O tradicional biodiesel de 1ª geração (produzido a partir de óleo de origem vegetal, como soja ou canola) possui muitas desvantagens e limitações como sazonalidade, uso de grandes áreas de cultivo, competição com alimentos, dentre outras. Uma alternativa são os óleos produzidos por microrganismos. Com o objetivo de otimizar a produção do óleo microbiano, o presente trabalho avaliou a produção de biomassa, lipídios e composição de ácidos graxos da levedura Yarrowia lipolytica QU21 quando cultivada em diferentes fontes de carbono (glicose e glicerol), nitrogênio (sulfato de amônio, triptona, ureia, nitrato de amônio e extrato de levedura), assim como diferentes condições de cultivo (agitação, aeração e razão carbono/nitrogênio). Dois resíduos industriais, glicerina bruta e resíduo de indústria cervejeira (FYE) também foram testados como substitutos da fonte de carbono e nitrogênio, respectivamente. Este trabalho também apresenta uma técnica de triagem de leveduras oleaginosas, de forma a quantificar os lipídios utilizando solventes menos agressivos, tanto para o manipulador quanto para o meio ambiente. A composição de ácidos graxos do óleo produzido pela Y. lipolytica QU21 quando cultivada em glicerina bruta e sulfato de amônio apresentou potencial utilização como matéria prima para o biodiesel. O uso combinado dos dois resíduos industriais pela Y. lipolytica QU21 resultou na produção de óleo com elevado teor de ácidos graxos poliinsaturados. Além de tornar o óleo microbiano da levedura Y. lipolytica QU21 uma matéria prima competitiva para a produção de biodiesel, a utilização da glicerina bruta poderia atenuar problemas ambientais, como a disposição inadequada no meio ambiente. / The traditional 1st generation biodiesel (produced from plant oils, such as soybeans and canola) has many drawbacks and limitations as season and climate-dependent cultivation, agricultural land competition for food, among others. Possible alternative oil sources is microbial oil produced by oleaginous microorganisms. With the purpose of optimizing the production of microbial oil, this study evaluated the production of biomass, lipid and fatty acid composition of the yeast Yarrowia lipolytica QU21 when grown on different carbon source (glucose and glycerol), nitrogen source (ammonium sulfate, tryptone, urea, ammonium nitrate and yeast extract) as well as different culture conditions (agitation, aeration and carbon/nitrogen ratio). Two industrial waste were also evaluated, crude glycerol and brewery waste (FYE) as surrogate carbon and nitrogen sources, respectively. This work also presents a technique for sorting oleaginous yeast in order to quantify the lipids using less aggressive solvent for both the handler and to the environment. The fatty acid composition of the oil produced by the Y. lipolytica QU21 growing on crude glycerol and ammonium sulfate showed potential use as a feedstock for biodiesel. The combined wastes resulted on microbial oil produced by Y. lipolytica QU21 with high polyunsaturated fatty acid content. Besides making the microbial oil a competitive feedstock for biodiesel production, the use of crude glycerol could mitigate environmental issues such as improper waste disposal.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318765.pdf: 2373273 bytes, checksum: e329a10e5147d84d16e405ecda427b9c (MD5) Previous issue date: 2013 / A maior parte do plantio nacional de maçãs é feita nos estados da região sul. Devido a eventos que comprometem a qualidade dos frutos, observam-se perdas anuais significativas na produção. A perspectiva dessas perdas pressiona o setor agroindustrial na busca por alternativas que agreguem mais valor aos frutos não destinados ao consumo in natura. Além da utilização destes na produção de suco, a obtenção de produtos diferenciados como a sidra mostra-se como uma das alternativas. A sidra é uma bebida alcoólica feita a partir do suco fermentado de maçãs, por um processo semelhante ao da produção de espumantes a partir de uvas, mas resultando num produto com menores teores de álcool. Vários fatores podem interferir na qualidade das sidras, sendo que as leveduras utilizadas e as condições de fermentação têm sido apontadas como os fatores que mais influenciam as características finais dessa bebida. Nesse contexto, este trabalho trata do isolamento de leveduras e de estudos visando agrupar e caracterizar isolados para essa finalidade. Os estudos foram de caráter preliminar, visando a criação de recursos para estabelecimento dessa linha de pesquisa. Embora tenha sido isolado mais de 200 leveduras, principalmente oriundas de atividades de maleicultura, neste trabalho apresentam-se os resultados obtidos de um grupo de 81 leveduras. A busca e caracterização de linhagens de leveduras iniciadoras para diferentes resultados enológicos e que predominem durante a fase fermentativa poderão permitir melhor controle do processo produtivo, além de estabelecer padrões elevados e duradouros, resultando em sidras de alta qualidade. <br> / Abstract: Most of the Brazilian national crop of apples is made in the southern states. Due to events that compromise the quality of the fruits, there are significant annual losses in production. The prospect of such losses presses the agribusiness sector to seek alternatives to add greater value to the fruit not destined for fresh consumption. Besides the use in the production of juice, differentiated products such as cider is shown as an alternative. Cider is an alcoholic beverage made from fermented apple juice, through a process similar to the production of sparkling wine from grapes, but resulting in a product with lower alcohol levels. Several factors can interfere with the quality of ciders, and the yeasts and fermentation conditions have been identified as the factors that most influence the final characteristics of this drink. In this context, this work had the objective of isolating yeasts and developing studies to determine and characterize the best candidates for the production of cider. The studies were preliminary in nature in order to create resources for the establishment of this line of research. While we have isolated over 200 yeasts, primarily from apple orchards and processing facilities, in this work we present the results obtained for only 81 of them. The search and characterization of potential yeast strains for different starting and oenological properties that prevail during the fermentation phase, may allow better control of the production process, and establish high standards for the obtainment of high quality ciders.

