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Implicancias farmacéuticas de la conjugación de péptidos a nanopartículas de oro : efectos sobre la interacción con proteínas plasmáticas, la estabilidad, la toxicidad y la biodistribución

Guerrero Rivera, Simón Juan January 2013 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Ciencias Farmacéuticas / Al exponer diferentes Nanomateriales (NM) al plasma sanguíneo estos son reconocidos por biomoléculas, formándose una nano-bio interface denominada corona de proteínas (CP), en la que se observan interacciones dinámicas debido a que los ambientes biológicos son transitorios y no homogéneos. Dichas interacciones pueden ser claves en la modulación de la biodistribución, eliminación, de las respuestas inmunes y de la metabolización de los NM. En este contexto se propone que la naturaleza de los NM influirán sobre las interacciones inespecíficas con los componentes biológicos, esperándose a futuro poder regular dichas interacciones según los intereses farmacéuticos. En este proyecto de tesis se han obtenido conjugados de nanopartículas metálicas de oro (NpO) con péptidos como CLPFFD formando el conjugado NpO-CLPFFD, utilizados para destruir agregados proteicos amiloides (Aβ) involucrados en la Enfermedad de Alzheimer (EA) mediante la aplicación de radiación electromagnética. Dado que in vivo el conjugado NpO-CLPFFD llega en una muy baja proporción al cerebro respecto de la dosis inyectada (DI) se incorporó la secuencia peptídica THRPPMWSPVWP (THR), reconocida por el receptor de transferrina presente en la Barrera Hematoencefálica (BHE) con el fin de favorecer la transcitosis y el ingreso al sistema nervioso central. Es importante mencionar que una característica común de los conjugados es su gran acumulación en hígado y bazo, afectando así la llegada al cerebro. Esta elevada acumulación así como la penetración a través de la BHE esta relacionada con la formación de la CP que se forma al ponerse en contacto las nanopartículas con el plasma. Por lo cual, en este trabajo se realizó una caracterización de la CP con el fin de comprender su posible influencia sobre el comportamiento farmacocinético de las NpO. Es así que se evaluó como la CP formada sobre los conjugados NpO péptidos puede modificarse tras incorporar secuencias peptídicas como THRPPMWSPVWP, CALNN o Cpeg a CLPFFD En el desarrollo de esta tesis nanoesferas de oro (NE) se conjugaron con los péptidos CLPFFD, CALNNLPFFD, C-PEG-LPFFD, CALNN, C-PEG y THRPPMWSPVWPCLPFF (THRCLPFFD) y Nanovarillas de oro (NV) se conjugaron con CLPFFD. Los conjugados se caracterizaron por Espectroscopia UV-Vis, TEM, DLS, XPS y AAA y luego se emplearon para realizar estudios in vitro e in vivo. Posteriormente, los conjugados fueron incubados in vitro con plasma humano, evaluándose la estabilidad de los coloides por UV-Vis y el crecimiento del tamaño de las NpO por DLS debido a la presencia de la CP. Las proteínas de la CP fueron separadas e identificadas por geles SDS-Page, geles bidimensionales y por LC/MS/MS encontrando parámetros de comparación entre los conjugados. Las NpO conjugadas con los péptidos estudiados son especies coloidales estables en el tiempo y la presencia de la CP produce un aumento del diámetro hidrodinámico que conlleva a estabilización estérica. Las proteínas que conforman la CP tienen relación directa con el destino de las mismas en el organismo. Así proteínas detectadas estarían asociadas al reconocimiento por el sistema fagocitico mononuclear (SFM), la acumulación en hígado y bazo, como son las proteínas Ig, CO3, CO4, entre otras. Otras proteínas como la ApoE y la albúmina actuarían favoreciendo el pasaje a través de la BHE tal como sucede con NE-THRCLPFFD y en menor proporción con NE-CLPFFD. En base a lo encontrado se recubrieron NE-CLPFFD y NE-THRCLPFFD con ApoE, para luego realizar estudios in vivo, observándose que existe un aumento en la llegada al cerebro. Esto indica la importancia de la naturaleza de las proteínas de la CP sobre la distribución de las NpO así como también la posibilidad de poder modular la misma para un eventual tratamiento basado en NpO / By exposing different Nanomaterials (NM) with plasma, they are recognized by biomolecules conforming a nano-bio-interface called protein corona (CP), showing dynamics interactions because the biological environment is transient and not homogenous. These interactions could be the key in the modulation of the biodistribution, elimination, immune response and metabolization of NM. Suggesting that the features of NM has influence on non-specific interactions with biological components, It is expected in the future that they can such interactions be regulated according the pharmaceutical approach. In this thesis were obtained conjugates of gold nanoparticles (NpO) with peptides as CLPFFD (NpO-CLPFFD). This last sequence can recognize protein