Made available in DSpace on 2015-11-04T13:36:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leandro_alves_ioc_mest_2014.pdf: 112755376 bytes, checksum: b2de2958661b65ce907ca9c107efa88b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Existem diversas doenças crônico degenerativas que afetam diretamente a capacidade contrátil e força muscular da musculatura esquelética e/ou cardíaca, sejam elas doenças de cunho inflamatório ou genético. Dentre elas, podemos destacar as distrofias musculares e a miopatias inflamatórias (MI), que além da fraqueza progressiva e perda da resistência dos músculos esqueléticos, exibem importante infiltração inflamatória. A infiltração inflamatória gera danos secundários ao tecido muscular, agravando a doença com a perda da força muscular. A histopatologia do músculo lesionado é caracterizada pela presença de células inflamatórias, tais como linfócitos T, macrófagos e células dendríticas (DC). Em diversas MI, as DC são encontradas circundando fibras musculares lesionadas ou não ou mesmo invadindo fibras necróticas e não necróticas. Esta propriedade ilustra a importância da interação entre as DC e as células musculares e que exercem potencial papel na progressão das doenças musculares degenerativas. Além disso, as DC são células chave na indução da resposta imune adaptativa assim como na integração das respostas inata e específica. Entretanto a interação existente entre as DC e os mioblastos, células responsáveis pela regeneração do tecido muscular, ainda não foi claramente determinada. O objetivo desse estudo é, portanto, determinar se há interação entre as DC e mioblastos, e também que alterações morfológicas e funcionais ocorre nos mioblastos após a interação Para responder o objetivo do trabalho realizamos co-cultivos in vitro de mioblastos e DC. Para tal utilizamos DC imaturas (iDC), cultivadas apenas com meio de cultura, e DC ativadas (actDC), cultivadas ativadas por LPS. Por microscopia de luz e eletrônica observamos que as iDC e actDC aderem aos mioblastos, principalmente às actDC. Nós observamos por microscopia óptica e eletrônica que as DC aderem firmemente aos mioblastos nos estágios de proliferação e diferenciação. No estágio de diferenciação, o co-cultivo com iDC e actDC observamos que as miofibras formadas foram mais finas e desorganizadas, principalmente com actDC. Além disso também observamos a diminuição na formação de miotubos e diminuição na de myoD e miogenina, com diferenças mais pronunciadas no co-cultivo com actDC. No estágio de proliferação o cocultivo com iDC e actDC aumentou a marcação de mioblastos BrdU+, principalmente no co-cultivo com actDC. A expressão de fibronectina, caderina e laminina no co-cultivo não foi alterado. Entretanto no estágio de diferenciação, observamos por imunofluorescência, que a marcação para aactinina, b-catenina e laminina não foi alterada. Fato interessante foi a indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), uma enzima que degrada o aminoácido triptofano e promove imunotolerância foi observada marcação nos mioblastos. Quando realizamos o co-cultivo, principalmente com actDC, houve aumento na expressão de IDO nas células musculares tanto no estágio de proliferação como no de diferenciação. Analisamos que houve diminuição na capacidade de migração dos mioblastos no cocultivo com iDC e actDC, e que a diferença é pronunciada com actDC. Por fim, houve aumento na liberação de citocinas e aumento na expressão de HLA-ABC e HLA-DR no co-cultivo com actDC. Nos dados sugerem que o co-cultivo de DC e mioblastos alteram os mioblastos e que essa mudança indica uma contribuição das DC na evolução das MI / There are several chronic degenerative diseases that are either inflammatory diseases or genetic diseases which directly affect the contractile capacity and muscle strength in skeletal muscle and / or the heart. It is possible to highlight the muscular dystrophies and inflammatory myopathies (IM), which have clinical symptoms such as progressive weakness and loss of skeletal muscle strength and the exhibition of significant inflammatory infiltration. Inflammatory infiltration generates secondary muscle tissue damage and exacerbates the progression of the disease and muscle weakness. The sick muscle histopathology is characterized by the presence of inflammatory cells such as T lymphocytes, macrophages and dendritic cells (DC). In several IM, DC are found surrounding or even invading necrotic and non-necrotic muscle fibers and this facet illustrates the importance of the interaction between the aforementioned cells and the potential in the progression of degenerative muscle diseases. Furthermore, DC cells are key for the induction of the adaptive immune response as well as the integration of innate and specific responses. However the interaction between DCs and myoblasts, the cells which are responsible for muscle tissue regeneration, has not been clearly determined. Therefore, the aim of this study is to determine whether there is interaction between DCs and myoblasts and also any morphological and functional changes that occur in the myoblasts as a result of the interaction. In order to answer our question, we designed an in vitro co-culture of myoblasts plus DCs. We used immature DCs (iDC) cultured with medium only and activated DCs (actDC) cultured with medium and LPS. We observed by optical and electron microscopy that DCs have a tight adhesion with myoblasts in the proliferation or differentiation phases. Upon the co-culturing of iDC and actDC in the differentiation phase, we observed that the myofibers formed were thinner and