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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-08-12T13:44:06Z No. of bitstreams: 1 2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-08-14T12:41:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T12:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Quimosina, é uma aspartil protease utilizada como coagulante do leite na indústria de fabricação de queijo. Tradicionalmente, a quimosina é extraída a partir do abomaso de bezerro lactantes. Com o aumento da demanda desta enzima, as fábricas de queijos foram buscar outras fontes alternativas de baixo custo, entre elas a quimosina recombinante que surgiu como uma opção promissora. Neste trabalho, os cDNA de quimosina bovina e de camelo foram clonados em vetores de Pichia pastoris para a expressão constitutiva de elevado nível, sob o controle do promotor endógeno PPGK1. Os vetores foram integrados no genoma da levedura para expressão estável. Após crescimento, os sobrenadantes foram recolhidos e ambas as proteínas recombinantes foram purificadas num único passo de cromatografia com uma coluna de exclusão molecular (Sephacryl S-100) antes de caracterização enzimática. As quimosinas recombinantes apresentaram uma massa molecular entre 35 e 45 kDa. Quimosina bovina purificada exibiu uma atividade enzimática de cinco vezes superior a quimosina de camelo nas mesmas condições padrão. Ambas quimosinas apresentaram um pH ótimo de aproximadamente 4,0 e a temperatura ótima entre 55 e 60 °C. O efeito dos íons sobre a atividade das proteínas também foi estudado: maior atividade com Ca+2 foi observado entre 40-140 mM e o íon Mg+2 favoreceu um aumento da atividade enzimática de ~100% (bovina) e 66% (camelo), quando comparado com o íon Ca+2. Testes de especificidade de substrato revelaram que ambas as enzimas mostraram uma maior afinidade para k-caseína do que para α e β-caseína. Juntos, os resultados apresentados neste trabalho mostram que a quimosina bovina produzida por P. pastoris é uma fonte recombinante mais atraente do que a quimosina camelo para a fabricação de queijo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chymosin is an aspartic protease used as a milk coagulant in the cheese making industry. Tradicionally, chymosin is extracted from the abomasum of suckling calves. With the increasing demand for this enzyme, cheese manufactures seek other low cost alternative sources, among them recombinant chymosin has emerged as a promising option. In this work, bovine and camel chymosin cDNAs were cloned into a Pichia pastoris vectors for high level constitutive expression under the control of endogenous PPGK1 promoter. The vectors were integrated into the P. pastoris genome for stable expression. After growth, supernatants were collected and both recombinant proteins were purified in a single chromatographic step with an exclusion molecular column (Sephacryl S-100) prior to enzyme characterization. Recombinant chymosins showed a molecular mass between 35 kDa and 45 kDa. Purified bovine chymosin showed an enzymatic activity five times higher than camel chymosin under the same standard conditions. Both chymosins showed optimum pH around 4.0 and optimum temperature between 55 and 60°C. The effect of ions on protein activity was also studied: highest activity with Ca2+ was observed between 40-140 mM and Mg2+ favored an increase of enzyme activity of ~ 100% (bovine) and 66% (camel) when compared to Ca2+. Substrate specificity tests revealed that both enzymes showed a higher affinity for k-casein over the α and β-casein counterparts. Together, the results presented in this work show that bovine chymosin produced in P. pastoris is a more attractive recombinant source than camel chymosin for cheese manufacturing.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-06-20T19:45:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Franz de Assis Graciano dos Santos.pdf: 4554992 bytes, checksum: c66c9124f25e700f6bc29151f2450b37 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-20T19:45:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Franz de Assis Graciano dos Santos.pdf: 4554992 bytes, checksum: c66c9124f25e700f6bc29151f2450b37 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / CNPQ / Os biofilmes microbianos são comunidades de microrganismos irreversivelmente aderidos a uma superfície que produzem substância polimérica extracelular, a formação de biofilme é relevante devido à contínua liberação de microrganismos que o compõe, os quais mostram fenótipo diverso