A informação relativa aos orientadores da tese foi retirada da página do SIFEUP / Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2009

Objetivo general: Analizar distintas condiciones de simulación de la digestión gastrointestinal <i>in vitro</i> de proteínas de amaranto y caracterizar las muestras obtenidas. Objetivos específicos: » Evaluar diferentes condiciones de digestión gastrointestinal simulada sobre un aislado proteico de amaranto, variando relaciones enzimas/sustrato y tiempos de reacción. » Analizar, junto con el grado de hidrólisis, la potencial actividad antioxidante de los digeridos obtenidos y seleccionar las condiciones óptimas de digestión. » Aplicar las condiciones seleccionadas sobre un hidrolizado proteico de amaranto obtenido por acción de la alcalasa. » Analizar la composición molecular de los digeridos.

Tesis para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo y al Grado de Magíster en Enología y Vitivinicultura / La astringencia es una sensación táctil provocada al consumir algunos alimentos como frutas o algunas bebidas, como el vino, asociados a la presencia de polifenoles en su composición. Estas moléculas pueden interactuar con las proteínas de la saliva para producir agregados insolubles. Como consecuencia de esto, la lubricación de la cavidad bucal se pierde generando una sensación que se percibe en la boca como de sequedad o arrugamiento. Un numero de diferentes factores pueden afectar aquellas interacciones, tales como la composición y contenido de polifenoles, el alcohol, polisacáridos, ácidos orgánicos, entre otros. Sin embargo, varios informes han señalado al pH como el factor principal que afecta esas interacciones. En el presente estudio se evaluó el efecto del pH en el rango en el que se encuentran los vinos (2.8-4.0) sobre la interacción entre las proteínas salivares y las proantocianidinas de semillas de Carménère, mediante ensayos de difusión y precipitación en membranas de celulosa. Ambos ensayos fueron relacionados con la percepción de astringencia determinada por un panel sensorial. Los ensayos se realizaron a los pH que normalmente se producen los vinos (2.8, 3.2, 3.6, 4.0), junto con un control a pH 7.0. Los resultados indican que cambios de pH dentro de ese rango podrían cambiar significativamente el modo de difusión y la solubilidad de las proteínas salivares, es decir, a pH más bajos existe una interacción mayor entre proantocianidinas y proteínas salivares, lo que llevaría a una mayor percepción de astringencia. / Astringency is a tactile sensation elicited by some foods, like fruits, and some drinks, like wine, associated to the presence of polyphenols in their composition. These molecules can interact with the salivary proteins to produce insoluble aggregates. As a consequence of this, lubrication of the oral cavity is lost and a sensation of dryness and wrinkling mouth feel is perceived. A number of different factors may affect those interactions, such as the composition and concentration of polyphenols, alcohol, polysaccharides and organic acids, among others. Several reports have pointed to pH as a main factor affecting those interactions. In the present study the effect of changes within a narrow range of wine pH (2.8-4.0) on the interactions between salivary proteins and proanthocyanidins of Carménère seeds was assessed by diffusion and precipitation assays on cellulose membranes. Both assays were contrasted against astringency perception as determined by a sensory panel. Trials were conducted at pH usually occurring in wines (2.8, 3.2, 3.6, 4.0), together with a control condition at pH 7.0. We observed that changes within that range of pH could change significantly the mode of diffusion and solubility of the salivary protein, that is, at lower pH there is a higher interaction between proanthocyanidin and salivary proteins, which would lead to a greater sensation of astringency.