more disorganized, especially in the actDC co-culture. In addition, we also observed a decrease in myotube formation, and a decrease in myoD and myogenin expression in the co-cultures of iDC and actDC. Furthermore, the aforementioned decreases in formation and expression were more pronounced in the actDC co-culture. During myoblast proliferation the co-culturing of iDC and actDC increased the staining in myoblasts for BrdU, especially in myoblasts from the actDC co-culture. In addition, the expression of fibronectin, cadherin and laminin in the co-cultures did not change. However, during myoblast differentiation, we observed via immunoflourescence that the staining of α-actinin, β-catenin, and laminin was unaltered in the different co-cultures. Interestingly, indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO), an enzyme that degrades the essential amino acid tryptophan and promotes immune tolerance, was found to be expressed in myoblasts. Moreover, this expression was increased during co-culture, in both the proliferation and differentiation phases. We also analyzed the myoblasts migration ability and observed that myoblast migration is decreased during co-culture. The decrease in migration was greater in the actDC co-culture than the iDC. Finally, there was a greater release of cytokines and increased expression of HLA-ABC and HLA-DR in the co-culture with actDC. In conclusion, our data suggests that the use of co-culture changes the myoblast profile and indicates that DCs can contribute to IM evolution.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-18T21:43:20Z No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-05-24T21:53:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-24T21:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) Previous issue date: 2017-05-21 / O fungo patogênico Cryptococcus neoformans é um dos agentes etiológicos da criptococose, uma infecção fúngica invasiva que pode se disseminar ao sistema nervoso central e que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos. Uma das principais células em detectar a infecção são as células dendríticas, que reconhecem e fagocitam o fungo orquestrando a resposta imune adaptativa para erradicar a infecção. A resposta imune do hospedeiro às infecções por patógenos microbianos envolve ampla reprogramação gênica, que é finamente controlada de modo a conter ou eliminar efetivamente o patógeno sem causar danos excessivos no hospedeiro. Micro-RNAs (miRNAs) são pequenos RNAs regulatórios envolvidos em mecanismos de regulação gênica e já foram detectados em diversos processos fisiológicos e patológicos controlando a estabilidade ou a taxa de tradução de RNA mensageiros (mRNA). Portanto, essas moléculas foram identificadas como um componente crucial na maquinaria da regulação gênica, afetando a produção e função das proteínas durante a homeostase ou sua perturbação. Esse estudo visou a caracterização do perfil de miRNAs expressos em células dendríticas derivadas de medula óssea de camundongos BALB/c (BMDCs) em resposta à infecção por C. neoformans. BMDCs foram co-cultivadas com a linhagem B3501 de C. neoformans por 24 h e tiveram RNA extraído para análise de expressão de miRNAs por RT-qPCR array. Os níveis de acúmulo de 29 miRNAs foram alterados nas BMDCs infectadas. Desse grupo, 22 miRNAs foram regulados positivamente e 7 miRNAs mostraram uma diminuição nos níveis de seus transcritos. Em seguida, analisou-se o papel do miR-155 nas principais funções das BMDCs em resposta à infecção por C. neoformans, por meio da abordagem de perda da função, mediante a transfecção de inibidores de miRNAs. Em tais experimentos, observou-se uma alteração na fagocitose e no controle intracelular do fungo pelas BMDCs quando miR-155-3p foi inibido. A análise da expressão, por citometria de fluxo, de MHCII nas BMDCs revelou um aumento na média da intensidade de fluorescência quando miR-155-5p foi inibido, sugerindo um papel na regulação desse complexo. Os resultados desse trabalho são pioneiros ao sugerir a participação de miRNAs na resposta de células dendríticas à infecção por C. neoformans. Estudos posteriores serão realizados visando ao aprofundamento da avaliação funcional desses miRNAs e seus respetivos mecanismos de ativação nesse modelo de infecção. / The pathogenic fungus Cryptococcus neoformans is one of the etiological agents of cryptococcosis, an invasive fungal infection that can spread to the central nervous system and mainly affects immunocompromised patients. One of the main cells in detecting the infection are dendritic cells, which recognize and phagocyte the fungus, orchestrating the adaptive immune response to eradicate the infection. The immune response to microbial pathogen infections involves extensive genetic reprogramming, which is finely controlled to contain or to effectively eliminate the pathogen without causing excessive damage to the host. Micro-RNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs involved in gene regulation mechanisms; these molecules are observed in a wide range of physiological and pathological processes controlling either messenger RNA (mRNA) stability or translation rate. Therefore, these molecules have been identified as a crucial component in the gene regulation machinery, affecting the production and function of proteins in homeostasis and its alterations. This study focused on characterizing the profile of miRNAs expressed in bone marrow-derived dendritic cells from BALB/c mice (BMDCs) in response to C. neoformans infection. BMDCs were co-cultured with the B-3501 strain of C. neoformans for 24 