daquele encontrado na forma planctônica. Candida parapsilosis, atualmente dividida em três espécies distintas, apresentam notória capacidade de formação de biofilmes em cateteres e outros dispositivos implantados. Assim, este trabalho teve objetivos determinar a ação antifúngica e antibiofilme in vitro e in vivo, isolada e sinérgica, de fluconazol e ácido acetilsalicílico frente a modelo experimental de endocardite por espécies do complexo C. parapsilosis. Os isolados foram revisados e caracterizado morfisiologicamente e por técnicas proteômicas. Assim, 20 isolados fenotipicamente classificados como C. parapsilosis foram reclassificados. A atividade antifúngica das drogas foi determinada seguindo as condições descritas no documento M27-S4 do Clinical Laboratory Standards Institute. A Concentração Inibitória Fracionária (FIC) foi avaliada através das combinações de Ácido Acetilsalicilico, fluconazol e Anfotericina B, usando o método de diluição chequerboard. Na sequência Os testes de aderência foram baseados nos trabalhos de Kimura e Pearsall, 1978. Os biofilmes foram preparados usando-se o modelo de placa de microtitulação e quantificados por metodologia colorimétrica do ensaio de redução de hidróxido de tetrazolium (XTT) para avaliação da viabilidade celular, antes e após tratamento. Adicionalmente, empregou-se o uso de microscopia eletrônica de varredura para observação da arquitetura dos biofilmes do complexo C. parapsilosis. O desafio experimental e avaliação clínica, seguiu o modelo murino neutropênico descrito por Craig e Andes 2008 e foi usado para gerar candidíase disseminada e com consequente endocardite. As técnicas proteômicas empregadas distinguiram os isolados como C. parapsilosis stricto sensu (80%), C. metapsilosis (10%) e C. orthopsilosis (10%), das quais 100% foram capazes de formar biofilme, mesmo apresentando fraca adesão as células epiteliais. Testes de sensibilidade frente aos agentes antifúngicos (fluconazol e anfotericina B) demostraram que todas as cepas do complexo C. parapsilosis foram sensíveis. Ácido acetilsalicílico e Fluconazol apresentaram ação sinérgica frente a todas cepas testadas, padrões de antagonismo e de indiferença foram observados quando utilizado fluconazol e anfotericina B, e ácido acetilsalicílico e anfotericina B. O ensaio de redução de XTT demostrou que todas os isolados formaram biofilmes independente das suplementações e em todos tempos testados. Na atividade anti-biofilme podemos observar uma redução significativa na formação de biofilme por espécies do complexo C. parapsilosis, quando utilizado fluconazol e ácido acetilsalicílico de forma combinada. No desafio experimental, a cepa selecionada para modelo de infecção foi a URM 7434 C. orthopsilosis, por apresentar melhor produção de biofilme, menores CIMs, melhor resposta ao tratamento proposto e melhor resposta aos testes pilotos in vivo, os grupos de tratamento, principalmente os que fizeram uso de fluconazol e ácido acetilsalicílico de forma combinada conseguiram debelar a infecção no sétimo dia de tratamento, sem apresentar recidiva até 28º dia de sobrevida. Neste sentido o conhecimento acerca das espécies do complexo C. parapsilosis, além da expressão dos fatores de virulência e perfil de sensibilidade antifúngica, norteiam e viabilizam a conduta terapêutica adequada para tratamento e cura. / Microbial biofilms are microorganisms communities irreversibly adhered to a surface that produce extracellular polymeric substance, the formation of biofilm is relevant due to the continuous release of microorganisms that compose it which show phenotype different from that found in the planktonic form Candida parapsilosis, currently divided into three distinct species, have a remarkable ability to form biofilms in catheters and other implanted devices. The aim of this study was to determine the antifungal and antibiofilm action in vitro and in vivo, isolated and synergistic with fluconazole and acetylsalicylic acid against an experimental model of endocarditis by C. parapsilosis complex. The isolates were reviewed and characterized morphologically and proteomic techniques. Thus 20 isolates phenotypically classified as C. parapsilosis were reclassified. The antifungal activity of the drugs was determined following the conditions described in document M27-S4 of the Clinical Laboratory Standards Institute. Fractional Inhibitory Concentration (FIC) was evaluated by the combinations of Acetylsalicylic, fluconazole and amphotericin B using the dilution method checkerboard. The adhesion