Saccharomyces cerevisiae é uma levedura que possui papel fundamental na transformação do mosto em vinho. Durante a fermentação, a levedura selecionada transfere para o meio, componentes resultantes de seu metabolismo como etanol, aldeídos, enzimas, proteínas, entre outros. Existem algumas que possuem ação definida, como a proteína killer. Este trabalho teve como objetivo determinar as condições necessárias para a detecção e expressão do fator killer produzido por linhagens de levedura Sacch. cerevisiae isoladas de mosto de uva. Como linhagens killer, foram utilizadas as linhagens Sacch. cerevisiae Embrapa 91B, Sacch. cerevisiae Embrapa 1B, e uma linhagem comercial Sacch. cerevisiae K1 (Lallemand). Como linhagem sensível, foi empregada Sacch. cerevisiae Embrapa 26B. Para detecção do fator killer foram avaliados meios de cultura sólidos, preparados com diferentes concentrações de mosto de uva e extrato de levedura não comercial (ELNC). Para a produção do fator killer foram avaliados meios líquidos com diferentes concentrações de mosto de uva, ELNC e sacarose. Foi avaliada a produção do fator em condições aeróbicas e anaeróbicas de crescimento. O meio de cultura definido para detecção do fator killer foi o meio contendo 80 % de mosto de uva e 20 % de ELNC em sua composição. O meio líquido que proporcionou melhores condições de síntese do fator killer foi o meio preparado com 5% de mosto e 95 % de ELNC contendo 100 g/L de sacarose. A expressão do fator killer foi inibida em condições aeróbicas, exceto quando as linhagens foram cultivadas em meio líquido com elevada concentração de sacarose. / The yeast Saccharomyces cerevisiae has a key role in the process of converting must into wine. During fermentation the selected yeast transfers to the medium compounds resulting from metabolism such as ethanol, aldehyde, enzymes and proteins. Some compounds have an antibiotic effect like killer proteins. The aim of this work was to verify the conditions for detection and expression of killer factor produced by Sacch. cerevisiae isolated from grape must. The killer yeast strains used for the experiments were Sacch. cerevisiae Embrapa 91B, Sacch. cerevisiae Embrapa 1B and a commercial yeast Sacch. cerevisiae K1 (Lallemand). The yeast Sacch. cerevisiae Embrapa 26B was used as sensitive strain. Solid media prepared with different concentrations of grape must and non-commercial yeast extract (ELNC), were used to detect the killer factor. Culture media prepared with different concentrations of grape must, ELNC and sucrose, were employed for killer factor expression. Synthesis of killer protein was evaluated under anaerobic and aerobic growth conditions. Detection of killer protein presented better results when using a culture medium prepared with 80 % of grape must and 20 % of ELNC. The liquid medium that provided the best conditions for killer factor expression was prepared with 5 % of grape must and 95 % of ELNC supplemented with 100 g/L of sucrose. Killer factor expression was inhibited under aerobic conditions, except when strains were growth in liquid media prepared with high concentrations of sucrose.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-11T17:33:32Z No. of bitstreams: 1 2017_IsabelaCastrodeAlmeida.pdf: 6885936 bytes, checksum: 742995652a42e8191db269881d3a1907 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-20T16:22:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_IsabelaCastrodeAlmeida.pdf: 6885936 bytes, checksum: 742995652a42e8191db269881d3a1907 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-20T16:22:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_IsabelaCastrodeAlmeida.pdf: 6885936 bytes, checksum: 742995652a42e8191db269881d3a1907 (MD5) Previous issue date: 2017-09-20 / O presente trabalho avaliou o potencial de utilização do arroz BRS AG, desenvolvido pela Embrapa Clima Temperado, como biomassa para a produção de etanol. Comparativamente, também foram realizados estudos sobre a conversão do arroz comercial (BRS PAMPA) em etanol. Inicialmente o amido presente no arroz é hidrolisado à açucares monoméricos fermentáveis, glicose, para posterior processo de fermentação. Isso porque a principal levedura utilizada, Saccharomyces cerevisiae, não consegue converter diretamente o amido em etanol. O processo de conversão do amido presente no arroz comercial (BRS PAMPA) em glicose foi otimizado, variando-se o tempo de ação das enzimas, para posterior utilização das melhores condições reacionais na hidrólise do arroz BRS AG. Na reação de hidrólise que levou a maior