hours, after which the RNA was extracted for analysis of miRNA expression by RT-qPCR array. The expression levels of 29 miRNAs were altered in the infected BMDCs. Out of this group, 22 miRNAs were upregulated and 7 miRNAs showed a decrease in the levels of transcripts. Subsequently, the effect of miR-155 in the main functions of BMDCs in response to C. neoformans infection was analyzed by of a lossof-function approach: transfection of miRNA inhibitors into BMDCs. When miR-155-3p was inhibited, a change in BMDCs phagocytosis ability and in the intracellular control of the fungus was observed. Analysis of the MHCII expression in infected BMDCs by flow cytometry revealed an increase in the Mean Fluorescence Intensity when miR-155-5p was inhibited. These results are pioneering in indicating the participation of miRNAs in the dendritic cells response to C. neoformans infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017. / Submitted by Raiane Silva (raianesilva@bce.unb.br) on 2017-07-20T17:50:06Z No. of bitstreams: 1 2017_ElanePriscillaMaciel​.pdf: 1934684 bytes, checksum: 86424beedbeaa3ca6047a04bf26106ab (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-06T23:00:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ElanePriscillaMaciel​.pdf: 1934684 bytes, checksum: 86424beedbeaa3ca6047a04bf26106ab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T23:00:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ElanePriscillaMaciel​.pdf: 1934684 bytes, checksum: 86424beedbeaa3ca6047a04bf26106ab (MD5) Previous issue date: 2017-09-06 / As infecções do trato urinário são uma das principais causas de busca por atendimento médico, se definem como a invasão microbiana de qualquer órgão do trato urinário, que tem natureza estéril, desde a uretra até os rins. Escherichia coli, uma bactéria gram-negativa, comensal aos humanos, é o agente mais comum isolado em torno de 75 a 95% das infecções urinárias agudas de origem bacteriana. As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), essenciais nos eventos iniciais da infecção por atuarem como sentinelas e servirem de ponte entre a resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro. Assim, realizamos experimentos para entender a interação de DCs e UPECs. Para tal, DCs foram obtidas de monócitos do sangue periférico de doadores saudáveis, cultivadas na presença de IL-4 e GM-CSF e infectadas com as cepas V27 e J96 de UPECs por 24 horas. Observamos a capacidade das UPECs em infectar as DCs. Então as células foram analisadas por citometria de fluxo para avaliação da expressão de moléculas de superfície CD11c, CD1a, CD83, CD62L, CCR7, CD209, HLA-DR, CD86, CD80, CD40 e CD274. Após a interação DCs-UPECs observou-se diminuição de CD11c, diminuição de CD209 (DC-SIGN), tendência à diminuição da porcentagem e MFI da expressão de HLA-DR, aumento de CD80 e diminuição da média de espressão de CD86. A avaliação de morte celular demonstra que aparentemente a cepa V27 induz a morte por apoptose ou um processo de apoptose mais tardio nas DCs. Já a cepa J96 parece estimular uma tendência à morte por necrose ou apoptose tardia. Em conclusão, as UPECs regulam negativamente a expressão de DC-SIGN, moléculas co-estimulatórias como o CD86, além de regularem de forma diferente, a sobrevivência dessas células. / Urinary tract infections are one of the main causes of seeking medical attention, defined as the microbial invasion of any organ of the urinary tract, which has a sterile nature, from the urethra to the kidneys. Escherichia coli, a gram-negative bacterium commensal to humans, is the most common agent isolated in 75-95% of acute urinary tract infections of bacterial origin. Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs), essential in the early events of the infection by acting as sentinels and bridging the innate and adaptive immune response of the host. Thus, we perform experiments to understand the interaction of DCs and UPECs. To that end, DCs were obtained from peripheral blood monocytes from healthy donors cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF and infected with the VEC and J96 strains of UPECs for 24 hours. We observed the ability of UPECs to infect DCs. Cells were then analyzed by flow cytometry to evaluate the expression of surface molecules CD11c, CD1a, CD83, CD62L, CCR7, CD209, HLA-DR, CD86, CD80, CD40 and CD274. After the DCs-UPECs interaction, CD11c decreased, CD209 (DC-SIGN) decreased, tendency to decrease in percentage and MFI of HLA-DR expression, increase of CD80 and decrease in mean CD86 expression. Evaluation of cell death demonstrates that apparently the V27 strain induces death by apoptosis or a later apoptosis process in DCs. On the other hand, strain J96 seems to stimulate a tendency towards death by necrosis or late apoptosis. In conclusion, UPECs negatively regulate the expression of DC-SIGN, costimulatory molecules such as CD86, in addition to regulating the survival of these cells differently.