tests were based on the work of Kimura and Pearsall, 1978. Biofilms were prepared using the microtiter plate model and quantified by tetrazolium hydroxide reduction (XTT) colorimetric methodology for viability evaluation before and after treatment. In addition, scanning electron microscopy was used to observe the architecture of the C. parapsilosis complex biofilms. The experimental challenge and clinical evaluation followed the murine neutropenic model described by Craig and Andes 2008 and was used to generate disseminated candidiasis and with consequent endocarditis. The proteomic techniques used in this study distinguished C. parapsilosis stricto sensu (80%), C. metapsilosis (10%) and C. orthopsilosis (10%), 100% of which were able to form biofilms, Epithelial cells. Sensitivity tests against antifungal agents (fluconazole and amphotericin B) demonstrated that all strains of the C. parapsilosis complex were sensitive. Acetylsalicylic acid and fluconazole showed synergistic action against all strains tested patterns of antagonism and indifference were observed when using fluconazole and amphotericin B and acetylsalicylic acid and amphotericin B. The XTT reduction assay showed that all isolates formed biofilms independent of supplements and at all times tested. In the anti-biofilm activity we can observe a significant reduction in biofilm formation by species of C. parapsilosis complex, when used fluconazole and acetylsalicylic acid in combination. The experimental challenge, the selected strain for the infection model was URM 7434 C. orthopsilosis because it presented better biofilm production, lower MICs, better response to the proposed treatment and better response to in vivo pilot tests treatment groups, especially Who used fluconazole and acetylsalicylic acid in combination, were able to control the infection on the seventh day of treatment, without relapse up to the 28th day of survival. In this sense, the knowledge about the species of the C. Parapsilosis complex, in addition to the expression of the virulence factors and the antifungal sensitivity profile, guide and enable the appropriate therapeutic management for treatment and cure.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-20T20:19:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Jackeline Maria da Silva.pdf: 1830070 bytes, checksum: cd38a877523b6502d8430c98e1cfa370 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-28T18:23:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Jackeline Maria da Silva.pdf: 1830070 bytes, checksum: cd38a877523b6502d8430c98e1cfa370 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-28T18:23:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Jackeline Maria da Silva.pdf: 1830070 bytes, checksum: cd38a877523b6502d8430c98e1cfa370 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / FACEPE / Dekkera bruxellensis pertence à família Saccharomycetaceae e é considerado um parente distante de Saccharomyces cerevisiae. Esta levedura, principalmente na sua forma anamorfa Brettanomyces bruxellensis, é um importante contaminante da produção de vinho. O objetivo deste estudo foi comparar a fisiologia de linhagens da levedura Dekkera bruxellensis isoladas da produção de vinho e de álcool combustível quanto ao metabolismo de diferentes açúcares potencialmente utilizados como substrato industrial. Para isso, 30 isolados de Dekkera bruxellensis foram avaliados quanto à habilidade de assimilação respiratória e fermentativa de monossacarídeos e dissacarídeos, a diversidade fenotípica relacionada à repressão catabólica pela glicose, e a assimilação de diferentes açúcares, tais como glicose, sacarose e celobiose sob condição anaeróbica. Diferenças entre os perfis de assimilação respiratória foram observadas para cada isolado. As mais altas velocidades de crescimento foram encontradas em meio com glicose, frutose e sacarose 0,32 h⁻¹, 0,30 h⁻¹ e 0,30 h⁻¹, respectivamente, em aerobiose pelos isolados de destilaria. Em maltose e galactose, as maiores taxas de crescimento foram respectivamente, 0,21 h⁻¹ e 0,27 h⁻¹, alcançadas por isolados de destilaria e de vinícola, e em celobiose e lactose, as maiores taxas foram respectivamente, 0,20 h⁻¹e 0,15 h⁻¹, alcançados pelos isolados de destilaria. A presença do repressor catabólico 2-deoxiglicose no meio com galactose e maltose inibiu o crescimento de todos os isolados de vinho, diferentemente de alguns isolados de etanol que apresentaram resistência a este composto. A adição de Antimicina A nos meios de cultura alterou o crescimento