac-1, pero no de Cdc42, y un menor número de filopodios con respecto a las DCs silvestres. Este trabajo sugiere que caveolina-1 favorece la llegada de las DCs al nódulo linfático, promoviendo la actividad de Rac1 y la formación de filopodios, lo que les permite entrar o migrar a través de los vasos linfáticos
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Generación y caracterización de células dendríticas tolerogénicas en pacientes con artritis reumatoide

Aguirre Ducler, Adam Jesús January 2008 (has links)
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica autoinmune que se caracteriza por la inflamación crónica y progresiva de las articulaciones sinoviales llevando a la destrucción del cartílago y hueso articular. En la AR existe consenso que el proceso autoinmune involucra una presentación anormal de auto-antígenos por parte de células presentadoras de antígeno o células dendríticas (DC), que llevaría a la activación de células T CD4+ auto-reactivas, secretoras de interferón gamma e interleuquina (IL)-17, que inducen en los macrófagos, la secreción de IL-1, IL-6 y factor de necrosis tumoral Durante la última década, el desarrollo de técnicas para generar gran número de DC in vitro junto con el entendimiento del rol de las DC en la tolerancia periférica, han permitido producir DC con propiedades tolerogénicas y reguladoras. En este contexto, en esta Tesis se generaron in vitro DC de pacientes AR a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), mediante el cultivo en presencia de IL-10 se buscó generar DC con propiedades tolerogénicas. Estas células se caracterizaron fenotípicamente mediante citometría de flujo y morfológicamente mediante microscopía confocal, además se caracterizaron en cuanto a expresión de citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias; por último se realizaron ensayos funcionales in vitro de fagocitosis de inhibición de la alo-proliferación. Como resultado, se generaron DC de pacientes AR con características tolerogénicas utilizando IL-10, estas células poseen una menor expresión en superficie celular de los marcadores CD83, CD40 y CD86 y las moléculas MHC clase II con relación a las DC maduras. Expresan en su superficie el receptor de quimioquinas CCR7, lo cual nos indica que son células con capacidad de migración a órganos linfoides secundarios. El uso de IL-10 permite generar DC productoras de TGF e IL-10, con una baja producción de IL-12 en relación a las DC maduras. Por último, estas DC poseen una elevada capacidad endocítica y una disminuida capacidad de inducción de alo-proliferación. También es importante destacar que estas DC no difieren a las generadas a partir de PBMC de individuos normales en cuanto a las características fenotípicas y funcionales ya mencionadas. Por lo tanto, estos resultados sugieren que en los pacientes AR, las DC se pueden modular hacia un fenotipo tolerogénico, lo cual podría transformarse en una estrategia terapéutica a considerar.
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Caracterização celular e imunológica da interação células dendríticas- Leishmania braziliensis

Jaramillo, Tatiana María Giraldo 16 May 2014 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-07T13:04:23Z No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T14:05:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TatianaMariaGiraldoJaramillo.pdf: 3709622 bytes, checksum: febfca93298a6da4512196ad16ff3e02 (MD5) / A infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis tem um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas. Uma variedade de células estão envolvidas na defesa do hospedeiro contra o parasito. Entre elas, as células dendríticas (DCs) são elementos chaves para o sistema imune, pois atuam como sentinelas na periferia e alertam os linfócitos T do tipo do antígeno invasor, direcionando sua polarização e inicializando uma resposta imune. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar a interação de células dendríticas humanas com L. braziliensis, já que, esse contato desencadeia estímulos para a produção de citocinas e moléculas co-estimulatórias envolvidas na resposta inflamatória, contribuindo para o desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. Assim, monócitos humanos foram isolados a partir de células mononucleares de sangue periférico, purificados por separação magnética e colocados em cultura com IL-4 e GM-CSF para gerar DCs imaturas, as quais foram infectadas com promastigotas de L. braziliensis durante 12 e 24 h. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo, usando os marcadores de superfície CD1a, HLA-DR, CD86 (B7-2)e DC-SIGN (CD209). Foi observada uma taxa de infecção de 46±3.5% com 7,2±0.6 amastigotas/DCs e 52.5± 2.4% com 6,1±1.6 amastigotas/DCs após 12 e 24 h de cultura, respectivamente. Os marcadores de superfície revelaram uma porcentagem de expressão de 70,5% (CD1a), 87,9% (HLA-DR), 94% (CD86) e 97,5% (DC-SIGN) nas células não infectadas; e 71% (CD1a), 89,9% (HLA-DR), 98,3% (CD86) e 97% (DC-SIGN) para células infectadas após 24 h. Após 12 h de infecção não detectamos alterações no padrão de expressão de moléculas de superfície. A inibição da apoptose pode tanto favorecer a apresentação dos antígenos quanto a disseminação do parasito. Além disso, foram encontradas principalmente as citocinas IL-12p40 e TNF-α nos sobrenadantes das culturas, enquanto não detectamos as citocinas IL-10, IL-6, IL-1β e TGF-β. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmania (Viannia) braziliensis infection leads to a broad spectrum of clinical and immunological manifestations. A great variety of cells is involved in host defense against the parasite. Among those, dendritic cells (DCs) are key elements of the immune system, which acts as sentinels in the periphery and alert T lymphocytes about the type of invading antigen, addressing their polarization and initiating an early immune response. The aim of this work was study the interaction of human dendritic cells with L. braziliensis, this contact triggers stimuli for the production of cytokine and co-stimulatory molecules involved in the inflammatory response, contributing to the development of protective adaptive immune response. Thereby, monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells, subsequently purified by magnetic separation, and cultured with IL-4 and GM-CSF to generate immature DCs, which were infected with L. braziliensis promastigotes during 12 e 24 h. The cells where characterized by flow cytometry using surface markers CD1a, HLA-DR, CD86 and DC-SIGN. It was observed an infection rate of 46±3.5% with 7,140±0.6 amastigotes/DC and 52.50± 2.4% with 6,1±1.6 amastigotes/DC 12 and 24 h post infection, respectively. The surface markers showed a percentage of expression of 70.5% (CD1a), 87.9% (HLA-DR), 94% (CD86) and 97.5% (DC-SIGN) in non-infected cells; and 71% (CD1a), 89.9% (HLA-DR), 98.3% (CD86) and 97% (DC-SIGN) in infected cells after 24 h infection. After 12 h of infection, we not detected differences of surface molecules expression. Moreover, cell death delay can either stimulate antigen- presentation or favor parasite dissemination. Additionally, the cytokines IL-12p40 and TNF- α were detected in the culture supernatants, whereas IL-10, IL-6, IL-1β and TGF-β were not detected.
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Efecto de Hemocianinas de Moluscos en la Maduración de Células Dentríticas Murinas

Campo Zaldívar, Miguel Ignacio del January 2007 (has links)
Memoria para optar al Título de Bioquímico / Las hemocianinas son glicoproteínas transportadoras de oxígeno presentes en algunos moluscos y artrópodos. Son conocidas por su poderosa inmunogenicidad en mamíferos, siendo utilizadas como proteínas transportadoras de haptenos para obtener anticuerpos contra haptenos, en vacunas y como inmunoestimulante no específico en el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Para estas aplicaciones la hemocianina más utilizada proviene de la lapa Californiana M. crenulata (KLH). Hemos demostrado que la hemocianina del gastrópodo Chileno C. concholepas (CCH), si bien difiere de KLH en su origen y estructura, posee cualidades inmunomoduladoras equivalentes, incrementando la actividad de células NK, e induciendo respuestas inmunes de tipo Th1. En este trabajo, se estudió el efecto de CCH sobre células dendríticas (DCs) murinas, consideradas las células presentadoras de antígeno por excelencia, y por tanto, las células moduladoras de la respuesta inmune. Postulamos que CCH induce la maduración de DCs, activando la inmunidad innata y adaptativa, vía procesamiento y presentación de CCH a células T naive, generando un ambiente de interleuquinas inmunoestimulante en los tejidos linfoides. En primer lugar, se estudió la cinética de incorporación de CCH in vitro, en DCs aisladas por selección magnética a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6. Para el análisis, se emplearon diversas técnicas microscópicas de luz y electrónica, y de citometría de flujo; así como CCH marcada con fluorocromos o anticuerpos específicos contra ella. Se encontró que CCH fue incorporada rápidamente por DCs (CD11c+) vía endocitosis mediada por vesículas con clatrina, localizándose posteriormente en lisosomas secundarios. Se determinó el efecto de CCH sobre la maduración de DCs cultivadas in vitro, mediante la expresión de los marcadores de superficie MHCI, MHCII y CD86, y también mediante la secreción de IL12 y la pérdida de la capacidad fagocítica. Como control positivo se utilizó LPS, el cual produjo un aumento significativo de todos los marcadores a las 24 h. Las DCs tratadas con CCH no mostraron diferencias con las DCs control hasta las 72h de cultivo. Sin embargo, a