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-02-29T16:31:53Z No. of bitstreams: 1 2015_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 5665217 bytes, checksum: 9f6e99bb7df736ed20ba2e9203882c3c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-02T21:53:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 5665217 bytes, checksum: 9f6e99bb7df736ed20ba2e9203882c3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-02T21:53:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 5665217 bytes, checksum: 9f6e99bb7df736ed20ba2e9203882c3c (MD5) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença endêmica, considerada a micose sistêmica mais prevalente no Brasil. A resposta ao agente etiológico, o fungo Paracoccidioides spp. é multifatorial e complexa, sendo que a natureza da resposta imune inicial, ou inata, resultará em um padrão de suscetibilidade ou resistência à PCM. Este estudo teve como principal foco a análise dos padrões moleculares de suscetibilidade ao P. brasiliensis, comparando as diferenças na resposta de células importantes na primeira linha de defesa ao fungo, por meio da análise da expressão gênica, em duas linhagens de camundongo: uma suscetível (B10.A) e outra resistente (A/J). Para isto, células dendríticas (BMDC) e macrófagos polarizados (M1-like, GM-BMM, e M2-like, M-BMM), derivados da medula óssea dessas duas linhagens murinas, foram co-cultivados, na ausência ou na presença de leveduras de P. brasiliensis. Após 6 horas, de co-cultivo, o RNA das BMDCs foi extraído e empregado em análises transcritômicas em larga escala (RNA-seq). As análises preliminares validam a qualidade das sequências obtidas e asseguram seu uso nas etapas subsequentes das análises dos dados gerados pelo experimento de RNA-seq. Dentre os genes descritos como diferencialmente expressos entre o grupo controle (não infectado) e o grupo experimental, oito tiveram sua expressão validada por qRT-PCR. Os genes diferencialmente expressos em ambas as linhagens foram agrupados por ontologia gênica e vias de KEGG para fornecer um panorama geral da reprogramação do transcritoma em resposta à infecção por P. brasiliensis. Em resumo, as BMDCs da linhagem A/J montam uma resposta controlada com poucos genes diferencialmente expressos em relação à condição controle. Já, as BMDCs da linhagem B10.A apresentam uma resposta intensa, com uma maior variação de expressão diferencial de genes. Neste trabalho, também avaliamos o impacto da polarização de macrófagos no modelo murino de PCM. Em geral, independente da linhagem de camundongos, os macrófagos com polarização similar a M2 (M-BMM), mostraram-se mais bem equipados para combater o fungo, apresentando o aumento nos níveis de transcritos de quimiocinas e citocinas. Ainda sobre o padrão desta resposta de macrófagos do tipo M2, também foi observado que comparado a B10.A, os M2-like de A/J desenvolveram uma resposta mais efetiva quanto ao controle da infecção, tendo sido também observado o aumento nos níveis de transcritos associados às vias de transdução de sinal dos TLRs, Dectina-1 e complemento, entre ouros. Por outro lado, os macrófagos com a diferenciação similar a M1 (GM-BMM) de ambas as linhagens de camundongo aumentaram os níveis dos transcritos de IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 e TNF-α quando comparados aos M-BMMs (tipo M2) infectados. GM-BMMs de B10.A mostrou uma diminuição nos níveis de alguns transcritos associados às vias de sinalização a partir de TLRs, Dectina-1 e complemento, entre outros PRRs anti-fúngicos, quando comparados aos GM-BMMs da linhagem A/J. / Paracoccidioidomycosis (PCM), a rural and suburban endemic disease, is considered the most prevalent systemic mycosis in Brazil. The response to its etiological agent (Paracoccidioides spp.) is multifactorial and complex. However, the manner in which the initial response is developed will determine if the patient presents a resistance or susceptibility to this infection. The focus of this study was to analyze the molecular patterns of susceptibility to P. brasiliensis infection, by comparing the differences in gene expression of cells of a susceptible (B10.A) and a resistant (A/J) mice strain, important in the first line of defense, in response to this fungus. To this end, dendritic cells (BMDC) and polarized macrophages (M1-like, GM-BMM, and M2-like, M-BMM) derived from the bone marrow of both murine strains were co-cultured with P. brasiliensis. After 6 hours co-culture, the RNA extracted from dendritic cells were sequenced by RNA-seq. Preliminary analysis of the RNA-seq data validated the quality of the sequences obtained and therefore ensured their use in subsequent steps of analysis. Of these, the expression of eight genes, up-regulated and/or not modulated, were validated by qRT-PCR. The genes differentially expressed in both strains were grouped then by gene ontology and KEGG pathways to provide an overview of the transcriptome reprogramming to P. brasiliensis infection. In summary, the BMDCs of the A/J strain mounts a controlled response with few differentially expressed genes relative to the control condition. While, the BMDCs of B10.A strain presents a more intense response with a wider range of differential gene expression. In this work, we also evaluated the impact of macrophage polarization in the murine model of PCM. In general, regardless of mouse strain, macrophages with M2-type polarization (M-BMM), proved to be better equipped to fight the fungus, with increase transcripts accumulation of chemokines and cytokines. Even within this polarazition, in comparison with B10.A M-BMMs, A/J M-BMMs developed a more effective control of infection, being also observated an increase in the transcripts levels associated with the signal transduction of TLRs, Dectin-1, complement, and others. Moreover, the macrophages with type M1 differentiation (GM-BMM) infected with P. brasiliensis of both mouse strains increased transcript levels of IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 and TNF-α when compared to infected M-BMMs (M2 type). B10.A GM-BMM showed a decrease in the levels of some transcripts associated with TLR, Dectin-1 and complement signaling pathways, and other associated antifungal PRRs when compared to A/J GM-BMM.