apenas dos isolados de vinícola. Em anaerobiose estrita, os isolados de destilaria alcançaram velocidades de crescimento iguais a 0,44 h⁻¹; 0,40 h⁻¹e 0,26 h⁻¹ em glicose, sacarose e celobiose, respectivamente. A capacidade de assimilação de diferentes açúcares pelos isolados de D. bruxellensis frente às diversas condições testadas mostram a diversidade fenotípica encontrada dentro desta espécie. Além disso, os dados podem colaborar para explicação da capacidade adaptativa dessa espécie em diferentes ambientes industriais cujas fontes alternativas de carbono estejam presentes. Do ponto de vista biotecnológico, estudos com isolados de D. bruxellensis podem ser voltados para a produção de etanol de segunda geração, cujo um dos substratos é a celobiose, açúcar dos quais linhagens selvagens de S. cerevisiae não são capazes de assimilar. / Dekkera bruxellensis belongs to the family Saccharomycetaceae and is considered a distant relative of Saccharomyces cerevisiae. This yeast, mainly in its anamorphic form Brettanomyces bruxellensis, is an important contaminant of wine production. The aim of this study was to compare the physiology of strains Dekkera bruxellensis yeast isolated from wine production and ethanol on the metabolism of different sugars potentially used as industrial substrate. To this, 30 isolates of Dekkera bruxellensis were assessed for fermentative and respiratory assimilation ability monosaccharides and disaccharides, phenotypic diversity related to catabolite repression by glucose and the assimilation of different sugars, such as glucose, sucrose and cellobiose under anaerobic conditions. Differences between the profiles of respiratory assimilation were observed for each isolate. The highest growth rates were found in glucose, fructose and sucrose 0.32 h⁻¹, 0.30 h⁻¹and 0.30 h⁻¹, respectively, in aerobiosis by distillery isolates. In maltose and galactose, the highest growth rates were respectively 0.21 h⁻¹ and 0.27 h ⁻¹, reached by distillery and wine isolates, and in cellobiose and lactose, the highest rates were 0, 20 h⁻¹ and 0.15 h⁻¹, reached by distillery isolates. The presence of the 2-deoxyglucose catabolic repressor in the medium with galactose and maltose inhibited the growth of all the wine isolates, unlike some ethanol isolates were resistant to this compound. The addition of Antimycin A in the culture media altered the growth of only the wine isolates. In strict anaerobiosis the isolates of distillery reached growth rates equal to 0.44 h ⁻¹; 0.40 h ⁻¹ and 0.26 h ⁻¹ in glucose, sucrose and cellobiose, respectively. The capacity of assimilation of different sugars by D. bruxellensis isolates against the different conditions tested shows the phenotypic diversity found within this species. Moreover, the data can corroborate to explain the adaptive capacity of this species in different industrial environments whose alternative carbon sources are present. In biotechnological point of view, studies with isolated D. bruxellensis may be facing a second-generation ethanol, which one of the substrates is a cellobiose, sugar from which wild strains of S. cerevisiae are not able to assimilate

Na fermentação alcoólica de substratos oriundos da cana-de-açúcar (caldo e/ou melaço), a sacarose é o principal açúcar e sofre inicialmente a ação da invertase da levedura, sendo transformada em glicose e frutose. Ao que parece essa hidrólise é muito mais rápida que a metabolização das hexoses, ocorrendo acúmulo dos monossacarídeos, os quais podem exercer um estresse osmótico à levedura, bem como disponibilizar tais hexoses para o crescimento de lactobacilos contaminantes do processo fermentativo industrial. Neste trabalho foi quantificada a atividade de invertase de 5 linhagens de Saccharomyces cerevisiae (PE-2, BG-1, CAT-1, FLE e IZ-1904) todas pertencentes à coleção de leveduras do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ/USP. A atividade de invertase foi determinada tanto nos meios de crescimento (caldo, mosto misto e melaço) como também nas leveduras após a autólise com bicarbonato de sódio. Ambas as quantificações levaram à conclusão de que, em ordem crescente, a atividade de invertase dessas linhagens foi a seguinte: CAT-1, PE-2, BG-1, IZ-1904 e FLE. A segunda etapa deste trabalho consistiu em estudar a interação levedura-bactéria durante a fermentação alcoólica, buscando correlacionar a atividade de invertase com a contaminação bacteriana. Nesta etapa, foram comparadas as leveduras descritas acima, buscando melhor entender as relações tróficas entre Saccharomyces e Lactobacillus em co-cultura. Os estudos conduzidos consistiram em ensaios de fermentação com reciclos, procurando-se imitar as condições industriais e concluiu-se que, nessas condições, a atividade de invertase não exerceu influência sobre os níveis de contaminação por L. fermentum / not available