concentração final de glicose (130,16 g/L), a etapa de liquefação com a enzima Termamyl 2X ocorreu por 1 h, seguida da sacarificação com a enzima AMG 300 L por 3 h. Adotando-se as mesmas condições reacionais, obteve-se 133,28 g/L de glicose para a hidrólise com o arroz BRS AG. Avaliou-se o comportamento de diferentes linhagens comerciais da levedura S. cerevisiae: BG-1; CAT-1; FT-858; JP-1; PE-2; SA-1, em reações de fermentação dos hidrolisados de arroz, sob agitação de 150 rpm e temperatura de 32 ˚C, conduzidas em Shaker Orbital. Os maiores rendimentos das fermentações com o hidrolisado de arroz comercial foram obtidos pelas leveduras SA-1, rendimento de 93% e concentração final de etanol de 58,92 g/L, e CAT-1, rendimento de 92,7% e concentração final de etanol de 58,93 g/L. Para as fermentações com o hidrolisado de arroz gigante, os maiores rendimentos foram obtidos pelas leveduras FT-858, rendimento de 94,8% e concentração final de etanol de 66,13 g/L, e CAT-1, rendimento de 94,4% e concentração final de etanol de 65,85 g/L. Após análise dos resultados obtidos para as fermentações com as diferentes linhagens da S. cerevisiae, a levedura CAT-1 foi utilizada nas fermentações realizadas em reator. O rendimento para a fermentação com arroz comercial foi de 57,9% e para o arroz gigante 59,2%. Os valores obtidos foram baixos em comparação as fermentações realizadas com essa levedura para os hidrolisados de arroz em erlenmeyer no sistema de agitação em Shaker Orbital. O volume ocupado no reator com os respectivos hidrolisados de arroz correspondia a 30% do volume total. Em contrapartida, ocupou-se 56% do volume total do erlenmeyer com os hidrolisados para as fermentações realizadas em Shaker Orbital. Com isso, a maior quantidade de oxigênio presente nas fermentações em reator favoreceu o crescimento celular, à fermentação anaeróbica, obtendose menor rendimento de etanol. Além disso, os valore obtidos para o rendimento de etanol após fermentação dos hidrolisado foram baixos em comparação a plantas eficientes de produção etanol de milho. Dessa forma, esse trabalho possui como perspectivas futuras a otimização dos parâmetros fermentativos, visando a melhoria do processo, a obtenção de maiores rendimentos de etanol, e menor formação de coprodutos. Como um estudo preliminar, o processo de obtenção de etanol a partir de arroz (BRS AG e comercial) foi simulado com o auxílio do software Aspen Plus®, permitindo estabelecer condições operacionais para determinação dos balanços de massa das correntes de processo. Resultados das simulações mostraram que existe um grande potencial de simuladores de processos químicos aliados as informações provenientes de fermentações realizadas em escala de laboratório. / The present study evaluated the potential of BRS AG, also called giant rice, as biomass for ethanol production. Comparatively, studies on the conversion of commercial rice (BRS PAMPA) into ethanol were also carried out. Initially the starch present in the rice is hydrolyzed into fermentable monomeric sugars, glucose, for later fermentation process. This is because the main yeast used, Saccharomyces cerevisiae don't convert the starch to ethanol directly. The starch conversion present in commercial rice (BRS PAMPA) to glucose was optimized varying the time of enzymes action. The best reaction conditions were used in the hydrolysis of BRS AG rice. The hydrolysis reaction that led to the highest final glucose concentration (130.16 g/L) was performed with 1 h of liquefaction using Termamyl 2X, followed by saccharification with AMG 300 L for 3 h. The same reaction conditions were adopted with BRS AG rice hydrolysis and the glucose concentration obtained was 133.28 g/L. Different commercial strains of S. cerevisiae yeast, BG-1; CAT-1; FT-858; JP-1; PE-2; SA-1, were evaluated in fermentation reactions of rice hydrolyzates, performed in Shaker Orbital. The highest yields fermentation with commercial rice hydrolyzate were obtained by SA-1 yeasts, 93% yield and ethanol concentration of 58.92 g/L, and CAT-1, 92.7% yield and ethanol concentration of 58.93 g/L. For fermentations with giant rice hydrolyzate, highest yields were obtained by FT-858 yeast, 94.8% yield and ethanol concentration of 66.13 g/L, and CAT-1, yield 94.4 % and ethanol concentration of 65.85 g/L. After analyzed the fermentations results with different strains of Saccharomyces cerevisiae, the yeast CAT-1 was used in the fermentations carried out in the reactor. The yield obtained for fermentation of commercial rice was 57.9% and for the giant rice 