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, endêmica na América Latina, causada pela inalação de propágulos micelianos do fungo termodimórfico do gênero Paracoccidioides spp.(Pb). Dentre os mecanismos de resposta imune contra o fungo, destacam-se os exercidos pelas células fagocitárias como os macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (DCs). Além do importante papel efetor, isto é, de destruição do fungo, essas células, por terem capacidade de produzir citocinas tanto pró como anti-inflamatórias, desempenham um importante papel modulador da resposta imune inata, assim como de instrução da resposta imune adaptativa que será gerada posteriormente. Para essa última função, as células dendríticas merecem destaque por constituírem a população de células fagocitárias mais adaptada ao processo de ligar, fagocitar, destruir, processar microrganismos e após migrarem aos órgãos linfóides periféricos, locais onde elas maturam para desenvolver o processo de apresentação de antígeno, desencadear e instruir a resposta imune adaptativa. No entanto, de forma similar às outras células fagocíticas, as DCs são capazes de liberar potentes moléculas citotóxicas que as capacita a destruírem eficientemente os microrganismos. Essa capacidade, embora necessária ao papel modulador das DCs citado acima, representa um mecanismo efetor importante durante a resposta imune inata. A maior ou menor capacidade das DCs destruírem os vários microrganismos pode resultar em diferenças na disseminaçã... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / Las células dendríticas (DC) son las responsables de iniciar la respuesta inmune adaptativa. Las DC se diferencian a partir de un precursor residente de la médula ósea llamado “progenitor común de macrófagos y células dendríticas” (MDP) el cual puede diferenciarse en un precursor común de monocitos (cMoP), o en un precursor que da origen a las DCs (CDP). Para comprometerse al linaje de DCs, las CDP se diferencian en pre-DCs, las cuales dejan la médula ósea y al llegar al tejido se generan las cDC1 y cDC2. Los mecanismos celulares que regulan la diferenciación de las DCs no han sido claramente elucidados. En este contexto, la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), que es el mecanismo celular responsable de mantener la homeostasis del retículo endoplásmico (RE) ha emergido como un interesante candidato en la regulación de la diferenciación de DCs. La UPR está coordinada por tres sensores residentes del RE Interesantemente, ratones deficientes de XBP1, el factor de transcripción maestro río abajo del sensor IRE1a, muestran una disminución importante de cDC y pDC in vitro e in vivo. Esto sugiere que el sensor IRE1a es relevante para el desarrollo de las DCs. Sin embargo, se desconoce con precisión en que estadio del desarrollo de las DCs este eje estaría operativo. En este trabajo, identificamos los precursores de las DCs y estudiamos la activación del eje IRE1a/XBP1 de la UPR. Nuestros datos indican que las MDP presentan mayor activación del eje IRE1a/XBP1 comparado con los otros estadios de desarrollo de las DC, lo que sugiere que en esta etapa del desarrollo podrían estar ocurriendo cambios metabólicos mayores comparados con otros estadios, lo que implicaría un aumento en la síntesis proteica, implicando una UPR más activa. / The dendritic cells (DCs) are responsible for the initiation of the adaptive immune response. DCs arise from a common progenitor present in the bone marrow called ‘macrophage-dendritic cell progenitor’ (MDP), which differentiates into a cMoP (common monocyte precursor) or into CDP, the ‘common dendritic cell precursor’, that is committed towards the dendritic linage. After this differentiation process, the CDP will give rise to pre-DC, which exits the bone marrow and constitute the immediate precursors of terminally developed cDC1 and cDC2 in tissues. The cellular mechanism that controls the DC differentiation are not fully understood. In this context, the unfolded protein response (UPR) is a mechanism responsible to maintain the endoplasmic reticulum (RE) homeostasis that has risen as a candidate for the regulation of the DC development. This adaptive response is coordinated by three ER membrane–resident sensors. Remarkably, it has been reported that XBP1 deficient mice, a key transcription factor downstream IRE1a, display a marked diminution of cDCs and pDCs in vitro and in vivo. This implies that IRE1a plays a key role in DC homeostasis and development. Nevertheless, the contribution of the UPR to DC development is still poorly understood. In this work, we identified DC precursors using multiparametric flow cytometry and studied the UPR activation. Our data indicates that the cells at the stage of the MDP have the most prominent XBP1s signal compared to cells in different differentiation stages. These data suggest that in this stage of the DC development may be occurring major metabolic changes comparing to the other stages which could mean an increase of protein synthesis, involving an active UPR. / Mayo 2020