aggregates of β- amyloid involved in Alzheimer’s disease. Since in vivo the conjugates reach the brain in very low proportion, it was proposed to incorporate the peptide sequence THRPPMWSPVWP (THR), a sequence recognized by the transferrin receptors in endothelial cells of the blood brain barrier (BHE) promoting transcytosis of nanoparticles. However, we observed that all conjugates were accumulated in liver and spleen, interfering with arriving to brain. Therefore, the study for the interactions of NpO with the proteins conforming the CP helps us to understand and explain the pharmacokinetic behavior all them. In this work nanospheres (NE) were conjugated with the peptides CLPFFD, CALNNLPFFD, CpegLPFFD, CALNN, Cpeg and THRPPMWSPVWPCLPFFD (THRCLPFFD) and NpO as nanorods (NV) were conjugated with CLPFFD. Each conjugate obtained was characterized by UV-Vis spectroscopy, TEM, DLS, XPS and AAA. Then the conjugates were used to studies in vitro e in vivo. Next these conjugates were incubated in vitro with human plasma, to evaluate the stability by UV-Vis, the size effect by DLS and by TEM. Finally, the proteins of the CP were separated and identified by electrophoresis SDS-PAGE and 2D, and by LC-MS/MS to find comparative parameters between conjugates. The results obtained show that these conjugates are stable colloidal species in the time and the CP affects the diameter of the nanoparticles. A set of proteins found in the CP could determine the destiny of this NpO to will take in the organism. Thus proteins detected (as are the proteins Ig, CO3, CO4 and other) are associated with the recognition by the mononuclear phagocytic system (SFM) and their accumulation in liver and spleen. On the other proteins as ApoE or albumin that were detected in the CP of NE-THRCLPFFD and NE-CLPFFD favor the passage through the blood brain barrier. Finally, due to these results, to corroborate the approach from the ability to modify the CP, we incubated NE-CLPFFD and NE-THRCLPFFD with ApoE, then these conjugates were used in vivo, observing an enhancement in the penetration into the brain. This indicates the importance of CP on distribution of NpO as well as the possibility of modulating it to a possible drug treatment based on NpO addressed to the central nervous system / FONDECYT CONICYT
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Estudio de un antioxidante de origen natural en la prevención de efectos dañinos de los oligómeros del peptido beta-amiloide

Lobos Zambrano, Pedro Elizardo January 2016 (has links)
Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / "La Astaxantina protege a las neuronas de cultivo primario de hipocampo de los efectos dañinos de los oligómeros del peptido β-amiloide " Introducción: El incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno y la aparición de estrés oxidativo contribuyen en forma importante para el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los oligómeros del péptido β-amiloide (AβOs) son considerados como entidades moleculares centrales en la patogénesis de la EA. A concentraciones sub-letales, los AβOs producen señales aberrantes de Ca2+ y disminuyen la expresión de la isoforma 2 del receptor de ryanodina (RyR2), una proteína importante para los procesos de plasticidad y memoria asociados al hipocampo. En este trabajo, investigamos si el pre-tratamiento con el antioxidante astaxantina (ATX) protege a las neuronas de los efectos deletéreos inducidos por los AβOs, como el incremento en la producción de H2O2 mitocondrial, la activación de la isoforma c4 del factor nuclear de células T activadas (NFATc4), y la disminución del RNAm de RyR2 en un modelo de cultivo primario de células de hipocampo de rata. Metodología: Para estudiar los efectos de ATX sobre la viabilidad celular, se realizó una curva dosis respuesta con ATX y se determinó la viabilidad utilizando el kit Live/Dead®. Para determinar los niveles de producción de H2O2 mitocondrial y la activación de NFATc4, las neuronas se transfectadas con plasmidios codificantes para la proteína sensora de H2O2, para HyperMito o para la proteína de fusión entre NFATc4 y la proteína fluorescente verde (GFP), (NFATc4-eGFP), respectivamente. Los niveles de RNAm de RyR2 se determinaron por qPCR. Los cultivos primarios de células hipocampales se pre-trataron con 0,1 μM de ATX, 90 minutos antes de ser tratados con 0,5 μM AβOs. Resultados y Conclusiones: El tratamiento con ATX (≤10 μM) por ≤ 24 horas no evidenció cambios en la viabilidad del cultivo. La pre-incubación con ATX 0,1 μM previno el incremento en la producción de H2O2 mitocondrial inducido por los AβOs. El tratamiento con AβOs por 6 horas indujo la translocación nuclear de NFATc4-eGFP y la disminución de los niveles de expresión del RNAm de RyR2. La pre-incubación con ATX 0,1 μM previno ambos efectos. Estos resultados indican que la ATX protege a las neuronas del incremento