Tesis presentada para optar al grado de Doctor en Bioquímica / En esta tesis de Doctorado se sintetizaron nanovarillas de oro (NvO) las cuales fueron estabilizadas con dos tipos de polietilenglicol y luego modificadas con dos péptidos: D1, que reconoce agregados tóxicos del péptido Aβ, involucrados en la Enfermedad de Alzheimer (EA), y con el péptido, Angiopep 2 (Ang2), que es utilizado como lanzadera de diversas moléculas al sistema nervioso central. Las NvO fueron caracterizadas por espectrofotometría de absorción molecular, dispersión dinámica de la luz (DLS), potencial zeta (pZ) y microscopía electrónica de trasmisión (TEM). El grado de funcionalización de las NvO con los péptidos se confirmó mediante análisis de aminoácidos. Se determinó que el nanoconjugado no es citotóxico y logra penetrar células endoteliales de cerebro, como también inhibir la agregación del péptido Aβ in vitro. In vivo, en el modelo amiloide C. elegans se observó que disminuyen la toxicidad de las especies agregadas del péptido Aβ y en el modelo murino de la enfermedad de Alzheimer APPswe/PSEN1dE9 se determinó que llegan al cerebro de manera dirigida, aumentando su proporción cerca de 4 veces con respecto al control de NvO-PEG. Esta tesis muestra un promisorio nanosistema basado en NvO con potenciales aplicaciones para el tratamiento de la EA, el cual no muestra efectos citotóxicos, inhibe la agregación, disminuye la toxicidad del péptido Aβ y tiene una mejorada llegada al cerebro / In this PhD thesis gold nanorods were synthetized and stabilized with two types of polyethylene glycol and then modified with two peptides: D1, which recognizes toxics aggregates of Aß peptide, involved in Alzheimer's Disease and the other, Angiopep 2, that is used as a shuttle of molecules to the central nervous system. The nanoconjugates were characterized by different techniques, absorption spectrophotometry, dynamic light scattering, zeta potential and transmission electron microscopy, among others. It was determined that the nanoconjugate is not cytotoxic and penetrates brain endothelial cells, and also diminish the aggregation of the Aβ peptide in vitro. In the disease model C. elegans was observed that decreases the toxicity of aggregated peptide Aβ species and in the mouse model of the Alzheimer’s Disease APPswe/PSEN1dE9 we determined that the nanoconjugate reach the brain in a targeted manner when we compared with the control group. This thesis shows a promising system based on gold nanorods for the treatment of Alzheimer’s Disease, which show no cytotoxic effects, inhibit the aggregation and toxicity of Aβ peptide and has an improved arrival to the brain / Conicyt; Fondecyt; Fondap / 31 de diciembre de 2017

Doctorado en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El estudio de péptidos como moléculas terapéuticas ha generado gran interés en la industria farmacéutica debido a sus características de alta especificidad y actividad biológica y baja toxicidad. Igualmente, la exploración de nuevos blancos terapéuticos al interior de la célula es bastante atractiva ya que, posibilita la modulación e intervención de procesos intracelulares. En este contexto, disponer de un sistema de expresión recombinante de péptidos en un huésped como Escherichia coli, permitirá potenciar el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos, especialmente en el estudio de péptidos terapéuticos con actividad biológica intracelular y que requieran unión a péptidos de penetración celular como transportador, ya que el tamaño del péptido a sintetizar podría no ser adecuado para su síntesis química en forma eficiente y sustentable. El trabajo realizado consiste en el diseño de un sistema de expresión bacteriana de péptidos potencialmente terapéuticos, con blanco intracelular y que utilicen al péptido de penetración celular Penetratin como transportador, que permita la producción de diversos péptidos con el fin de estudiar su potencial terapéutico. El sistema fue evaluado mediante la expresión de los péptidos p53pAnt y PNC27, los cuales han mostrado tener actividad biológica antitumoral in vitro. Se diseñó el vector pET31HT que permite la expresión de los péptidos fusionados a la proteína cetoesteroide isomerasa (KSI) en una forma tal que puedan ser posteriormente separados y obtenidos con su secuencia original mediante corte con Trombina. Utilizando técnicas de ingeniería genética se construyó el vector de expresión diseñado. Para la implementación del sistema, se clonó las secuencias nucleotídicas correspondientes a los péptidos p53pAnt y PNC27 en el vector pET31HT. Se logró la producción de los péptidos fusionados en células transformadas con las construcciones pET31HT-p53pAnt y pET31HT-PNC27. La expresión se obtuvo en forma de cuerpos de inclusión y se determinó que los niveles de expresión de proteína recombinante se mantienen constantes y alrededor del 20% del peso seco celular, para distintas condiciones de inducción. Los péptidos fusionados fueron purificados desde la fracción de proteína insoluble por cromatografía de afinidad en condiciones desnaturantes. Mediante una estrategia que incluye precipitación por dilución y solubilización de las muestras en un buffer específico, se logró la separación del péptido p53pAnt de la proteína KSI en un proceso de proteólisis altamente eficiente. Sin embargo, no se logró separar al péptido PNC27 desde la proteína de fusión probablemente debido a la rigidez impuesta por sus aminoácidos iniciales a la región de reconocimiento de la proteasa. El péptido p53pAnt fue purificado desde el producto de digestión, según la estrategia diseñada, obteniéndose un péptido altamente puro. Las características del sistema, en conjunto con el proceso de purificación desarrollado, permiten la síntesis biológica de péptidos con una productividad mayor a 30 mg/g de peso seco celular y con una pureza de al menos un 95%. Con esto, el sistema diseñado es apropiado para su uso en la producción de péptidos para investigación científica.