59.2%. These values were low compared to the fermentations carried out in erlenmeyers with this yeast for rice hydrolyzates in the Shaker Orbital stirring system. The volume occupied in the reactor with the respective rice hydrolyzates corresponded to 30% of the total volume. In contrast, 56% of the erlenmeyer total volume was filled with the hydrolyzates for the fermentations carried out in Shaker Orbital. In this way, higher amount of oxygen present in the reactor fermentations favored the cell growth, to the anaerobic fermentation, obtaining a lower ethanol yield. In addition, the values obtained for ethanol yield after fermentation of rices hydrolyzate were low compared to yield of efficient corn ethanol production plants. Thus, this work has as future prospects the optimization of fermentation parameters, aiming to improve the process, obtaining higher ethanol yields, and lower co-product formation. As a preliminary study, the process of ethanol production from rice (BRS AG and commercial) was simulated with aid of Aspen Plus® software, allowing to establish operational conditions for determination of the mass balance of the process streams. Simulations results showed that there is a great potential of chemical processes simulators allied to the information obtained from fermentations carried out in laboratory scale.

O tradicional biodiesel de 1ª geração (produzido a partir de óleo de origem vegetal, como soja ou canola) possui muitas desvantagens e limitações como sazonalidade, uso de grandes áreas de cultivo, competição com alimentos, dentre outras. Uma alternativa são os óleos produzidos por microrganismos. Com o objetivo de otimizar a produção do óleo microbiano, o presente trabalho avaliou a produção de biomassa, lipídios e composição de ácidos graxos da levedura Yarrowia lipolytica QU21 quando cultivada em diferentes fontes de carbono (glicose e glicerol), nitrogênio (sulfato de amônio, triptona, ureia, nitrato de amônio e extrato de levedura), assim como diferentes condições de cultivo (agitação, aeração e razão carbono/nitrogênio). Dois resíduos industriais, glicerina bruta e resíduo de indústria cervejeira (FYE) também foram testados como substitutos da fonte de carbono e nitrogênio, respectivamente. Este trabalho também apresenta uma técnica de triagem de leveduras oleaginosas, de forma a quantificar os lipídios utilizando solventes menos agressivos, tanto para o manipulador quanto para o meio ambiente. A composição de ácidos graxos do óleo produzido pela Y. lipolytica QU21 quando cultivada em glicerina bruta e sulfato de amônio apresentou potencial utilização como matéria prima para o biodiesel. O uso combinado dos dois resíduos industriais pela Y. lipolytica QU21 resultou na produção de óleo com elevado teor de ácidos graxos poliinsaturados. Além de tornar o óleo microbiano da levedura Y. lipolytica QU21 uma matéria prima competitiva para a produção de biodiesel, a utilização da glicerina bruta poderia atenuar problemas ambientais, como a disposição inadequada no meio ambiente. / The traditional 1st generation biodiesel (produced from plant oils, such as soybeans and canola) has many drawbacks and limitations as season and climate-dependent cultivation, agricultural land competition for food, among others. Possible alternative oil sources is microbial oil produced by oleaginous microorganisms. With the purpose of optimizing the production of microbial oil, this study evaluated the production of biomass, lipid and fatty acid composition of the yeast Yarrowia lipolytica QU21 when grown on different carbon source (glucose and glycerol), nitrogen source (ammonium sulfate, tryptone, urea, ammonium nitrate and yeast extract) as well as different culture conditions (agitation, aeration and carbon/nitrogen ratio). Two industrial waste were also evaluated, crude glycerol and brewery waste (FYE) as surrogate carbon and nitrogen sources, respectively. This work also presents a technique for sorting oleaginous yeast in order to quantify the lipids using less aggressive solvent for both the handler and to the environment. The fatty acid composition of the oil produced by the Y. lipolytica QU21 growing on crude glycerol and ammonium sulfate showed potential use as a feedstock for biodiesel. The combined wastes resulted on microbial oil produced by Y. lipolytica QU21 with high polyunsaturated fatty acid content. Besides making the microbial oil a competitive feedstock for biodiesel production, the use of crude glycerol could mitigate environmental issues such as improper waste disposal.