en la producción de H2O2 mitocondrial, la activación de NFATc4, y la disminución del RNAm de RyR2, inducidos por los AβOs / "Astaxanthin protects primary hippocampal neurons against noxious effects of Aβ-Oligomers" Introduction: Increased reactive oxygen species (ROS) generation and the ensuing oxidative stress contribute to Alzheimer´s disease pathology. We reported previously that amyloid-β peptide oligomers (AβOs) produce aberrant Ca2+ signals at sub-lethal concentrations and decrease the expression of type-2 ryanodine receptors (RyR2), which are crucial for hippocampal synaptic plasticity and memory. Here, we investigated whether the antioxidant agent astaxanthin (ATX) protects neurons from AβOs-induced excessive mitochondrial ROS generation, NFATc4 activation and RyR2 RNAm down-regulation. Methodology: To study the effects of ATX on cell viability, we performed a dose response curve and quantified cells survival using the Live/Dead® kit. To determine mitochondrial H2O2 production or NFATc4 nuclear translocation, neurons were transfected with plasmids coding for HyperMito or NFATc4-eGFP, respectively, qPCR was employed to determine RyR2 RNAm expression levels. Primary hippocampal cultures were incubated with 0.1 μM ATX for 1.5 h prior to 0.5 μM AβOs addition. Results and Conclusion: We found that incubation with ATX (≤10 μM) for ≤ 24 h was non-toxic to neurons. Pre-incubation with 0.1 μM ATX also prevented the neuronal mitochondrial H2O2 generation induced within minutes of AβOs addition. Longer exposures to AβOs (6 h) promoted NFATc4-eGFP nuclear translocation and decreased RyR2 RNAm levels, evaluated by detection of the eGFP tagged fluorescent plasmid and qPCR, respectively. Pre-incubation with 0.1 μM ATX prevented both effects. These results indicate that ATX protects neurons from the noxious effects of AβOs on mitochondrial ROS production, NFATc4 activation and RyR2 gene expression down-regulation
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Estudio del Mecanismo de Internalización de los Péptidos de Penetración Celular TIRAP y TIRAPALA en Células HeLa

Flores Olave, Karen Alejandra January 2010 (has links)
Los Péptidos de Penetración Celular (o CPPs) poseen la habilidad de transportar moléculas a través de la membrana plasmática, sin pérdida de su integridad. Entre las secuencias más estudiadas se encuentran TAT, Antennapedia (Antp) y oligo-argininas, cuya característica en común es la presencia de grupos de aminoácidos catiónicos. La motivación del estudio de estos péptidos, es su potencial aplicación en el diseño de nuevos fármacos capaces de actuar localmente, ingresando directamente a la célula. El interés en la inmunología innata, radica en la posibilidad de bloquear la señalización rio abajo de receptores TLR, utilizando un segmento de la secuencia de TIRAP, el cual compite por la interacción de la proteína adaptadora TIR con TLR4. Esta secuencia posee ambas características deseables: grupos de aminoácidos catiónicos y efecto biológico. Para desarrollar futuras aplicaciones terapéuticas, es indispensable caracterizar el mecanismo de ingreso, ya que de éste depende la estabilidad y accesibilidad del potencial fármaco al blanco; es por esto que el objetivo principal de este trabajo de tesis fue caracterizar el mecanismo de internalización del péptido TIRAP en células HeLa. Se estudiaron las diferencias y similitudes estructurales que existen entre los péptidos TAT, TIRAP, y TIRAPALA. Se obtuvieron los modelos tridimensionales de las secuencias mencionadas realizando modelación comparativa, y se calculó el potencial electrostático sobre la superficie de los péptidos. Se encontró que los tres péptidos comparten grandes similitudes estructurales (estructura α-hélice ≥ 69%), sin embargo la gran diferencia radica en el campo de potencial electrostático que generan las cadenas laterales de los residuos, sugiriendo que este es el factor clave que le otorga la habilidad de traslocación a través de la membrana plasmática. Además, al estudiar la internalización de TIRAP y TIRAPALA en células HeLa, se encuentra evidencia experimental de la fuerte asociación de TIRAP a la membrana plasmática. Estudios sobre los posibles efectos tóxicos de TIRAP y TIRAPALA, arrojaron una disminución de la sobrevida celular producto de la internalización, por lo que se determina un límite concentración de incubación igual a 40 µM. Se concluye que la diferencia de potencial generada por las interacciones entre TIRAP y moléculas de la superficie celular, proveen la primera etapa del mecanismo de internalización, denominado transducción. La diferencia de potencial inducido sobre la superficie celular es la que finalmente provoca el ingreso de los péptidos al citoplasma. Además, es importante considerar los resultados de viabilidad obtenidos para posibles futuras aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas.