Com o objetivo de determinar as isotermas de adsorção de sais de cádmio por Saccharomyces cerevisiae, foram utilizados os sais acetato, cloreto, nitrato e sulfato, nas concentrações de 5; 10; 20; 40; 60; 80 e 100 mg L-1. A biomassa foi produzida a partir de uma cultura starter de Saccharomyces cerevisiae IZ 1904. Após o contato de 16h, a biomassa foi separada por centrifugação e o teor de cádmio residual foi determinado no sobrenadante por spectrofotometria de absorção atômica. Para os quatro sais empregados foi observado um acúmulo crescente de cádmio nas concentrações de 5; 10; 20; 40. Nas concentrações de 60; 80 e 100 mg L-1 foi observado um decréscimo do acúmulo do metal, evidenciando danos da parede celular, os quais não sempre acompanhados de iguais danos da membrana, visualizados por microscopia eletrônica de varredura / not available

Com o objetivo de determinar as isotermas de adsorção de sais de cádmio por Saccharomyces cerevisiae, foram utilizados os sais acetato, cloreto, nitrato e sulfato, nas concentrações de 5; 10; 20; 40; 60; 80 e 100 mg L-1. A biomassa foi produzida a partir de uma cultura starter de Saccharomyces cerevisiae IZ 1904. Após o contato de 16h, a biomassa foi separada por centrifugação e o teor de cádmio residual foi determinado no sobrenadante por spectrofotometria de absorção atômica. Para os quatro sais empregados foi observado um acúmulo crescente de cádmio nas concentrações de 5; 10; 20; 40. Nas concentrações de 60; 80 e 100 mg L-1 foi observado um decréscimo do acúmulo do metal, evidenciando danos da parede celular, os quais não sempre acompanhados de iguais danos da membrana, visualizados por microscopia eletrônica de varredura / not available

Orientador: Cecília Laluce / Banca: Rubens Monti / Banca: Sandra Regina Pombeiro Sponchiado / Banca: Maristela de Freitas Sanches Peres / Resumo: A hidratação é uma fase crítica no uso da levedura seca instantânea por depender do meio líquido usado, da temperatura e do tempo de hidratação. A levedura seca apresenta-se como um material biológico de grande heterogeneidade celular. Hidratação direta do fermento seco com soluções de aditivos, bem como, o tratamento do fermento seco, mas previamente hidratado com água foram acompanhados por medidas de viabilidade e atividade de fermentação (variações em volume de massa e evolução de CO2). O efeito do tempo de abertura da embalagem do fermento seco sobre as variações em viabilidade celular teores de glicerol interno e atividade de fermentação também foram determinados. Os seguintes tratamentos foram aplicados a levedura, previamente hidratada em água: (a) incubação em solução de citrato; (b) aplicação de choque térmico as células suspensas em solução de citrato. A levedura seca foi hidratada diretamente em água a temperatura ambiente e em solução de lisina a 37oC. As hidratações diretas do fermento seco com soluções de citrato 0,15 mol.L-1 a pH 6,9 e 7,5 por 40 min a temperatura ambiente proporcionaram aumentos em volume de massa da ordem de 25-29% (35,4-36,6 mL/180 min de fermentação) em relação ao controle (28,3 mL/180 min de fermentação). No entanto, a hidratação direta do fermento seco com água por 10 min a temperatura ambiente proporcionou um volume de massa (36,0 mL/150 min de fermentação) tão bom quanto aos obtidos com solução de citrato, mas com tempos de hidratação e fermentação menores. As hidratações diretas, do fermento seco, com soluções de glicose 2,0% e 0,5% por 40 min a temperatura ambiente proporcionaram aumentos em volume de CO2 da ordem de 33-38% (53,7-56,0 mL/180 min de fermentação) em relação ao controle (40,5 mL/180 min de fermentação). / Abstract: Hydration is a critical phase in the use of instant dry yeast because it depends on the liquid media used, temperature and hydration time. Instant dry yeast is showed as biological material of great cellular heterogeneity. Direct hydration of instant dry yeast in additive solutions as well as the treatment of the instant dry yeast, but previously hydrated in water, were followed by viability measures and activity of fermentation (variations in dough volume and CO2 evolution). The time effect of the opened packing of the instant dry yeast on the fermentation activity, the internal