Com o aumento de pacientes imunocomprometidos nas últimas décadas, os fungos têm emergido como uma das causas de doenças humanas. Leveduras ubíquas e/ou comensais como Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. estão sendo descritas como importantes causadoras de infecções. Com o objetivo de avaliar clinicamente os casos de infecções por leveduras emergentes, foi realizado um estudo de 101 casos diagnosticados da Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre nos últimos anos, revisando a apresentação clínica, condição predisponente, terapia utilizada e evolução dos pacientes. A doença de base mais frequente foi insuficiência renal. A manifestação clínica principal foi febre. Os fatores de risco mais frequentes foram uso de cateter venoso central e internação em unidade de terapia intensiva. O antifúngico mais utilizado no tratamento das infecções por S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri e Trichosporon sp. foi o fluconazol e no tratamento das infecções por Rhodotorula sp. foi a anfotericina B. Aproximadamente 32% dos pacientes apresentaram melhora clínica após o tratamento com antifúngico e 26% foram a óbito. O diagnóstico rápido e específico destas leveduras é importante para a decisão terapêutica e o melhor prognóstico. / With the increase of immunocompromised patients in recent decades, fungi have emerged as a major cause of human diseases. Ubiquitous yeast and/or commensal as Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula sp., Kodamaea (Pichia), Trichosporon sp. are described as important causative agents of infections. Faced with this, the identification of yeast is important for therapeutic decisions and for epidemiological studies. In order to clinically evaluate the cases of yeast infections emerging, a study of the major cases diagnosed at Irmandade Santa Casa de Misericordia de Porto Alegre in recent years, reviewing the clinical presentation, predisposing condition, therapy and patients’s progress. The underlying disease frequently was renal failure. The major clinical manifestation was fever. The most frequent risk factors were: use of central venous catheter and intensive care unit stay. The most used antifungal in the treatment of infections caused by S. cerevisiae, Kodamaea ohmeri and Trichosporon sp. was fluconazole and in the cases of infections by Rhodotorula sp. was amphotericin B. Most patients showed clinical improvement after treatment with antifungal. Approximately 32% of patients showed clinical improvement after treatment with antifungal and 26% died.The rapid and specific diagnosis of these yeasts is important for the therapeutic decision and a better prognosis.

Marismas são ecossistemas entremarés altamente produtivos que suportam grandes variações de salinidade e são cobertos por vegetação herbácea adaptada que abriga diversos microrganismos. Os objetivos do presente trabalho foram isolar e avaliar a diversidade e o potencial biotecnológico de leveduras associadas ao filoplano de macrófitas aquáticas de uma marisma da Ilha da Pólvora – RS. Foram realizadas cinco coletas de hastes e folhas de três espécies de macrófitas Scirpus maritimus, Spartina alterniflora e Spatirna densiflora entre junho de 2012 e janeiro de 2013. As amostras foram colocadas em solução de Tween 20 a 0,5% e incubadas a 200 rpm por 30 minutos. Em seguida foram realizadas diluições decimais seriadas (10-1, 10-2 e 10-3) e um volume de 0,1mL foi inoculado em ágar malte levedura acidificado ao pH 4.0 e suplementado com 0.04% de cloranfenicol e 0.01% de bifenila. As placas foram incubadas por 7 dias a 20 – 25 oC e as colônias isoladas e purificadas em meio Glucose Yeast Peptone. Isolados de leveduras e fungos leveduriformes foram agrupados de acordo com a morfologia de colônia e testados quanto a afinidade ascomicética ou basidiomicética em meio uréia/DBB. O potencial biotecnológico dos isolados foi avaliado por meio de testes enzimáticos para a produção das enzimas de interesse industrial amilase, esterase, caseinase, celulase, gelatinase e lipase. As leveduras que obtiveram maior produção também foram testadas quanto à capacidade de degradar o corante azóico Acid Red 357. Foram obtidos 102 isolados, 37 leveduras de afinidade basidiomicética, 27 leveduras de afinidade ascomicética e 38 fungos leveduriformes. Cinco linhagens tiveram as regiões D1/D2 e/ou região ITS do DNA sequenciadas, sendo duas delas pertencentes à espécie Hortaea werneckii, de importância clínica. Dos 102 isolados, todos produziram lipase, 63,7% esterase, 50% gelatinase, 47% amilase, 45% caseinase e 45% celulase. As linhagens testadas no meio com o corante azóico obtiveram crescimento muito rápido e foram capazes de clarear a cor do meio, porém devem ser futuramente testadas em outras concentrações de corante para uma melhor visualização do resultado. Os resultados do trabalho demonstram o grande potencial biotecnológico de leveduras e fungos leveduriformes associados ao filoplano de plantas de marismas e, portanto, sua capacidade de contribuir para o avanço da biotecnologia. / Salt marshes are highly productive intertidal ecosystems that support large variations in salinity and are covered by herbaceous vegetation that home many microorganisms. The objectives of this study were to isolate and evaluate the diversity and the biotechnological potential of yeasts associated with phylloplane of aquatic weeds in a salt marsh on the island of Pólvora - RS. Five surveys were carried, between June 2012 and January 2013, and stems and leaves of three