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Modelamiento matemático de la interacción entre péptidos señuelos penetrantes tipo TIR (BBP'S) y receptores tipo Toll TLR4

Patiño Salas, Camilo Fabián January 2012 (has links)
Ingeniero Civil en Biotecnología / Los receptores TLR4, participantes de la respuesta innata inmune, son capaces de reconocer patrones exógenos altamente conservados, además de otros ligandos de carácter endógeno. Dicho reconocimiento repercute en la formación del homodímero de TLR4, lo cual da inicio a una cadena de señalización celular que finaliza en la expresión de citoquinas pro-inflamatorias e interferones que inducen la síntesis de prostaglandinas, potentes mediadores pro-inflamatorios. Su producción sobre los niveles normales es un factor común en enfermedades autoinmunes tales como sepsis y artritis reumatoide cuyo tratamiento actual en base a drogas antiinflamatorias trae efectos secundarios perjudiciales en su uso prolongado. Estudios previos han identificado que los loops BB, secuencias ubicadas entre la hélice alpha-B y la lámina beta-B presentes tanto en el receptor TLR4 como en las proteínas adaptadoras MyD88, TRAM y MAL, son fundamentales en la formación de los complejos proteicos necesarios para la vía de señalización celular. El diseño de péptidos bloqueadores en base a estas secuencias ha sido presentado en la literatura como un mecanismo inocuo e innovador para el tratamiento de este tipo de patologías. En el presente trabajo se identifican los sitios de acoplamiento y el tipo de interacciones proteína-ligando generadas entre el homodímero de TLR4 y diferentes péptidos de bloqueo basados en los \loops BB mediante el uso de programas de acoplamiento y dinámica molecular, estableciendo paralelamente su energía libre a través de la metodología MM-PBSA para determinar su factibilidad termodinámica. Los resultados obtenidos señalan que los péptidos estudiados establecen interacciones de elevada permanencia con los sitios de unión del homodímero descritos para las proteínas MAL y TRAM, pudiendo ser calificados como pepMAL > pepTRAM > pepTLR4 > pepMyD88. Específicamente, si bien todos establecen contactos hidrofóbicos con los loops BB del homodímero con diferentes tiempos de permanencia, pepMAL y pepTRAM presentan un comportamiento más estable producto de la formación de puentes de hidrógeno, puentes salinos e interacciones catión-pi adicionales de carácter estable con otras regiones del homodímero, destacándose la participación del aminoácido E24 perteneciente a la hélice alpha-A de la cadena A. En lo que respecta a sus valores absolutos, la energía libre de unión de los complejos proteína-ligando presentan errores asociados principalmente a la extensión insuficiente de las simulaciones de dinámica molecular y la estimación de la variación de entropía y variación de energía libre de solvatación del sistema. Sin embargo, sus diferencias relativas son consistentes con el estudio de interacciones realizado, asignándole a dicha metodología una labor netamente de comparación de factibilidad termodinámica. Los péptidos de bloqueo lograron representar en gran medida los contactos reportados para las proteínas MAL y TRAM en estudios de acoplamiento y pruebas experimentales. Sin embargo, la jerarquización realizada en este trabajo presenta discrepancias con respecto a la evidencia experimental reportada en los estudios de Toshchakov y cols., lo cual es atribuible a tiempos insuficientes de simulación en la etapa de dinámica molecular y las diferencias de carácter puntual que existen en las secuencias que definen los péptidos. Según esto, este trabajo introduce nueva evidencia acerca del tipo de interacciones y regiones del homodímero involucradas en el efecto inhibitorio que ejercen estos péptidos. De esta manera, se establece como conclusión que la metodología aplicada logra establecer resultados confiables acerca del efecto inhibitorio de dichos péptidos de bloqueo, pudiendo proceder a etapas posteriores de búsqueda computacional de otros estados conformacionales y pruebas de carácter experimental. Específicamente, este trabajo sienta un precedente importante en la integración exitosa de varias herramientas de modelamiento molecular que puede ser aplicada en el estudio de otros sistemas bioquímicos, destacándose la influencia de otros dominios en las vías de señalización.
