Made available in DSpace on 2015-11-04T13:36:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leandro_alves_ioc_mest_2014.pdf: 112755376 bytes, checksum: b2de2958661b65ce907ca9c107efa88b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Existem diversas doenças crônico degenerativas que afetam diretamente a capacidade contrátil e força muscular da musculatura esquelética e/ou cardíaca, sejam elas doenças de cunho inflamatório ou genético. Dentre elas, podemos destacar as distrofias musculares e a miopatias inflamatórias (MI), que além da fraqueza progressiva e perda da resistência dos músculos esqueléticos, exibem importante infiltração inflamatória. A infiltração inflamatória gera danos secundários ao tecido muscular, agravando a doença com a perda da força muscular. A histopatologia do músculo lesionado é caracterizada pela presença de células inflamatórias, tais como linfócitos T, macrófagos e células dendríticas (DC). Em diversas MI, as DC são encontradas circundando fibras musculares lesionadas ou não ou mesmo invadindo fibras necróticas e não necróticas. Esta propriedade ilustra a importância da interação entre as DC e as células musculares e que exercem potencial papel na progressão das doenças musculares degenerativas. Além disso, as DC são células chave na indução da resposta imune adaptativa assim como na integração das respostas inata e específica. Entretanto a interação existente entre as DC e os mioblastos, células responsáveis pela regeneração do tecido muscular, ainda não foi claramente determinada. O objetivo desse estudo é, portanto, determinar se há interação entre as DC e mioblastos, e também que alterações morfológicas e funcionais ocorre nos mioblastos após a interação Para responder o objetivo do trabalho realizamos co-cultivos in vitro de mioblastos e DC. Para tal utilizamos DC imaturas (iDC), cultivadas apenas com meio de cultura, e DC ativadas (actDC), cultivadas ativadas por LPS. Por microscopia de luz e eletrônica observamos que as iDC e actDC aderem aos mioblastos, principalmente às actDC. Nós observamos por microscopia óptica e eletrônica que as DC aderem firmemente aos mioblastos nos estágios de proliferação e diferenciação. No estágio de diferenciação, o co-cultivo com iDC e actDC observamos que as miofibras formadas foram mais finas e desorganizadas, principalmente com actDC. Além disso também observamos a diminuição na formação de miotubos e diminuição na de myoD e miogenina, com diferenças mais pronunciadas no co-cultivo com actDC. No estágio de proliferação o cocultivo com iDC e actDC aumentou a marcação de mioblastos BrdU+, principalmente no co-cultivo com actDC. A expressão de fibronectina, caderina e laminina no co-cultivo não foi alterado. Entretanto no estágio de diferenciação, observamos por imunofluorescência, que a marcação para aactinina, b-catenina e laminina não foi alterada. Fato interessante foi a indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), uma enzima que degrada o aminoácido triptofano e promove imunotolerância foi observada marcação nos mioblastos. Quando realizamos o co-cultivo, principalmente com actDC, houve aumento na expressão de IDO nas células musculares tanto no estágio de proliferação como no de diferenciação. Analisamos que houve diminuição na capacidade de migração dos mioblastos no cocultivo com iDC e actDC, e que a diferença é pronunciada com actDC. Por fim, houve aumento na liberação de citocinas e aumento na expressão de HLA-ABC e HLA-DR no co-cultivo com actDC. Nos dados sugerem que o co-cultivo de DC e mioblastos alteram os mioblastos e que essa mudança indica uma contribuição das DC na evolução das MI / There are several chronic degenerative diseases that are either inflammatory diseases or genetic diseases which directly affect the contractile capacity and muscle strength in skeletal muscle and / or the heart. It is possible to highlight the muscular dystrophies and inflammatory myopathies (IM), which have clinical symptoms such as progressive weakness and loss of skeletal muscle strength and the exhibition of significant inflammatory infiltration. Inflammatory infiltration generates secondary muscle tissue damage and exacerbates the progression of the disease and muscle weakness. The sick muscle histopathology is characterized by the presence of inflammatory cells such as T lymphocytes, macrophages and dendritic cells (DC). In several IM, DC are found surrounding or even invading necrotic and non-necrotic muscle fibers and this facet illustrates the importance of the interaction between the aforementioned cells and the potential in the progression of degenerative muscle diseases. Furthermore, DC cells are key for the induction of the adaptive immune response as well as the integration of innate and specific responses. However the interaction between DCs and myoblasts, the cells which are responsible for muscle tissue regeneration, has