species of macrophytes, Scirpus maritimus, Spartina alterniflora and Spartina densiflora, were collected. The samples were placed in 0.5% Tween 20 solution and incubated at 200 rpm for 30 minutes. Decimal serial dilutions (10-1, 10-2 and 10-3) were performed, and a volume of 0.1 mL was inoculated onto YM acidified to pH 4.0 and supplemented with 0.04% chloramphenicol and 0.01% biphenyl. Plates were incubated for 7 days at 20 - 25 ° C, and colonies were isolated and purified in GYP medium. Isolates of yeasts and yeast-like fungi were grouped according to colony morphology, and tested for ascomycetous or basidiomycetous affinity in urease / DBB medium. The biotechnological potential of the isolates was assessed by enzymatic assays for the production of enzymes of industrial interest amylase, esterase, caseinase, cellulase, lipase and gelatinase. Yeasts with the greatest production were also tested for their ability to degrade azo dye Acid Red 357. 102 yeast isolates were obtained, 37 with basidiomycetous affinity, 27 with ascomycetic affinity and 38 yeast-like fungi. Five strains had the D1 / D2 regions and / or the ITS region of rDNA sequenced, two of which is Hortaea werneckii, a species of clinical importance. Of the 102 isolates, all produced lipase, 63.7% esterase, 50% gelatinase, 47% amylase, 45% caseinase and 45% cellulase. The strains tested in the medium with the azo dye grew very rapidly, and were able to lighten the color of the medium, but they must be further tested in other dye concentrations for a better evaluation of the result. Our results demonstrate the great biotechnological potential of yeasts and yeast-like fungi associated with the phylloplane of macrophytes, and therefore their ability to contribute to the advancement of biotechnology.

Para melhor compreender o papel dos micro-organismos nas doenças da cavidade bucal, é necessário inicialmente avaliar a diversidade microbiana naturalmente existente em indivíduos saudáveis, além de sua distribuição espacial na cavidade bucal. Muitos estudos são conduzidos elucidando o papel do biofilme e das bactérias na saúde bucal, porém poucas pesquisas focaram na atuação das leveduras. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a diversidade e distribuição de leveduras do gênero Candida na microbiota bucal de indivíduos saudáveis. Foram coletadas amostras da boca pacientes adultos saudáveis. Foram obtidas amostras de 9 diferentes habitats da boca: bochechas direita e esquerda, assoalho da boca, palato, língua dorsal, língua ventral, dente molar, vestíbulo labial e saliva. Foram avaliados 100 pacientes com uma média de 28 dentes. Quarenta e nove indivíduos apresentaram leveduras na sua microbiota bucal. Candida albicans foi o micro-organismo mais prevalente (49%), seguido de Candida krusei, Candida parapsilosis, Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii), Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida dubliniensis. A associação das leveduras encontradas e os habitats bucais sugeriu que comunidades leveduriformes podem distinguir-se entre os diferentes tecidos da cavidade bucal. A língua (dorsal e ventral) apresentou colonização específica, caracterizada pelas espécies C. tropicalis e C. dubliniensis. De forma semelhante, a microbiota dos habitats revestidos por mucosa foi análoga. A microbiota da língua e dos tecidos duros assemelhou-se entre si em menor intensidade. Estes resultados introduzem a dimensão espacial desta diversidade microbiana que vem sendo estudada, complementando as informações obtidas nos estudos do microbioma humano. / To better understand the role of microorganisms in the diseases of the oral cavity, first it is necessary to evaluate the natural microbial diversity in healthy individuals, as well as their spatial distribution in the oral cavity. Many studies are conducted elucidating the role of biofilms and bacteria in oral health, but few research has focused on the yeast’s performance. In this sense, the objective of this study was to evaluate the diversity and distribution of Candida species in the oral microbiota of healthy individuals. Samples were colleted from the mouth of healthy adults. Samples of 9 different mouth habitats were obtained: right and left cheeks, floor of the mouth, palate, dorsal tongue, ventral tongue, molar tooth, labial vestibule and saliva. We evaluated 100 patients with an average of 28 teeth. Forty-nine subjects had yeasts in their oral microbiota. Candida albicans was the most prevalent microorganism (49%), followed by Candida krusei, Candida parapsilosis, Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii), Candida glabrata, Candida tropicalis and Candida dubliniensis. The association found between the yeasts and oral habitats suggested that communities can be distinguished by the different tissues of the oral cavity. The tongue (dorsal and ventral) presented specific colonization, characterized by the species C. tropicalis, and C. dubliniensis. Similarly, the microbiota of the mucous habitats was similar. The microbiota of the tongue and hard tissue resembled each other in a lesser degree. These results introduce the spatial dimension of the microbial diversity that has been studied, complementing the information obtained in the human microbiome research.