glycerol and the cellular viability variations were also determined. The following treatments were applied to yeast, previously hydrated in water: a) incubation in citrate solution; b) application of heat shock to suspension cells in citrate solution. Instant dry yeast was directly hydrated in water at room temperature and in lysine solution at 37oC. Direct hydrations of instant dry yeast in 0,15 mol.L-1 citrate solutions at pH 6.9 and 7.5 for 40 min at room temperature provided increases in dough volume around 25- 29% (35.4-36.6 mL/180 min of fermentation) in relation to the control (28.3 mL/180 min of fermentation). However, direct hydration of instant dry yeast in water for 10 min at room temperature provided a dough volume (36.0 mL/150 min fermentation) as good as the ones obtained after citrate hydration, but with shorter hydration and fermentation time. Direct hydration of instant dry yeast in 2.0% e 0.5% glucose solutions for 40 min at room temperature provided increases in CO2 evolution around 33-38% (53.7-56,0 mL/180 min of fermentation) in relation to the control (40.5 mL/180 min of fermentation). However, direct hydration of instant dry yeast in water for 10 min at room temperature provided a CO2 evolution (79.0 mL/180 min of fermentation) bigger than the CO2 evolution previously obtained with glucose hydration. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-10-27Bitstream added on 2014-06-13T20:44:15Z : No. of bitstreams: 1 rosa_mm_dr_rcla.pdf: 4775636 bytes, checksum: 3a910249e344253877ee9051e3958b03 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As leveduras são microrganismos importantes em diferentes processos biotecnológicos, sendo amplamente empregadas industrialmente. Apesar de se apresentarem em grande número em ambientes naturais, como na superfície de plantas (folhas, flores e frutos) e na rizosfera, pouco é conhecido sobre sua função nestes habitats. O controle de fitopatógenos tem sido estudado como um potencial papel das leveduras, principalmente inibindo fungos que causam podridões em frutas no período pós-colheita, e controlando doenças de diversas culturas de interesse econômico no campo, pois são ótimas competidoras por nutrientes e espaço. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi isolar, avaliar e caracterizar leveduras de áreas agrícolas quanto ao controle de fungos fitopatogênicos in vitro e in vivo. Foram isoladas mais de uma centena de linhagens de leveduras, as quais foram avaliadas inicialmente quanto ao antagonismo à três fungos fitopatogênicos (Colletotrichum sublineolum, Colletotrichum graminicola e Thielaviopsis paradoxa) em testes in vitro. Os isolados com comportamento antagônico foram identificados através do sequenciamento da região ITS do rDNA e por fingerprinting utilizando-se a técnica de ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Foram realizados testes de antagonismo em meios de cultura sólidos (pela avaliação do crescimento micelial do fitopatógeno) e líquidos (pela avaliação da germinação dos esporos fúngicos), além de experimentos in vivo em plantas de sorgo e toletes de cana-de-açúcar, verificando-se o controle das doenças antracnose e podridão abacaxi, respectivamente. Foram realizadas análises para detecção de possíveis mecanismos de ação das leveduras, como competição por nutrientes; produção de toxina killer, compostos voláteis, enzimas hidrolíticas e sideróforos, além da avaliação de possíveis danos causados pela levedura... / The yeasts are important microorganisms for different purposes in biotechnological processes and widely utilized industrially. Although in high numbers in natural environments, as plant surfaces (leaves, flowers and fruits) and rhizosphere, a little is known about their functions in the habitats. The control of phytopathogens by the yeasts has been studied, mainly inhibiting molds which cause fruit rots in the postharvesting period, and controlling diseases of economically important cultures in the field, once they are good competitors for nutrients and space. In this context, the aim here is the isolation, screening and characterization of yeasts from agricultural areas regarding their ability to control phytopathogenic molds in vitro and in vivo. More than a hundred of strains were isolated, which were initially screened for the in vitro antagonism against three phytopathogenic molds (Colletotrichum sublineolum, Colletotrichum graminicola and Thielaviopsis paradoxa). The isolates with antagonistic behavior were identified by the sequencing of ITS region in