Objetivo: Al menos uno de los péptidos sintéticos muestra actividad inhibitoria para PknG Diseño: Esta investigación califica como un estudio in vitro, dado que los experimentos serán realizados bajo condiciones controladas fuera de un organismo vivo.

Inspirados en el concepto de investigación traslacional, nuestros proyectos de investigación están dirigidos al desarrollo de sistemas químicos desde el conocimiento básico hasta la aplicación. Los sistemas químicos pueden ser definidos como sistemas auto-ensamblados que son capaces de hacer algo interesante y útil. Considerando los sistemas anfifílicos, hay dos procesos básicos de ensamblado utilizados en su construcción. El primero, es el ensamblado espontáneo de moléculas que se conoce como autoensamblaje. Asimismo, hay procesos con requerimiento de energía que conducen a estructuras metaestables o en “equilibrio permanente”, es decir, de larga duración, que no son necesariamente las estructuras termodinámicamente más favorecidas o estados de equilibrio verdaderos. Este último tipo de proceso se denomina ensamblaje dirigido. Por lo tanto, la capacidad de diseñar y organizar bloques moleculares individuales de construcción, en arquitecturas bien definidas en el agua, sigue siendo un desafío. Inicialmente, utilizamos nuestra experiencia en química orgánica, coloidal e interfacial para desarrollar un sistema fotomodulador de membrana, de potencial utilidad debido tanto a su estructura química simple, como a las propiedades interfaciales y en solución del sistema solo, y en un entorno constituido por una biomembrana. A tal efecto, se presenta la síntesis y caracterización de cuatro anfifilos no iónicos, 3A, 3B, 4A y 4B, basados en un núcleo de azobenceno. A continuación, evaluamos su capacidad de fotoisomerización y su comportamiento como cristales líquidos termotrópicos. Sólo 4A, C12OazoE3OH, presentó utilidad como molécula funcional. En segundo lugar, se realizó la evaluación de 4A puro en la interfase por monocapas de Langmuir y microscopía de ángulo de Brewster. Por otra parte, se comprobó la fotomodulación y la capacidad de penetración de C12OazoE3OH en un modelo de membrana biológica (Lipoid s75TM), presentándose como un sistema de administración inteligente, lo cual representa un objetivo primordial a la hora de realizar investigación traslacional, en el ejercicio del control remoto adecuado para estudios biofísicos en células. En la biomembrana lipídica, el cambio geométrico E-Z de C12OazoE3OH, indujo cambios de fase que aumentan o disminuyen la fluidez y la temperatura de transición de la mezcla. El éxito de la capacidad de respuesta y la funcionalidad resultante son debidos al tamaño de la cabeza y al carácter no iónico que juega un papel esencial en el parámetro de empaquetamiento. Sorprendentemente, experimentos de monocapas de Gibbs demostraron que ambas isoformas de C12OazoE3OH penetraron la membrana lipídica, resultados promisorios para su utilización como sonda externa en sistemas reales. Las vesículas fotoconmutables utilizadas en la administración controlada de fármacos, conocida como “drug delivery”, emplean el ensamblaje dirigido de fosfolípidos y polímeros conteniendo grupos azobencenos unidos covalentemente, o mezclados con un cierto porcentaje de azobencenos, de forma no covalente. Nosotros proponemos la aplicación de un