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-07-25T15:51:49Z No. of bitstreams: 1 2014_MaritzaOcampoBetancur.pdf: 2785011 bytes, checksum: 1e7f6e8c3bda3abce6c1882650617a39 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-29T14:39:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MaritzaOcampoBetancur.pdf: 2785011 bytes, checksum: 1e7f6e8c3bda3abce6c1882650617a39 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-29T14:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MaritzaOcampoBetancur.pdf: 2785011 bytes, checksum: 1e7f6e8c3bda3abce6c1882650617a39 (MD5) / A levedura Pichia pastoris tem sido amplamente utilizada na produção de proteínas recombinantes devido a características como fácil manipulação, rápido crescimento e capacidade de fazer modificações pós-traducionais mais similares às dos mamíferos. Apesar do vasto uso desta levedura como sistema de expressão, há poucas marcas de seleção disponíveis para sua manipulação genética. As marcas existentes podem ser auxotróficas (genes de vias biossintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, dentre outros) ou dominantes (geralmente genes que conferem resistência a drogas). O limitado número de marcas seletivas atualmente disponíveis restringe a construção de cepas de P. pastoris contendo mais de uma modificação genética. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi interromper, pela primeira vez, o gene LEU2 no genoma de P. pastoris com o fim de gerar uma linhagem auxotrófica para o aminoácido leucina que pudesse ser utilizada como hospedeira para vetores contendo este gene como marca de seleção. A ruptura gênica foi obtida pela transformação da levedura com um cassete de expressão contendo os genes kanR (resistência a kanamicina/G418) ou Sh ble (resistência a zeocina) flanqueados por regiões 5´ e 3´ do gene LEU2 para promover a recombinação homóloga neste locus. Para construir esse cassete de deleção o gene clonado LEU2 teve um fragmento de aproximadamente 400 pb excisado após digestão com enzimas de restrição sendo substituído pelo cassete de expressão flanqueado por sequências loxP. Após transformação e seleção de mutantes auxotróficos, a marca dominante foi removida. Para tanto, a levedura foi transformada com um vetor contendo o gene que codifica para a proteína CreA, uma recombinase sítio-específica que catalisa a reação de recombinação entre duas sequências loxP. Finalmente, para testar esta nova linhagem, foi construído um vetor contendo eGFP como gene repórter e o gene LEU2 como marca de seleção. A transformação da linhagem auxotrófica leu2 com esse vetor confirmou a recuperação da prototrofia e a capacidade da levedura para produzir a proteína heteróloga intracelularmente. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yeast Pichia pastoris has been widely used for the production of recombinant proteins due to several characteristics such as easy genetic manipulation, fast growth and the ability to carry out post-translational modifications similarly to mammals. Despite the wide use of Pichia pastoris as expression system there are few selectable markers available for its genetic manipulation. The existing markers can be auxotrophic (genes of biosynthetic pathways, for example HIS4, ARG4, URA3, ADE1, among others) or dominant (mainly genes that confer drug resistance). The limited number of available selectable markers restricts the construction of strains with more than one recombinant modification. The aim of this study was to interrupt, for the first time, the LEU2 gene in the P. pastoris genome to generate an auxotrophic strain for the amino acid leucine which could be used as host strain for vectors carrying the LEU2 gene as selectable marker. The disruption was achieved transforming the yeast with an expression cassette that contained the kanR (kanamycin/G418 resistance) or Sh ble genes (zeocin resistance) flanked by regions from the LEU2 gene to promote homologous recombination at that locus in the P. pastoris genome. To construct that deletion cassette the cloned LEU2 gene had an excised fragment of approximately 400 bp after digestion with restriction enzymes. That fragment was substituted by the expression cassette flanked by loxP sequences. After transformation and selection of auxotrophic mutants the dominant marker was removed. To accomplish this, the yeast was transformed with a vector carrying the gene that codes for the CreA protein, a site-specific recombinase that catalyzes the recombination reaction between two loxP sequences. Finally, to test the new strain, it was constructed a vector containing eGFP as a reporter gene and the LEU2 gene as a selectable marker. Transformation of P. pastoris leu2 with that vector confirmed the recovery of the prototrophy and the ability of the yeast to produce the intracellular heterologous protein. ______________________________________________________________________________ RESUMEN / La levadura Pichia pastoris ha sido ampliamente utilizada para la producción de proteínas recombinantes debido a características como fácil manipulación, rápido crecimiento y la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a las de los eucariotas. A pesar del gran uso de esta levadura como sistema de expresión hay pocas marcas de selección disponibles para su manipulación genética. Las marcas existentes pueden ser auxotróficas (genes de vías biosintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, entre otros) o dominantes (principalmente genes que confieren resistencia a drogas). El limitado número de marcas de selección disponibles actualmente restringe la construcción de cepas de P. pastoris con más de una modificación recombinante. En este contexto, el objetivo de este estudio fue interrumpir, por primera vez, el gen LEU2 en el genoma de P. pastoris