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Efecto del stress metabólico sobre la susceptibilidad celular frente a la formación de canales iónicos y efectos citotóxicos generados por los péptidos amiloides

Pacheco Jenkins, Claudia Alejandra January 2009 (has links)
Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades causadas por los péptidos amiloides son numerosas y heterogéneas, afectan a una gran cantidad de órganos y son de importancia tanto para el hombre como los animales. A pesar de que una característica común que engloba este tipo de enfermedades radica en la observación macroscópica extracelular de placas amiloides, numerosos estudios han demostrado que el principal mecanismo de daño celular corresponde a la actividad citotóxica de los péptidos amiloides solubles más que a los depósitos insolubles de placas amiloides extracelulares. En la actualidad, la teoría más aceptada que explica este mecanismo de toxicidad corresponde a la formación de canales permeables a cationes generados por los péptidos amiloides solubles en las membranas de células susceptibles, produciéndose elevaciones masivas de calcio intracelular ([Ca2+]i). Sin embargo, los factores que determinan la susceptibilidad celular individual para este proceso no han sido completamente identificados. Este trabajo se basó en la hipótesis de que el stress metabólico incrementa la susceptibilidad celular frente a la toxicidad de los péptidos amiloides al alterar la composición fosfolipídica de la membrana. Con esta finalidad, células neuronales y endocrinas fueron sometidas a un stress metabólico determinado por la disminución en las concentraciones de glucosa en su medio de cultivo o por la aplicación de un bloqueador de la glicólisis (ácido 3 bromopirúvico), siendo evaluados posteriormente los cambios en la [Ca2+]i y la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en astrocitos indicaron que aquellas células cultivadas en ausencia de glucosa son significativamente más susceptibles al efecto tóxico de los péptidos amiloides. Se observaron aumentos considerables en la [Ca2+]i pocos segundos después de la aplicación de amilina humana soluble, péptido de origen beta pancreático. No se observaron cambios en la [Ca2+]i en células cultivadas con glucosa. Estas observaciones sugieren la presencia de una interacción péptido-membrana. No se observaron disminuciones en la producción de ATP para células cultivadas en ausencia de glucosa. Los resultados obtenidos en las células beta pancreáticas demostraron que las células más susceptibles al efecto de los péptidos eran aquellas cultivadas en presencia del ácido 3 bromopirúvico, pero no aquellas cultivadas en ausencia de glucosa, determinado por un aumento en la mortalidad celular cuando las células en presencia del bloqueador metabólico fueron expuestas al péptido β amiloide, de origen neuronal. Se logró comprobar una disminución en la producción de ATP en células cultivadas en ausencia de glucosa versus aquellas cultivadas con altas concentraciones de glucosa. No se observó una asociación entre esta disminución en la producción de ATP con el aumento de la susceptibilidad a los péptidos amiloides. En conjunto, las observaciones permitieron concluir que el stress metabólico es efectivamente un importante factor que incrementa la susceptibilidad celular frente a los péptidos amiloides. No se observó que este efecto se debiera a una disminución en la producción de ATP, factor que induciría una falla en la actividad de las enzimas estabilizadoras de la membrana celular. Nosotros sugerimos que la activación de la cascada de la apoptosis explicaría de mejor manera los cambios en la composición de la membrana celular que la disminución de las concentraciones de ATP. Existen mecanismos celulares que regulan eficientemente la producción de energía y son muy sensibles frente a cambios en el estatus energético celular (sistema AMPK sensor de energía). Cuando el déficit de energía es muy prolongado y el sistema ya no es capaz de compensar las pérdidas, se activa la apoptosis, siendo unos de sus primeros efectos la alteración de la composición de la membrana celular. Esto sería en última instancia lo que incrementaría la susceptibilidad frente a los péptidos amiloides. Para futuras investigaciones, se sugiere profundizar en los mecanismos metabólicos específicos que afectarían la susceptibilidad celular frente a los péptidos amiloides, como también determinar los cambios específicos que se producen a nivel de las membranas celulares cuando las células se ven enfrentadas a desafíos metabólicos.
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Identificación de formas moleculares de MMP-9 en condiciones desnaturalizantes/reductoras, en saliva parotídea de pacientes afectados por parotiditis crónica recurrente infantil

Toloza Cerón, Nadia Cristel January 2011 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una enfermedad de etiología desconocida, que afecta a niños y adolescentes, caracterizándose por un aumento de volumen y sensibilidad, uni o bilateral de las glándulas parótidas, asociada generalmente a una sialectasia no obstructiva, sin signos de infección aguda. Usualmente se acompaña de fiebre leve y malestar general, lo que compromete la calidad de vida del paciente, quienes son tratados por distintos especialistas sintomáticamente; ya que sin causa aparente tiende a remitir. En este estudio, se propuso analizar saliva parotídea de 33 pacientes entre 4 y 14 años, con presentación clínica uni o bilateral de PCRI, en periodo de latencia de la enfermedad. Se utilizó la técnica de inmuno-western-blot con anticuerpo anti-metaloproteasa-9 (anti-MMP-9), para identificar formas moleculares de MMP-9 tanto en glándulas afectadas y no afectadas clínicamente por PCRI, en condiciones desnaturalizantes y desnaturalizantes/reductoras. Se utilizó como agente reductor βmercaptoetanol para reducir las muestras salivales y dilucidar de esta forma la separación de formas acomplejadas de MMP-9. La muestra de saliva parotídea de pacientes con PCRI presentó un total de 11 bandas de distinto peso molecular (>250, 250, 141, 100, 75, 60, 50, 47, 37, 29 y 25 kDa). Las formas moleculares de >250, 250, 141, 100, 50 y 47 kDa, corresponden a complejos moleculares de MMP-9 que son susceptibles de ser disociados en condiciones desnaturalizantes/reductoras. En presencia del agente reductor, se produce un aumento de las formas de MMP-9 de tamaños moleculares correspondientes a 75, 60, 29 y 25 kDa. La saliva parotídea proveniente de glándulas afectadas clínicamente por PCRI, presenta mayoritariamente el complejo molecular de MMP-9 de 141 kDa, lo que sugiere que se encuentra involucrado en la patogénesis de la enfermedad. La saliva parotídea proveniente de glándulas no afectadas clínicamente por PCRI, también presenta formas de MMP-9 de distintos tamaños moleculares, lo que sugiere que están afectadas subclínicamente por la enfermedad.