proceso de ensamblaje dirigido sencillo, mediante la utilización de un rotavapor, el cual consiste en la evaporación del disolvente y la formación de un cristal líquido, seguido de autoensamblaje inducido por agua. Este proceso resulta en la construcción de un sistema azovesicular puro o azoniosoma a base de C12OazoE3OH. Esta metodología es similar a la empleada en la producción de liposomas a partir de lípidos, sin embargo, desde nuestro conocimiento, es la primera vez que es utilizada con bloques de construcción π-conjugados puros con características anfifílicas, como lo son las moléculas anfifílicas constituidas por azobencenos. Los sistemas vesiculares obtenidos se evaluaron mediante microscopía óptica y de luz polarizada, espectroscopia UV-Vis, microscopía electrónica y dispersión dinámica de la luz. Además, la capacidad de delivery y las características de fotoisomerización del sistema se evaluaron por espectroscopia de fluorescencia usando la sonda calceína. Aunque se obtuvo un rendimiento de fotoconversión con un PSS de E: Z (36: 54), el cambio en la sección transversal promovido por la isomerización E-Z fue suficiente para liberar el 97% de calceína. Adicionalmente, se comprobó la interacción del colorante Rojo Nilo con las azovesículas E, evidenciándose después de la fotoisomerización E-Z, un desplazamiento de la emisión de fluorescencia hacia la zona azul del espectro de absorción, efecto similar al observado en las vesículas lipídicas. Estos hallazgos en el desarrollo de azoanfifilos no iónicos pueden abrir nuevas perspectivas en el área de estudio del control remoto de membranas y vesículas, materia de incesante innovación, con sus consecuencias en el desarrollo de sistemas citomiméticos fotomodulables y en la administración inteligente de fármacos. Finalmente, se informa la síntesis y caracterización de un sistema peptídico AcFFCNH2, llamado péptido A capaz de formar nanoestructuras promovidas inicialmente por el cambio en las condiciones del medio acuoso a pH 3.0 y 8.0. Además, se evaluó el rol del aditivo TCEP, conocido reductor de enlaces disulfuros, en el proceso de organización dirigida del péptido A, a ambos pH. En estas condiciones observamos que el péptido A, formas nanoestructuras tipo vesículas, las cuales sufren una transición vesícula-cinta-fibra en función del tiempo. Se pudo determinar en todos los casos a las 24 horas, la formación de manojos de fibras, las cuales fueron más robustas a pH 3.0 en condiciones oxidantes. Finalmente se modificó la organización de las fibras maduras obtenidas a pH 8.0, por el agregado de TCEP. En esta condición experimental se observó la ruptura inmediata de los manojos de fibras en nanoestructuras esféricas y tubos que se organizaron en anillos; finalmente el sistema evoluciono a la formación de nano- y micro vesículas. Puesto que la funcionalidad de estas arquitecturas está intrínsecamente ligada a su estructura jerárquica y sus morfologías, que a su vez son consecuencia de una compleja historia de auto-ensamblaje, nuestros resultados contribuyen a avanzar en el estudio de la elucidación de los mecanismos de autoagregación proteica. De esta forma y como fin último podríamos intervenir racionalmente en el diseño de nuevas drogas dirigidas a controlar la no deseada agregación proteica, asociada a diferentes patologías humanas incurables.