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), que acomete preferencialmente o pulmão, sendo este um dos poucos órgãos que está em continua e intensa interação com o meio ambiente e o sistema imune. O grande desafio para o sistema imune pulmonar é discriminar o que é nocivo e reagir de acordo. As células dendríticas (DCs) são apresentadoras de antígenos \"profissionais\" capazes de fazer o processamento do antígeno e a apresentação de peptídeos a linfócitos T e são ideais para manter este equilíbrio delicado entre a tolerância e uma resposta imune efetora. Sabendo da importância dessas células no sistema imune e que a infecção por P. brasiliensis ataca preferencialmente o pulmão, células de lavado broncoalveolar (BAL), após infecção experimental com leveduras de P. Brasiliensis, foram analisadas. Nós observamos um significante aumento de DCs no BAL após 24hrs da infecção intratraqueal com 104 leveduras de P. brasiliensis. A caracterização das DCs mostraram que essas células expressaram CD11c, MHC-II e DEC205. A fim de verificar a capacidade de migração das DCs, as mesmas foram diferenciadas a partir de células de medula óssea e pulsadas com leveduras de P. brasiliensis, marcadas com CFSE e injetadas intratraquealmente em camundongos. Como controle negativo, utilizamos PBS e DCs não pulsadas com o fungo. Os resultados mostraram, que após 12 horas de infecção, as DCs (CFSE+CD11c+), migraram para os linfonodos torácicos. No entanto, a quantidade destas células diminui discretamente após 24 horas de infecção. Além disso, não observamos DCs nos linfonodos regionais, quando analisamos os grupos controle. Dessa forma, as células pulmonares também foram marcadas in vivo injetando-se intratraquealmente o corante CFSE juntamente com leveduras de P. brasiliensis. Verificamos que após 12 horas, as DCs pulmonares, dos animais infectados com o fungo, migraram para os linfonodos regionais. Esses resultados comprovam que o fungo P. brasiliensis foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para linfonodos regionais, e induziu nesse órgão uma resposta por células T evidenciada pela produção preferencial de IL-10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), which mainly affects the lungs. They are one of the few organs that are in constant and intense interaction with the environment and the immune system. The great challenge for the pulmonary immune system is to discriminate what is harmful and react accordingly. Dendritic cells (DCs) are \"professionals\" antigen-presenting cells and they can do the antigen processing. They can also do the presentation of peptides to T lymphocytes and are ideal for maintaining this delicate balance between tolerance and an effector immune response. Knowing the importance of these cells in the immune system and that the infection by P. brasiliensis preferentially attacks the lungs, cells from bronchoalveolar lavage (BAL), after experimental infection with yeasts of P. Brasiliensis, were analyzed. We observed a significant increase of DCs in BAL after 24 hours of intratracheal infection with 104 of yeast cells of P. brasiliensis. The characterization of these cells showed that DCs expressed CD11c, MHC-II and DEC205. In order to verify the ability of migration of DCs, they were differentiated from bone marrow cells and pulsed with yeasts of P. brasiliensis, they were also labeled with CFSE and injected intratracheally into mice. As a negative control, we used PBS and DCs that were not pulsed with the fungus. The results showed that after 12 hours of infection, the DCs (CFSE + CD11c +), migrated to the thoracic lymph nodes. However, the quantity of these cells decreases slightly after 24 hours of infection. Furthermore, we observed no DCs in regional lymph nodes when we analyzed the control groups. Thus, the lung cells were also labeled in vivo by injecting the CFSE dye intratracheally with yeasts of P. brasiliensis. We found that after 12 hours, pulmonary DCs of the animals infected with the fungus migrated to regional lymph nodes. These results indicate that the fungus P. brasiliensis was able to activate DCs, inducing their migration to regional lymph nodes, and inducing a response in that organ by T cells as evidenced by preferential production of IL-10.