este tiempo, se encontró que por efecto de CCH, las DCs aumentaron la expresión del marcador lisosomal Lamp, sugiriendo que dicha proteína se procesa lentamente. Evidencia adicional mediante Western blot, mostró fragmentos de hemocianina en torno a 50 kDa hasta las 54 h de incubación, no siendo detectados a las 72 h. Resultados diferentes se encontraron cuando las DCs fueron cocultivadas con células NK purificadas, aumentó la expresión de MHCII y CD86 como asimismo, la secreción de IL12 e INFγ por efecto de CCH en asociación al contacto entre las células, confirmando una modulación positiva de la hemocianina en la interacción NK/DC. Al estudiar la importancia del tamaño de CCH y la presencia de azúcares en su estructura sobre su inmunogenicidad, evaluando la respuesta inmune humoral de ratones de dos cepas diferentes (C57BL/6 y C3H/HeJ), se encontró que, ni la pérdida de su estructura cuaternaria ni de sus azúcares disminuyeron la inmunogenicidad de la proteína, por el contrario, se observó que el título de anticuerpos se mantuvo similar o aumentó al inmunizar los ratones con las proteínas desglicosiladas en comparación a las nativas. Sin embargo, estas moléculas no aumentaron la secreción de IL12 en DCs cultivadas in vitro, señalando nuevamente la importancia de las células del sistema inmune innato, como las células NK, en la vía de acción de las hemocianinas. Finalmente, este es el primer trabajo donde se aborda experimentalmente el mecanismo de inmunoestimulación de hemocianinas, estableciéndose que la proteína es procesada lentamente por parte de las DCs, y que en la respuesta de tipo Th1 que ellas modulan, la comunicación NK/DC es fundamental / Hemocyanins are glycoproteins that function as oxygen transporters in some mollusks and arthropods. They are known by their powerful immunogenicity in mammals, and therefore are widely used as hapten-carrier to produce antibodies, in vaccine development, and as non specific inmunoestimulant for the treatment of some types of cancer. The hemocyanin known as KLH obtained from the Californian limpet M. crenulata has been exclusively used for the above purposes. We demonstrated that CCH, the hemocyanin from the Chilean gastropod C. concholepas, although differ in origin and structure; have similar immunomodulatory properties, increasing the activity of NK cells, and inducing a type Th1 immune response. Considering the pivotal role of dendritic cells (DCs) in the modulation of immunity, it is of interest to determine the relationship among the structural features of hemocyanins and their effect on DCs maturation and how they specifically modulate their functions. We postulated that CCH induce DC maturation by activating the innate and adaptive immunity, trough CCH processing and presentation, to specific naïve T lymphocyte, leading to an immunostimulant interleukin environment in lymphoid tissues. First, we analyzed the kinetics of CCH uptake by DCs obtained from bone marrow precursors of C57BL mice, isolated by magnetic sorting and cultured in vitro. The uptake of CCH was studied using diverse microscopic techniques and flow cytometry. To track the protein, we used fluorescent conjugates of CCH and specific anti CCH antibodies. We found that CCH is quickly internalized by clathrin-mediated endocytosis vesicles, and after that, it was localized in secondary lysosomes. The effect of CCH on DC maturation, was investigated by the analyses of the expression of surface molecules as MHCI, MHCII and CD86, as well as by IL12 secretion and the lost of fagocitic activity. As a positive control we used DCs treated with LPS, which modify these parameters after 24h of culture. DCs treated with CCH did not show differences up to 72 h with respect to the control DCs. At this time, an increased of the expression of the lysosome membrane glycoprotein Lamp was observed, suggesting that CCH is gradually processed. We found additional evidence for a slow processing by DCs, since, fragments of size around 50 kDa, were detected by Western blot up to 54 h, and disappears at the 72h. In contrast to these results, when DCs were cocultured with purified NK cells in the presence of CCH, an increase in the expression of MHCII and CD86 surface molecules and secretion of IL12 and INFγ was observed. The above effects of CCH were boosted when both cellular types were put in contact, indicating that the NK and DCs contact is necessary for the modulation of DCs by CCH. Next, we studied the influence of the size and the sugar moieties of CCH in their immunostimulatory effect, trough the study of the humoral immune response against deglicosilated subunits of CCH, and native subunits as control. The results showed that the inmunoestimulant capacity was not decreased; on the contrary, the titers of antibodies were higher against the deglicosilated proteins than the native ones. However, the increased immunogenicity of the deglicosilated CCH did not correlate with the secretion of IL12 in isolated DCs cultured in vitro, suggesting again, the importance of cells of the innate immune cells, as NK, in the mechanisms of action of the hemocyanins. In conclusion, this work is the first experimental approached to get inside the fine immunomodulatory mechanism of mollusk hemocyanins, using CCH as model. The main conclusions that can be drawn from this work are that CCH is slowly processed by the DCs, and that the NK/DC interaction is required for the effect on DCs in vitro and in vivo