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Identificación de formas moleculares de MMP-9 en saliva parotídea de pacientes afectados por parotiditis crónica recurrente infantil

Valverde Moreno, Gustavo January 2010 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado, mediante zimografía, la presencia de metaloproteasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. En este estudio se propuso analizar, mediante zimografía, la actividad gelatinasa en saliva parotídea de dichos pacientes e identificar, mediante inmuno-western-blot, las formas moleculares de metaloproteasa 9. En 34 pacientes con PCRI de 4 a 13 años de edad, se recolectó saliva parotídea bilateral, se midió concentración de proteínas mediante el método de Bramhall, para posteriormente determinar la actividad gelatinasa mediante zimografía. Se registró el compromiso clínico-sialográfico de ambas glándulas parótidas y se les correlacionó con la actividad enzimática de las gelatinasas en cuestión. Además se realizó inmuno-western-blot con anticuerpo antiMMP-9 y se comparó la frecuencia de las distintas formas moleculares de metaloproteasa 9 en saliva proveniente de parótidas clínicamente afectadas y clínicamente sanas. La saliva parotídea de pacientes con PCRI presentó actividad gelatinasa en ambas glándulas, independiente de si están o no afectadas clínicamente. Sólo se observó diferencia estadísticamente significativa en la actividad enzimática de la metaloproteasa de 141kDa, donde hubo una mayor actividad en glándulas clínicamente afectadas. La saliva de individuos con PCRI no presento un patrón uniforme de formas moleculares de MMP-9. La frecuencia de las formas moleculares de las MMP-9 analizadas en saliva parotídea de pacientes PCRI, no presentó diferencias estadísticamente significativas entre aquellas muestras tomadas de glándulas clínicamente sanas y clínicamente afectadas, salvo en las formas moleculares de 169kDa y 139kDa, que fueron más frecuentes en saliva proveniente de glándulas comprometidas clínicamente.
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Identificación de formas moleculares de MMP-2 en saliva parotídea de pacientes afectados por parotiditis crónica recurrente infantil

Surot Madrid, Romina Soledad January 2010 (has links)
Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado, mediante zimografía, la presencia de metaloproteasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. Mediante western-blot, se ha detectado con mayor frecuencia la presencia de MMP-9 en la saliva proveniente de glándulas afectadas clínicamente en relación a las no afectadas. No existen estudios que analicen la presencia de MMP-2 en PCRI, mediante anticuerpos. En este estudio se propuso analizar, la presencia de formas moleculares de MMP-2 con actividad gelatinasa en la saliva parotídea bilateral de pacientes con PCRI. En 36 pacientes con PCRI uni o bilateral, de 4 a 14 años de edad, se recolectó saliva parotídea bilateral, se cuantificó la concentración de proteínas mediante el método de Bramhall, se determinó la actividad gelatinasa mediante zimografía y la presencia de MMP-2 mediante Western blot. Se registró el compromiso clínico-sialográfico de ambas glándulas parótidas como: glándulas clínicamente afectadas y no afectadas. Se determinó la frecuencia de MMP-2 salival con actividad gelatinolítica, en relación al compromiso clínico de la glándula. En la totalidad de los pacientes se detectaron 5 bandas con actividad gelatinasa y 17 formas moleculares de MMP-2, no encontrándose patrones de bandeo para estas moléculas en la enfermedad. Las formas moleculares de MMP2 de >250 kDa y 62 kDa, presentaron actividad gelatinasa. No hubo diferencias en la frecuencia de estas formas de MMP-2, tanto en la saliva parotídea proveniente de glándulas afectadas como en las no afectadas clínicamente por PCRI. Los resultados sugieren que tanto en la PCRI bilateral como en la unilateral, ambas glándulas parótidas se encuentran comprometidas en la enfermedad, aunque algunas glándulas no se vean afectadas por el aumento de volumen clínico.