not been clearly determined. Therefore, the aim of this study is to determine whether there is interaction between DCs and myoblasts and also any morphological and functional changes that occur in the myoblasts as a result of the interaction. In order to answer our question, we designed an in vitro co-culture of myoblasts plus DCs. We used immature DCs (iDC) cultured with medium only and activated DCs (actDC) cultured with medium and LPS. We observed by optical and electron microscopy that DCs have a tight adhesion with myoblasts in the proliferation or differentiation phases. Upon the co-culturing of iDC and actDC in the differentiation phase, we observed that the myofibers formed were thinner and more disorganized, especially in the actDC co-culture. In addition, we also observed a decrease in myotube formation, and a decrease in myoD and myogenin expression in the co-cultures of iDC and actDC. Furthermore, the aforementioned decreases in formation and expression were more pronounced in the actDC co-culture. During myoblast proliferation the co-culturing of iDC and actDC increased the staining in myoblasts for BrdU, especially in myoblasts from the actDC co-culture. In addition, the expression of fibronectin, cadherin and laminin in the co-cultures did not change. However, during myoblast differentiation, we observed via immunoflourescence that the staining of α-actinin, β-catenin, and laminin was unaltered in the different co-cultures. Interestingly, indoleamine 2,3 dioxigenase (IDO), an enzyme that degrades the essential amino acid tryptophan and promotes immune tolerance, was found to be expressed in myoblasts. Moreover, this expression was increased during co-culture, in both the proliferation and differentiation phases. We also analyzed the myoblasts migration ability and observed that myoblast migration is decreased during co-culture. The decrease in migration was greater in the actDC co-culture than the iDC. Finally, there was a greater release of cytokines and increased expression of HLA-ABC and HLA-DR in the co-culture with actDC. In conclusion, our data suggests that the use of co-culture changes the myoblast profile and indicates that DCs can contribute to IM evolution.

A miosite por corpos de inclusão (inclusion body myositis - IBM), na sua forma esporádica, é considerada a miopatia adquirida mais comum após os 50 anos de idade. Embora seja incluída no grupo das miopatias inflamatórias, estudos recentes mostram um processo particular de degeneração muscular caracterizado por deposição anormal de agregados de proteínas nas fibras musculares e funcionamento anormal dos principais sistemas de degradação proteica. O objetivo deste estudo foi o de avaliar os aspectos clínicos, histológicos e imunoistoquímicos de pacientes com IBM. Avaliamos 18 casos com diagnóstico de IBM de dois dos principais centros de doenças neuromusculares do Brasil (25 biópsias musculares). Na tentativa de diferenciar os casos de IBM das outras miopatias inflamatórias, determinamos o padrão de expressão tecidual da p-tau (p62), alfa-sinucleína e TDP-43. Também foi avaliada a função lisossomal através da reação da fosfatase ácida (marcação da atividade lisossomal global) e determinação da marcação para LC3B (marcador de autofagia). Foi observado que a IBM predominou no sexo masculino (61% dos casos), da cor branca, com início das manifestações clínicas ao redor dos 59 anos de idade e os sintomas mais frequentes foram fraqueza muscular, instabilidade postural com quedas da própria altura, disfagia e perda ponderal, podendo ainda apresentar dispneia. O diagnóstico demorou em média 7,4 anos após o início dos sintomas e frequentemente esteve associada às seguintes comorbidades: hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus tipo 2, osteopenia / osteoporose, dislipidemia e hiperuricemia / gota. O padrão de comprometimento muscular na IBM foi caracterizado por tetraparesia de predomínio proximal em membros inferiores e distal em membros superiores. Os valores séricos da creatinofosfoquinase em pelo menos uma das medições foram elevados em todos os pacientes, porém sem ultrapassar 10 vezes o limite superior da normalidade. O uso de imunossupressão não se mostrou eficaz nos pacientes com IBM. Os achados histológicos na IBM incluíram alterações distróficas variáveis com a presença de inflamação endomisial, assim como a ocorrência de vacúolos marginados, além da elevada frequência de alterações mitocondriais. Outros achados histológicos musculares característicos na IBM foram o aumento da atividade lisossomal (aumento global da marcação para fosfatase ácida), a presença de marcação positiva para beta-amilóide (marcação intra-vacuolar pelo vermelho-Congo), o aumento na degradação muscular (relacionada com ativação de LC3B, p-tau, e p62/SQSTM1) e a degeneração muscular (marcação para anti-phospo TDP-43 e para ?