con el fin de generar una cepa auxotrófica para el aminoácido leucina que pudiera ser utilizada como hospedera para vectores que tengan el gen LEU2 como marca de selección. La ruptura se logró al transformar la levadura con un casete de expresión que contenía el gen kanR (resistencia a kanamicina/G418) o el gen Sh ble (resistencia a zeocina) flanqueado por regiones del gen LEU2 para promover recombinación homóloga en ese locus del genoma de P. pastoris. Para esto se clonó el gen LEU2 y se digirió con enzimas de restricción para retirar un fragmento de aproximadamente 400 pb el cual se reemplazó por el casete de expresión flanqueado por secuencias loxP. Después de la transformación y selección de mutantes auxotróficos se removió la marca dominante. Para esto se transformó la levadura con un vector que contenía el gen que codifica para la proteína CreA, una recombinasa sitio-específica que cataliza la reacción de recombinación entre dos secuencias loxP. Finalmente para evaluar la nueva cepa se construyó un vector que contenía el gen eGFP como reportero y el gen LEU2 como marca de selección. La transformación de P. pastoris leu2 con este vector confirmó la recuperación de la prototrofía y la capacidad de la levadura para producir la proteína heteróloga intracelularmente.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de pós-graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-21T13:44:10Z No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-24T12:05:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T12:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / A utilização da biomassa tem se tornado uma atrativa fonte alternativa para a produção de energia. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na indústria de fermentação alcoólica, porém não possui atividade amilolítica. Portanto, a modificação genética dessa levedura vem sendo feita para obteção de novas linhagens amilolíticas. O presente trabalho teve como objetivo a construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas na superfície de S. cerevisiae para coexpressar a enzima α-amilase de Bacillus subtilis juntamente com a glicoamilase de Aspergillus awamori na parede celular da levedura. Para ancorar as proteínas de interesse à parede foi feita a fusão destas com a região C-terminal da α-aglutinina da própria levedura, contendo a sequencia sinal para adição da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e as proteínas expressas na linhagem MFL. Utilizou-se três formas diferentes de glicoamilase, uma contendo o gene completo (gla1), outra apenas com o domínio catalítico e a região altamente O- glicosilada (gla2) e uma última com domínio catalítico e parte da região O- glicosilada (gla3). Os testes de atividade mostraram que a enzima α-amilase aderiu à parede celular, porém a maior parte da proteína produzida ainda era secretada para fora da célula. As maiores atividades encontradas para as construções contendo α-amilase fusionada à porção C-terminal da α-aglutinina foi de 0,99 ± 0,02 U/mL e 89,43 ± 5,27 U/mL, associada à célula e no sobrenadante, respectivamente. A secreção da α-amilase para o meio de cultura apresentou grande aumento quando fusionada a outra proteína. A atividade observada para glicoamilase também foi maior no sobrenadante de cultura. As três diferentes formas de glicoamilase fusionadas à α-aglutinina não apresentaram diferenças significativas de expressão entre si. A análise do perfil secretório mostrou que as enzimas fusionadas encontradas no sobrenadante de cultura apresentam a mesma massa molecular da enzima secretada sem fusão alguma. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biomass has become an attractive alternative source for energy production. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used microorganism in industrial fermentation, however it doesn’t have amylolytic activity. Therefore, molecular engineering of this yeast have been done to obtain new amylolytic strains. The aim of this work was to construct a vector for expression of heterologous proteins on the cell surface of S. cerevisiae to coexpress the α-amylase from Bacillus subtilis and the glucoamylase of Aspergillus awamori in the yeast cell wall. To anchor the proteins to the wall, they were fused with the C-terminal region of α-agglutinin containing the signal sequence for addition of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and the protein produced expressed in the MFL strain. We used three different forms of glucoamylase: one containing the complete gene (gla1), another with only the catalytic domain and the highly-glycosylated region (gla2) and the last one with a catalytic domain and part of the O-glycosylated region (gla3). The activity tests showed that the enzyme α-amylase was attached to the cell wall, but most of the produced protein was secreted to the culture medium. The highest activities found for the constructs containing α-amylase fused to the C-terminal region of α-agglutinin was 0,99 ± 0,02 U/mL and 89,43 ± 5,27 U/mL, to pellet and supernatant, respectively. The secretion of α-amylase protein was greatly increased when fused to another protein. The activity found for glucoamylase was also higher in the culture supernatant. The three different forms of glucoamylase fused to C-terminal region of α-agglutinin showed no significant differences in expression among them. The secretory analysis showed that merged enzymes found in the culture’s supernatant presented the same molecular mass as the enzyme secreted without any fusion.