the rDNA and by fingerprinting with the ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) technique. Antagonism tests in solid media (evaluating the mycelial growth of the phytopathogen) and liquid media (evaluating the fungal spore germination) were carried out, besides in vivo experiments with sorghum and sugar cane to verify the control of anthracnose and pineapple disease, respectively. Mechanisms of action by yeasts towards the molds were evaluated as competition for nutrients; production of killer toxin, volatile compounds, hydrolytic enzymes and siderophores. The damage caused by the yeast in the fungal hyphae was also approached. The results indicated three yeast species with good results as antagonists (Torulaspora globosa, Candida intermedia and Rhodotorula mucilaginosa). All the yeasts exhibited antagonism against the phytopathogenic... (Complete abstract click electronic access below)

As figueiras são encontradas em abundância no Parque de Itapuã, onde interagem com diversos organismos superiores e, potencialmente, com microrganismos. Os objetivos do presente trabalho foram isolar, identificar e avaliar o potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a leveduras associados ao filoplano de figueiras no Parque de Itapuã, Viamão, RS. Foram realizadas 6 coletas em diferentes pontos do Parque de Itapuã durante o ano de 2005 e 2006. Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5% Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados de acordo com características morfológicas e testes bioquímicos - fisiológicos. Foi testada a produção de enzimas de interesse industrial (amilase, celobiase, caseinase, gelatinase e esterase), além de toxinas “killer” pelos isolados. Dos 175 isolados obtidos, 125 são leveduras verdadeiras e 50 fungos semelhantes a leveduras. As 125 leveduras isoladas pertencem a 45 espécies, sendo oito de afinidade ascomicética e 37 de afinidade basidiomicética. Sete isolados tiveram as regiões D1/D2 do 26S rDNA seqüenciadas, sendo que quatro pertencem a duas espécies ainda não descritas do gênero Bullera. Dos 175 isolados 29,1% produziram amilase, 46,3% caseinase e 9,7% gelatinase. Foram testados 138 isolados para verificar a atividade de esterase, sendo 81,5% produtores da enzima. Das 126 cepas testadas para produção de celobiase, 74,8% produziram a enzima. Aproximadamente 4,5% dos isolados de leveduras e fungos semelhantes a leveduras apresentaram atividade “killer”. Assim sendo, o filoplano de figueiras demonstra ser um bom substrato para o isolamento de leveduras, inclusive de novas espécies. Estas leveduras demonstram ter potencial para contribuir efetivamente para a inovação biotecnológica. / The fig trees are found in abundance in the Itapuã Park, where they interact with various higher organisms and, potentially, with microrganisms. The objectives of this study were to isolate, identify and evaluate the biotechnological potential of yeasts and yeast-like fungi associated with phylloplane of fig trees in the Itapuã Park, Viamão, RS. Six samples were performed at different points in the Itapuã Park during 2005 and 2006. Leaf pieces were submitted to successive washings with 0.5% Tween 20. Decimal serial dilutions from the last washing were inoculated in modified YM medium and incubated at 25° C for 5-7 days. Representatives of the different morphotypes were purified and identified according to morphological characteristics, physiological and biochemical tests. We tested the production of industrially interesting enzymes (amylase, cellobiase, caseinase, gelatinase and esterase), besides the production of killer toxins. Of the 175 isolates obtained, 125 are yeasts and 50 yeast-like fungi. The 125 yeasts isolated belong to 45 species, eight with ascomycetic affinity and 37 with basidiomycetic affinity. Seven isolates had their 26S rDNA D1/D2 regions sequenced and four belong to two yet undescribed species of the genus Bullera. Of the 175 isolates, 29.1% were positive for amylase, 46.3% for caseinase and 9.7% for gelatinase. One hundred and thirty-eight isolates were tested for esterase activity, and 81.5% were producers of the enzyme. Of the 126 strains tested for the production of celobiase, 74.8% produced the enzyme. Approximately 4.5% of the isolates of yeasts and yeast-like fungi had "killer" activity. Therefore, the phylloplane of fig trees demonstrates to be a good substrate for the isolation of yeasts, including new species. These yeasts have the potential to contribute effectively to the biotechnological innovation.