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Participação do TLR9 na atividade fungicida de células dendríticas humanas desafiadas com o Paracoccidioides brasiliensis / Participation of TLR9 on fungicidal activity of human dendritic cells challenged with Paracoccidioides brasiliensis

Vieira, Ivy Rafacho [UNESP] 20 January 2017 (has links)
Submitted by Ívy Rafacho Vieira null (ivy.raff@yahoo.com.br) on 2017-02-20T18:11:01Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final mesmo Ivy.pdf: 2121270 bytes, checksum: ae8b49d15e98a6f5efb7ad097fe78b38 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-02-22T20:26:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_ir_me_bot.pdf: 2121270 bytes, checksum: ae8b49d15e98a6f5efb7ad097fe78b38 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-22T20:26:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_ir_me_bot.pdf: 2121270 bytes, checksum: ae8b49d15e98a6f5efb7ad097fe78b38 (MD5) Previous issue date: 2017-01-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pela inalação de propágulos micelianos do fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp.(Pb). Dentre os mecanismos de resposta imune contra o fungo, destacam-se os exercidos pelas células fagocitárias como os macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DCs). Além do importante papel efetor, isto é, de destruição do fungo, essas células, por terem capacidade de produzir citocinas tanto pró como anti-inflamatórias, desempenham um importante papel modulador da resposta imune inata, assim como de instrução da resposta imune adaptativa que será gerada posteriormente. Para essa última função, as células dendríticas merecem destaque por constituírem a população de células fagocitárias mais adaptada ao processo de ligar, fagocitar, destruir, processar microrganismos e após migrarem aos órgãos linfóides periféricos, locais onde elas maturam para desenvolver o processo de apresentação de antígeno, desencadear e instruir a resposta imune adaptativa. No entanto, de forma similar às outras células fagocíticas, as DCs são capazes de liberar potentes moléculas citotóxicas que as capacita a destruírem eficientemente os microrganismos. Essa capacidade, embora necessária ao papel modulador das DCs citado acima, representa um mecanismo efetor importante durante a resposta imune inata. A maior ou menor capacidade das DCs destruírem os vários microrganismos pode resultar em diferenças na disseminação dos mesmos durante a migração dessas células da periferia até os órgãos linfóides secundários. Neste contexto, em estudo anterior avaliamos se DCs humanas exercem atividade fungicida contra o P. brasiliensis e se esse processo envolve a ativação do sistema NADPHoxidase com consequente produção de H2O2, o metabolito envolvido na destruição do P. brasiliensis. Detectamos que as DCs não liberam níveis adequados de H2O2 e consequentemente não desenvolvem atividade fungicida contra o P. brasiliensis. Em outro estudo observamos que a interação das DCs com o Pb não resulta em maturação eficiente dessas células. O tipo de receptor de reconhecimento padrão (PRR) ao qual o fungo se liga pode determinar o seu destino no interior das células fagocitárias. Estudos têm mostrado que enquanto alguns deles estão envolvidos na replicação dos microrganismos no interior das células fagocíticas, ao contrário, outros participam da destruição dos mesmos. Nesse sentido, estudos sugerem que a estimulação de TLR9 através do ligante agonista CpG-ODN culmina com ativação do metabolismo oxidativo e consequente destruição de patógenos. Corroborando com esses estudos, detectamos que a incubação de DCs humanas com um agonista do TLR9 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessa células contra o P.brasiliensis . No entanto, esse efeito não esteve associado à um aumento da produção de H2O2. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis, endemic to Latin America, caused by the inhalation of mycelial propagules of the thermodymorphic fungus of the genus Paracoccidioides spp. (Pb). Among the mechanisms of immune response against the fungus, we highlight those exerted by phagocytic cells such as macrophages, neutrophils and dendritic cells (DCs). In addition to their important effector role, that is, fungus destruction, these cells, due to the capacity to produce both pro and anti-inflammatory cytokines, play an important role in modulating the innate immune response, as well as instructing the adaptive immune response. For this latter function, DCs deserve special attention, as they are the phagocytic cells population more adapted to the process of binding, phagocytizing, destroying, processing microorganisms and after migrate to the peripheral lymphoid organs, where they mature and instruct the adaptive immune response. However, similarly to other phagocytic cells, DCs are able to release potent cytotoxic molecules that enable them to efficiently destroy microorganisms. This ability, although necessary to their modulatory role cited above, represents an important effector mechanism during the innate immune response. The higher or lower capacity of DCs to destroy the various microorganisms may result in differences in dissemination of the infection during the migration of these cells from the periphery to the secondary lymphoid organs. In this context, in a previous study we evaluated whether human DCs exert fungicidal activity against P. brasiliensis and whether this process involves the activation of the NADP oxidase system with consequent H2O2 production, the metabolite involved in the P. brasiliensis killing. We have detected that DCs do not release adequate levels of H2O2 and consequently do not exert fungicidal activity against P. brasiliensis. In another study, we observed that the interaction of DCs with Pb does not result in efficient maturation of these cells. The type of pattern recognition receptor (PRR) to which the fungus binds can determine its fate within the phagocytic cells. Studies have shown that while some PRRs are associated to the replication of microorganisms within the phagocytic cells, other, on the contrary, are involved in the mechanisms of pathogens killing. In this sense, studies suggested that TLR9 stimulation by the agonist CpG-ODN culminates with oxidative metabolism activation and pathogens elimination. Accordinly, in our study we detected that human DCs incubation with a TLR9 agonist results in a significant increase of the fungicidal activity of these cells against P.brasiliensis. However, this effect was not associated with an increase in H2O2 production.
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Participación de Enzimas Aldehido Deshidrogenasas en la Generación de Células Dendriticas Humanas In Vitro

Cuevas Lizana, Carlos Alberto January 2008 (has links)
Las células dendríticas (DCs) cumplen un rol fundamental en la ejecución y regulación de la respuesta inmune. En los últimos años su producción in vitro se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en inmunología. En tanto, los retinoides son moléculas que han mostrado participar en procesos de diferenciación celular en diversos tejidos, siendo producidos por una variedad de células, incluidas las DCs. Se ha descrito que miembros de la familia de las aldehído deshidrogenasas (ALDH), son responsables de catalizar la oxidación irreversible de retinoides tales como el retinal a ácido retinoico. Los objetivos de esta memoria fueron: Estudiar las diferencias de expresión de marcadores de diferenciación en cultivos normales y cultivos mantenidos con el inhibidor dietilaminobenzaldehido (DEAB), específico de ALDHs; evaluar la acción de DEAB en cultivos diferenciados por una vía independiente de la enzima; definir si la adición del inhibidor tiene repercusiones en la viabilidad y funcionalidad normal de las DCs, y evaluar la expresión de mRNA y la actividad enzimática de ALDHs en cultivos normales de diferenciación. Nuestros resultados indican que DCs generadas en presencia de DEAB muestran una expresión significativamente menor del marcador de superficie CD11c, mientras el marcador CD14 se expresa en niveles más elevados que en las DCs generadas en condiciones normales. La adición de DEAB a cultivos independientes de la enzima no tuvo efecto alguno en la diferenciación celular. La cantidad de células muertas para todas las condiciones de experimentación es invariable y funcionalmente las células mantenidas con DEAB presentan características propias de deprivación de retinoides. x También se pudo demostrar diferencias en la expresión de isoenzimas de ALDHs a distintos días de diferenciación, al igual que en los niveles de actividad enzimática. Concluimos que las enzimas retinal deshidrogenasas cumplen un rol muy importante en la generación de células dendríticas humanas in vitro.
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AVALIAÇÃO DO IMIQUIMODE SOBRE A RESPOSTA INATA E O FENÓTIPO FUNCIONAL DE LINFÓCITOS T DURANTE O DESENVOLVIMENTO DO MELANOMA EXPERIMENTAL.

ABREU, CAYO AMARAL 03 1900 (has links)
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