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Participación de kisspeptina en la función ovárica y sus cambios durante la activación del sistema nervioso simpático inducida por el estrés por frío en la rata

Ricu Moya, Manuel Alejandro 01 1900 (has links)
Doctor en Farmacología / Kisspeptina es un péptido de 145 aa. el cual juega un rol clave en la secreción de GnRH, participando en conjunto con las catecolaminas en la regulación de la ovulación a nivel hipotalámico. La mayoría de las neuronas kisspeptinérgicas en el núcleo paraventricular del hipotálamo coexpresan mRNA para tirosina hidroxilasa (TH), lo que sugiere una estrecha relación catecolaminérgica-kisspeptinérgica. El hecho que kisspeptina se exprese en el bulbo raquídeo y en las astas dorsales de la medula espinal, sugiere la existencia de un mecanismo de comunicación hacia y desde los órganos periféricos en el cual participe la kisspeptina. A nivel periférico, se ha descrito que kisspeptina y su receptor es sintetizado en células del ovario (siendo las células de la teca una de las que la expresa) y que aumenta su expresión antes de la ovulación, sin establecer aún la función de kisspeptina intraovárica. Estos antecedentes, siguieren que podría existir un control kisspeptinérgico neuronal que llega al ovario a través del sistema simpático (kisspeptina extraovárica) y por otra parte la kisspeptina intraovárica podría estar bajo control simpático, la cual podría ser importante en la regulación de la función ovárica. Con estos antecedentes, se postuló la hipótesis que: “Kisspeptina se expresa en el eje ganglio celíaco-ovario y es activado por el sistema simpático. En el ovario kisspeptina activa la esteroidogénesis y regula la función ovárica tanto en la pubertad como durante la etapa adulta”. Para responder esta hipótesis: se caracterizó la expresión de kisspeptina y su receptor en ganglio celíaco y ovario. Se estudiaron los cambios durante el desarrollo puberal, sobre la apertura vaginal, la ciclicidad estral y la secreción hormonal. Se determinaron los efectos de la estimulación adrenérgica sobre la expresión de kisspeptina en el ovario in vitro y por el estrés por frío crónico de 4 y 8 semanas de duración in vivo. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que: 1.- Kisspeptina se sintetiza en ganglio celíaco y en el ovario, el cual fue determinado por PCR en tiempo real y EIA. Además, se colocaliza con neuronas TH positivas como muestran las inmunohistofluorescencia. Más importante aún es que kisspeptina aumenta en el eje ganglio celiaco-ovario al inicio de la pubertad, participando en la regulación del desarrollo folicular y la ciclicidad estral en ratas adultas. Esto fue confirmado al bloquear la acción de kisspeptina (antagonista p234), en el cual se retrasó la apertura vaginal, sugiriendo que kisspeptina podría jugar un rol protector de la ovulación. 2.- Kisspeptina se expresa tanto en células de la granulosa y de la teca en ovarios de rata. La inmunodetección mostró reactividad positiva desde folículos primarios hasta preovulatorios. 3.- Kisspeptina es regulado por el sistema simpático ya que la activación in vitro de receptores β-adrenérgica aumenta la expresión de la kisspeptina ovárica. Es así como una sobre activación del sistema simpático (eje hipotálamo-ganglio-ovario) mediante un estrés agudo (64 horas a 4°C) o crónico (3 hrs/día a 4°C durante 5 días a la semana por 4 and 8 semanas) altera el sistema kisspeptinérgico periférico (eje GC-O). 4.- Con respecto a la función ovárica, la administración in-vivo de kisspeptina (bomba miniosmótica Alzet) mostró que posee un efecto esteroidogénico, aumentando la concentración plasmática de testosterona y progesterona. Además, favorece la mantención de los cuerpos lúteos, posiblemente inhibiendo la luteólisis. Esto determinado al administrar directamente en el ovario kisspeptina a través de un minibomba osmótica. Por otro lado el bloqueo de la acción de kisspeptina por el antagonista p234 no mostró efectos significativos en la función reproductiva. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han mostrado que kisspeptina es sintetizada en ganglio celíaco (kisspeptina extraovárica), siendo parte de una vía neuronal (eje H-GC-O) que podría contribuir en la regulación de la función ovárica. Por otra parte, la kisspeptina intraovárica presente en todos los folículos en desarrollo estaría participando en el proceso ovulatorio. Los resultados siguieren que participa en el proceso de ovulación, teniendo una función esteroidogénica y protectora de este proceso. / Kisspeptin, is a peptide of 145 aa that has been described as key components in the GnRH secretion playing a complementary role with catecholamines. Studies have shown that most of the kisspeptin neurons in the paraventricular nucleus coexpress the mRNA for tyrosine hydroxylase (TH), suggesting a close kisspeptin-catecholamine relationship. Moreover, kisspeptin