-sinucleína). Tais alterações apresentaram alta sensibilidade e especificidade. Sugerimos que a redução do critério de idade do início dos sintomas de mais de 45 anos para mais de 35 anos aumentaria a sensibilidade diagnóstica para os casos com IBM deste estudo de 83% para 100%. Com este estudo, foi possível caracterizar clínica e histológicamente pacientes com IBM em nosso meio, e fornecer indícios do benefício do uso de marcadores de degeneração e autofagia para o diagnóstico e para a determinação de vias ou sistemas celulares envolvidos na patogênese da doença / Sporadic inclusion body myositis (sIBM) is considered the most common acquired myopathy affecting adults aged over 50 years. Although included in the group of inflammatory myopathies, recent studies show a particular process of muscle degeneration characterized by abnormal deposit of protein aggregates in muscle fibers and abnormal operation of the main protein degradation systems. The aim of this study was to evaluate the clinical, histological and immunohistochemical patients with IBM. We evaluated 18 cases with IBM diagnostic of two of the main centers of neuromuscular diseases in Brazil (25 muscle biopsies). In an attempt to differentiate the IBM cases of other inflammatory myopathies, we determined the pattern of tissue expression of p-tau (p62), alfa-synuclein and TDP-43. Also evaluated the lysosomal function by acid phosphatase reaction (marking global lysosomal activity) and determining the markup for LC3B (autophagy marker). It was observed that IBM was predominant in males (61% of cases), white colored, with onset of clinical manifestations around 59 years old and the most common symptoms are muscle weakness, postural instability with high falls, dysphagia and weight loss, and may also present dyspnea. The diagnosis took an average of 7.4 years after the onset of symptoms and was often associated with the following comorbidities: hypertension, type 2 diabetes mellitus, osteopenia / osteoporosis, dyslipidemia and hyperuricemia / gout. The muscular damage pattern at IBM was characterized by tetraparesis predominantly proximal lower limbs and distal upper limbs. Serum creatine kinase levels in at least one of the measurements were elevated in all patients, but not exceeding 10 times normal. Immunosuppression was not effective in patients with IBM. The IBM histological findings included diversify dystrophic changes, endomysial inflammation, as well as the occurrence of rimmed vacuoles, in addition to high frequency of mitochondrial changes. Other characteristic muscle histological findings in IBM were increased lysosomal activity (overall increase in labeling for acid phosphatase), the presence of positive staining for beta-amyloid (intra-vacuolar by Congo red marking), increased muscle degradation (related to activation of LC3B, p-tau and p62 / SQSTM1) and muscle degeneration (marking for anti-phospo TDP-43 and ?-synuclein). Such changes have a high sensitivity and specificity. which makes these important complementary analyzes for accurate pathological diagnosis. We suggest that lowering the age of the onset of symptoms of greater than 45 years to older than 35 years would increase the diagnostic sensitivity for cases with IBM this study from 83% to 100%. With this study, it was possible to characterize clinically and histologically the patients with IBM in our centers, and provide evidence of the benefit of using degeneration and autophagy markers for diagnosis and for determining pathways or cellular systems involved in the pathogenesis of the disease

A miosite por corpos de inclusão (inclusion body myositis - IBM), na sua forma esporádica, é considerada a miopatia adquirida mais comum após os 50 anos de idade. Embora seja incluída no grupo das miopatias inflamatórias, estudos recentes mostram um processo particular de degeneração muscular caracterizado por deposição anormal de agregados de proteínas nas fibras musculares e funcionamento anormal dos principais sistemas de degradação proteica. O objetivo deste estudo foi o de avaliar os aspectos clínicos, histológicos e imunoistoquímicos de pacientes com IBM. Avaliamos 18 casos com diagnóstico de IBM de dois dos principais centros de doenças neuromusculares do Brasil (25 biópsias musculares). Na tentativa de diferenciar os casos de IBM das outras miopatias inflamatórias, determinamos o padrão de expressão tecidual da p-tau (p62), alfa-sinucleína e TDP-43. Também foi avaliada a função lisossomal através da reação da fosfatase ácida (marcação da atividade lisossomal global) e determinação da marcação para LC3B (marcador de autofagia). Foi observado que a IBM predominou no sexo masculino (61% dos casos), da cor branca, com início das manifestações clínicas ao redor dos 59 anos de idade e os sintomas mais frequentes foram fraqueza muscular, instabilidade postural com quedas da própria altura, disfagia e perda