Os efeitos do estresse, que são fatores constantes e componentes importantes na vida de um indivíduo, provocam alterações sobre o sistema imunológico. Nossa hipótese foi de que o estresse agudo de contenção aplicado em três sessões em dias alternados pode alterar a expressão de marcadores de membrana e a função de células dendríticas (DCs) de camundongos Balb/c. Investigar os efeitos do estresse sobre as DC nos pareceu relevante uma vez que estas são importantes elementos de ligação entre as respostas imune inata e adaptativa, ou seja, são células apresentadoras de antígenos altamente especializadas com uma capacidade única para ativar linfócitos T. Inicialmente, foram realizados experimentos comportamentais e dosagens de hormônios relacionados à resposta ao estresse, a fim de caracterizar e validar o modelo de estresse agudo por contenção utilizado. Em seguida, DCs esplênicas e DCs geradas a partir de células precursoras da medula óssea foram analisadas quanto a expressão de marcadores fenotípicos CD11c, MHC-II, CD80, CD86, CD40 e CCR-7. O modelo de estresse agudo de contenção mostrou-se capaz de produzir alterações no comportamento e de ativar o eixo HPA e o SNS. A análise dos marcadores fenotípicos revelou um aumento da expressão de CD40 em DCs esplênicas de animais estressados, porém, não houve alterações nas DCs derivadas da medula óssea. O ensaio de proliferação demonstrou uma alteração na função de DCs na proporção de 1:1 no co-cultivo com esplenócitos. O presente trabalho, portanto, demonstrou que o estresse agudo de contenção, realizado em três sessões em dias alternados, é capaz de alterar alguns parâmetros relacionados ao fenótipo e à função de DCs esplênicas. / The effects of stress which are constant factors and important components in an individual\'s life cause changes on the immune system. Our hypothesis was acute restraint stress in three sessions on alternate days can change the expression of membrane markers and the function of dendritic cells (DCs) in BALB/c mice. Evaluate the effects of stress on the DC seemed to be relevant since these are important elements linking innate and adaptive immune responses, i,e., cells are highly specialized antigen-presenting with a unique capacity to activate T cells. First of all, behavioral assessment and dosages of hormones related to stress response were conducted to characterize and to validate the model of acute restraint stress. Then, splenic DCs and DCs generated from bone marrow were analyzed for expression of phenotypic markers CD11c, MHC-II, CD80, CD86, CD40 and CCR-7. The model of acute restraint stress changed the behavior and activate the HPA axis and the SNS. The analysis of phenotypic markers revealed an increased expression of CD40 on splenic DCs from stressed animals, however, there were no changes in BM-dDCs. The proliferation assay showed a change in the function of DCs in the coculture with splenocytes in a ratio of 1:1. Therefore, the present study indicated that acute restraint stress, conducted in three sessions on alternate days, is able to change some parameters related to the phenotype and function of splenic DCs.

A paracoccidioidomicose (PCM) é um a micose profunda de natureza granulomatosa, causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) e que compromete preferencialmente o tecido pulmonar. O P. brasiliensis sintetiza várias substâncias, dentre estas, destaca-se a glicoproteína de 43 kDa (gp43), a qual é considerada o principal componente antigênico do fungo. Dada a importância da gp43, anticorpos monoclonais (Mabs) contra esta glicoproteína foram obtidos e posteriormente caracterizados. Baseado na hipótese da rede idiotípica, Jerne (1974) propôs que cada anticorpo, quando produzido em resposta a um antígeno, induz a formação de outros anticorpos dirigidos contra sua região variável, na qual é única. Anticorpos anti-idiotípicos, que reconhecem o paratopo, contendo a imagem interna do antígeno, são denominados de Ab2-β e seu potencial terapêutico tem sido explorado em diferentes sistemas. Apesar da molécula de anticorpo ser complexa estruturalmente, sabemos que a região Fab, é a responsável pelo mimetismo do antígeno. Então, nosso grupo de pesquisa construiu uma nova molécula de anticorpo à partir do Mab anti-idiotípico Ab2-β, que mimetiza o antígeno gp43 de P. brasiliensis, denominada de fragmento variável de cadeia única (scFv). A transfecção dessa molécula em células dendríticas (DCs) mostrou ser promissora na PCM experimental, visto que estes transfectomas foram eficientes em apresentar a proteína scFv às células dos linfonodos, induzindo linfoproliferação, além de diminuírem a carga fúngica pulmonar. Visto que a molécula de scFv que possui a região de reconhecimento e ativação de linfócitos T mostrou eficiência no modelo de terapia na PCM experimental, o principal objetivo deste trabalho foi analisar os mecanismos pelos quais os transfectomas de DCs ativam a resposta imune em camundongos infectados com o fungo, para que possamos entender melhor a capacidade destas células em modular a resposta imune na PCM experimental. Dessa maneira, avaliamos a capacidade das DCs trasfectadas com pMAC/PS-scFv em migrar para os linfonodos regionais e induzirem uma resposta protetora com produção de IgG, bem como, analisamos o fenótipo destas células e produção de citocinas. Nosso modelo de terapia com pMAC/PS-scFv mostrou-se eficiente, uma vez que observamos diminuição de células T regulatórias nos linfonodos regionais, bem como aumento da produção de citocinas como IFN-γ e IL-12. Ainda, observamos aumento do isotipo IgG2b, sugerindo a modulação de resposta imune para o tipo Th1, importante na proteção da PCM. / The paracoccidioidomycosis (PCM) is the nature of granulomatous mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) and preferentially compromises lung tissue. The P. brasiliensis synthesizes various substances, among these, there is a 43 kDa glycoprotein (gp43), which is considered a major antigenic component of the fungus. Given the importance of gp43 monoclonal antibodies (Mabs) against this glycoprotein were obtained and further characterized. Based on the idiotypic network hypothesis, Jerne (1974) proposed that each antibody, when produced in response to an antigen, induces the several of other antibodies production against its variable region, which is unique. Anti-idiotypic antibodies that recognize the paratope containing the internal image of the antigen are called Ab2 β and their therapeutic potential has been explored in different systems. Although the antibody molecule is structurally complex, we know that the Fab region, is responsible for antigen mimicking. Therefore, our research group has engineered a new molecule from the antibody Mab-anti-idiotypic Ab2 β that mimics the antigen gp43 of P. brasiliensis, known as single chain variable fragment (scFv). Transfection of this molecule on dendritic cells (DCs) has shown promise in experimental PCM, since these transfection were effective scFv protein present in the cells of the lymph nodes, inducing lymphoproliferation, in addition to reducing fungal burden in the lung. Since the scFv molecule that has the region recognition and activation of T lymphocytes showed efficiency in therapy model in experimental PCM, the main objective of this study was to analyze the mechanisms by which transfected DCs activate the immune response in infected mice with the fungus, so that we can better understand the ability of these cells to modulate the immune response in experimental PCM. Thus, the capacity of transfected DCs with pMAC / PS-scFv to migrate to regional lymph nodes and induce a protective response with IgG production, as well as analyze the phenotype of these cells and cytokine production. Our therapy model with pMAC / PS-scFv was efficient, since we observed decrease of regulatory T cells in regional lymph nodes, as well as increased production of cytokines such as IFN-γ and IL-12. Furthermore, we observed increased IgG2b isotype, suggesting modulation of the immune response to a Th1 response, the protect model of experimental PCM.

O nervo vago exerce um papel importante na regulação da homeostase, e seus ramos eferentes emitem sinais capazes de atenuar a resposta inflamatória através da via do reflexo inflamatório. Nossa hipótese foi de que esta via pode também alterar a função das células dendríticas (DCs), uma vez que estas células possuem receptores colinérgicos e podem ser reguladas pelas citocinas inflamatórias. Sendo assim, DCs esplênicas e DCs geradas a partir de células precursoras da medula óssea de animais vagotomizados unilateralmente foram analisadas quanto aos marcadores fenotípicos CD11c e MHC-II e as moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86. As DCs derivadas da medula óssea ainda foram avaliadas quanto a função fagocítica, a apresentação de antígenos, bem como, a produção de citocinas do cocultivo destas com linfócitos de camundongos OT-II. Um ensaio de reação de hiperensibilidade tardia (DTH) para se avaliar a resposta imune celular também foi realizado, mas não mostrou alterações significantes. A análise dos marcadores fenotípicos revelou um aumento da expressão de CD80 em DCs esplênicas de animais vagotomizados unilateralmente, mas não houveram alterações nas DCs derivadas da medula óssea. A avaliação da capacidade fagocítica revelou uma diminuição significante em DCs derivadas da medula óssea de animais vagotomizados unilateralmente enquanto no ensaio de proliferação de linfócitos OTII não houve efeito significante. Entre as citocinas avaliadas, a IL-6 e IFN-ϒ se apresentaram aumentadas nos animais vagotomizados unilateralmente. Portanto, o presente trabalho foi capaz de evidenciar que as DCs também estão sujeitas à modulação do sistema nervoso parassimpático, e que, uma vez moduladas, estas células são capazes de exercer influências sobre outras células do sistema imunológico. / The vagus nerve plays an important role in the regulation of homeostasis and its efferent branches emit signals capable of attenuating the inflammatory response via the inflammatory reflex. Our hypothesis was that this pathway may also alter the function of dendritic cells (DCs), since these cells have cholinergic receptors and can be regulated by the inflammatory cytokines. Thus, splenic DCs and DCs generated from bone marrow precursor cells unilaterally vagotomized animals were analyzed for phenotypic markers CD11c and MHC-II and co-stimulatory molecules CD80 and CD86. The bone marrow-derived DCs were also evaluated for phagocytic function, antigen presentation, as well as the production of cytokines such co-culture with lymphocytes from mice OT-II. A delayed type hypersensitivity test (DTH) twas also performed to evaluate the cellular immune response was also performed, but showed no significant changes. The analysis of phenotypic markers showed increased CD80 expression in splenic DCs from unilaterally vagotomized animals but there were no changes in bone marrow-derived DCs. The evaluation of phagocytic ability showed a significant decrease in DCs from unilaterally vagotomized animals while in the OT-II lymphocyte proliferation assay there was no significant effect. Among the cytokines evaluated, IL-6 and IFN-ϒ were increased in unilaterally vagotomized animals. Therefore, this study was able to demonstrate that DCs are also subject to modulation of the parasympathetic nervous system, which, once modulated, these cells are able to exert influence on other cells.