is present in other regions in the central nervous system, as the medulla oblongata and the dorsal horn in the bone marrow, suggesting that kisspeptin could be involved in both afferent and efferent pathway. At peripheral level, it has been described that kisspeptin and its receptor GPR54 is expressed in the ovary (especially at the theca cells of the ovarian follicle), and its expression increase before the ovulation without known function in the ovulatory process. Available data suggest that it could exist a neuronal kisspeptinergic network that arrive to the ovary through the sympathetic nervous system (extraovarian kisspeptin) and on the other hand, an intraovarian kisspeptin system without known if they could be controlled by the sympathetic nervous system, and if this control could be important for the ovarian function. Thus, we postulated that: “Kisspeptin is expressed in the celiac ganglion-ovary axis and it is activated by the sympathetic system. In the ovary, kisspeptin activate the steroidogenesis and regulates the ovary function, both during the pubertal and the adult age”. To answer this hypothesis the kisspeptin and GPR54 expression was characterized in the celiac ganglion and the ovary. The changes through the pubertal development, vaginal opening and hormonal secretion, were studied, and the adrenergic stimulation effects over the kisspeptin expression in the ovary in-vitro and the 4 and 8 week of chronic cold stress in-vivo was determined. The results presented in this thesis were the following: 1.- RT-PCR and EIA determinations showed that kisspeptin is synthetized in the celiac ganglion and the ovary. Furthermore, dual labeled immunofluorescence showed that kisspeptin is probably co-expressed within TH neurons. More important the kisspeptin along the celiac ganglion-ovary axis, increased with the puberty start, and thus, it could participate in the regulation of the follicular development and estrous ciclycity in adults rats. This suggestion was confirmed by blocking the in vivo kisspeptin action with the kisspeptin antagonist, p234, resulting in a delay in the vaginal opening, suggesting that kisspeptin could play a protector role in the ovulation process. 2.- Kisspeptin is expressed in both granulosa and theca cells. The immunodetection shows that kisspeptin is present through primary to preovulatory follicles. 3.- Kisspeptin is regulated by the sympathetic system because the in-vitro incubation of the ovaries with isoproterenol, a β-adrenergic agonist, increased the kisspeptin expression and the presence of the B-blocker propranolol eliminated the action of isoproterenol. Therefore, if this neuronal pathway is activated in the presence of a sympathetic stressor like acute (64 hour at 4°C) or chronic stress (3 hrs/day at 4°C during 5 days a week for 4 and 8 weeks) alter the peripheral kisspeptinergic system. 4.- Respect to ovarian function, in-vivo model (Alzet miniosmotic pumps to deliver Kisspeptin), show the capacity of kisspeptin to stimulate the steroidogenesis, increasing the testosterone and progesterone plasma concentration. The increased levels of plasma progesterone could favor the corpus luteum maintenance, possibly due to the decrease in the luteolysis process. Moreover, the kisspeptin antagonist administration (p234) don´t show significant effects in the reproductive function. In conclusion, in this thesis, the results have shown the existence of an extraovarian (neuronal) pathway (H-GC-O axis) that could contribute to the ovarian function regulation, and a intraovarian kisspeptin system (present in all follicles in development), that could participates in the ovulatory process, stimulating the steroidogenesis and hence regulating the ovulation. / Fondecyt
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Obtención de péptidos bioactivos de Lupinus mutabilis ("tarwi") mediante proteasas de Bacillus sp.

Borja Lozano, Jackelyn Elena January 2014 (has links)
Con el objetivo de obtener péptidos bioactivos de Lupinus mutabilis (“tarwi”), se extrajo las proteínas hidrosolubles y se concentraron por precipitación isoeléctrica. Las proteínas fueron hidrolizadas con las enzimas alcalasa y el crudo enzimático obtenido de Bacillus sp. a pH 8 y 50 °C a 30, 60 y 90 min. Los hidrolizados H30EA, H60EA, H90EA y H30CE, H60CE, H90CE obtenidos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE). Después, se determinó la actividad antioxidante de los hidrolizados proteicos mediante el método del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH). Los hidrolizados proteicos H90EA y H90CE presentaron mayor actividad antioxidante de 10,09 y 5,58 %, y un CI50 de 41,38 y 59,80 µg / mL, respectivamente. Los hidrolizados proteicos de Lupinus mutabilis con el crudo enzimático de Bacillus sp. presentan menor actividad antioxidante comparado a los obtenidos por alcalasa. / Tesis

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