ponderal, podendo ainda apresentar dispneia. O diagnóstico demorou em média 7,4 anos após o início dos sintomas e frequentemente esteve associada às seguintes comorbidades: hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus tipo 2, osteopenia / osteoporose, dislipidemia e hiperuricemia / gota. O padrão de comprometimento muscular na IBM foi caracterizado por tetraparesia de predomínio proximal em membros inferiores e distal em membros superiores. Os valores séricos da creatinofosfoquinase em pelo menos uma das medições foram elevados em todos os pacientes, porém sem ultrapassar 10 vezes o limite superior da normalidade. O uso de imunossupressão não se mostrou eficaz nos pacientes com IBM. Os achados histológicos na IBM incluíram alterações distróficas variáveis com a presença de inflamação endomisial, assim como a ocorrência de vacúolos marginados, além da elevada frequência de alterações mitocondriais. Outros achados histológicos musculares característicos na IBM foram o aumento da atividade lisossomal (aumento global da marcação para fosfatase ácida), a presença de marcação positiva para beta-amilóide (marcação intra-vacuolar pelo vermelho-Congo), o aumento na degradação muscular (relacionada com ativação de LC3B, p-tau, e p62/SQSTM1) e a degeneração muscular (marcação para anti-phospo TDP-43 e para ?-sinucleína). Tais alterações apresentaram alta sensibilidade e especificidade. Sugerimos que a redução do critério de idade do início dos sintomas de mais de 45 anos para mais de 35 anos aumentaria a sensibilidade diagnóstica para os casos com IBM deste estudo de 83% para 100%. Com este estudo, foi possível caracterizar clínica e histológicamente pacientes com IBM em nosso meio, e fornecer indícios do benefício do uso de marcadores de degeneração e autofagia para o diagnóstico e para a determinação de vias ou sistemas celulares envolvidos na patogênese da doença / Sporadic inclusion body myositis (sIBM) is considered the most common acquired myopathy affecting adults aged over 50 years. Although included in the group of inflammatory myopathies, recent studies show a particular process of muscle degeneration characterized by abnormal deposit of protein aggregates in muscle fibers and abnormal operation of the main protein degradation systems. The aim of this study was to evaluate the clinical, histological and immunohistochemical patients with IBM. We evaluated 18 cases with IBM diagnostic of two of the main centers of neuromuscular diseases in Brazil (25 muscle biopsies). In an attempt to differentiate the IBM cases of other inflammatory myopathies, we determined the pattern of tissue expression of p-tau (p62), alfa-synuclein and TDP-43. Also evaluated the lysosomal function by acid phosphatase reaction (marking global lysosomal activity) and determining the markup for LC3B (autophagy marker). It was observed that IBM was predominant in males (61% of cases), white colored, with onset of clinical manifestations around 59 years old and the most common symptoms are muscle weakness, postural instability with high falls, dysphagia and weight loss, and may also present dyspnea. The diagnosis took an average of 7.4 years after the onset of symptoms and was often associated with the following comorbidities: hypertension, type 2 diabetes mellitus, osteopenia / osteoporosis, dyslipidemia and hyperuricemia / gout. The muscular damage pattern at IBM was characterized by tetraparesis predominantly proximal lower limbs and distal upper limbs. Serum creatine kinase levels in at least one of the measurements were elevated in all patients, but not exceeding 10 times normal. Immunosuppression was not effective in patients with IBM. The IBM histological findings included diversify dystrophic changes, endomysial inflammation, as well as the occurrence of rimmed vacuoles, in addition to high frequency of mitochondrial changes. Other characteristic muscle histological findings in IBM were increased lysosomal activity (overall increase in labeling for acid phosphatase), the presence of positive staining for beta-amyloid (intra-vacuolar by Congo red marking), increased muscle degradation (related to activation of LC3B, p-tau and p62 / SQSTM1) and muscle degeneration (marking for anti-phospo TDP-43 and ?-synuclein). Such changes have a high sensitivity and specificity. which makes these important complementary analyzes for accurate pathological diagnosis. We suggest that lowering the age of the onset of symptoms of greater than 45 years to older than 35 years would increase the diagnostic sensitivity for cases with IBM this study from 83% to 100%. With this study, it was possible to characterize clinically and histologically the patients with IBM in our centers, and provide evidence of the benefit of using degeneration and autophagy markers for diagnosis and for determining pathways or cellular systems involved in the pathogenesis of the disease