El mecanismo por el cual los sistemas biológicos responden a un estímulo externo es un problema fundamental de la biología moderna. En el caso particular de los factores de transcripción (FT) una señal extracelular conduce a la activación de la expresión de un gen determinado. La motivación de esta tesis surge de la enorme importancia de estas proteínas regulatorias en el funcionamiento celular por lo que es evidente la importancia de comprender las bases moleculares que rigen sus interacciones con el fin último de diseñar estrategias racionales para alterar de forma programable y selectiva la expresión de determinados genes. En este contexto y a través de la combinación de síntesis orgánica, química supramolecular y biosupramolecular en orden creciente de complejidad, es que nos proponemos obtener sistemas miméticos de FT que interaccionen de forma específica con sus ds ADN consenso in vitro. Como objetivo general de esta tesis, estamos interesados en avanzar en el entendimiento del proceso de reconocimiento molecular de sistemas sencillos en medio acuoso, para finalmente trasladar estos conocimientos en el diseño de miméticos de FT. Como objetivos específicos nos propusimos promover la formación de homodímeros no covalentes mediada por un ligando externo y su interacción con secuencias de ds ADN consenso. Pero también estamos interesados en dar los pasos iniciales hacia la heterodimerización de dos fragmentos proteicos a través de la complejación entre ciclodextrinas y azobencenos, así como ciclodextrina y adamantano. En el Capítulo 3, hemos investigado una estrategia de dimerización no covalente de homodímeros de miniproteínas del factor de transcripción GCN4 mediada por el agregado de un receptor alostérico y evaluado la interacción con diferentes ds ADN. Inicialmente, para este fin se sintetizó y caracterizo exhaustivamente un dímero fotomodulable de azo ß-ciclodextrina (4), el mismo se encuentra en dos estados fotoestacionarios, el primero estable termodinámicamente de cuya relación de isómeros E:Z es de 95:5 (azoCyD(E)) y un segundo obtenido luego de irradiar con luz ultravioleta en la una relación E:Z 60:40 (azoCyD(Z)). El dímero 4 fue usado con el fin promover la dimerización de dos monómeros de la región básica del GCN4 provistos de un grupo adamantano en el extremo C-terminal, llamados Ad26 y Ad30 ya que difieren solo en 4 a.a (Capitulo 5). Mientras el péptido Ad26 no presento unión a ninguna secuencia, en ausencia o presencia de 4; el péptido Ad30, es capaz de unir a los ADN consenso luego del agregado de azoCyD(E) a la concentración de 200 nM de monómero. Tanto los experimentos de retardo en gel como los de dicroísmo circulan muestran que el sistema Ad30-azoCyD(E)-Ad30 reconoce específicamente la secuencia consenso 2/2C (CRE, 5’-ATGAcgTCAT-3’), mientras que el sistema Ad30-azoCyD(Z)-Ad30 no es capaz de hacerlo. En el caso de Ad30, es posible establecer un reconocimiento secuencial al ds CRE, donde dímero azoCyD (4) en configuración E mejora la unión promoviendo la dimerización y aumentando así la afinidad del reconociendo. A pesar que estos resultados en cuanto a afinidad son moderados es el primer ejemplo de un mimético del GCN4 que forma un sistema tetra-componente en la interacción con su ds ADN consenso. En cuanto a la estrategia de heterodimerización no covalente, hipotetizamos que el grupo azobenceno podría ser usado como huésped en la complejación de la cavidad de la ciclodextrina y así aprovechar la diferencia de afinidad de ambos isómeros E y Z por la cavidad. Sin embargo como es necesario controlar no solo la organización de los FT en tiempo y espacio y de manera reversible; sino también con una elevada afinidad, es que primero trabajamos con sistemas modelos. Para ello, evaluamos la formación de complejos de α- y β- ciclodextrinas con derivados funcionalizados de forma diferente en las posiciones 4 y 4’ de azobencenos, 14, 15, 16, 17, 18, por RMN. Esta técnica nos permitió determinar no solo las constantes de afinidad sino también la geometría de los complejos por experimentos Off ROESY, como se describe en el Capítulo 4. Así determinamos, que el grupo –NH2COCH3 tiene una afinidad adecuada (Ka de 3000 M-1) por la cavidad de β-ciclodextrina, y una posible fotoisomerización eficiente en agua. Con esta información en el Capítulo 6 hemos sintetizado un nuevo mimético fotomodulable del GCN4 con un grupo azobenceno sustituido con un grupo –NH2COCH3, AZO26. Finalmente, y con motivo de extender la química de miméticos de Ft, hemos sintetizado en fase sólida dos fragmentos de la proteína Id1, que es inhibidor transcripcional del FT MyOD. Luego del corte de la resina y de una laboriosa purificación hemos obtenido dos fragmentos del Id1, H1 (extremo N-terminal) y H2 (extremo C-terminal) puros. Hemos intentado, acoplar a estos fragmentos diferentes moléculas como β-ciclodextrina, azobenceno o adamantano, pero solo hemos sido exitosos en la síntesis y aislamiento del péptido H2Ad, que es una miniproteína mutada de H2 en el extremo N-terminal con el grupo adamantano. Mientras que AZO26 es un candidato mejorado para formar heterodímeros con otro monómero del GCN4 con un grupo β-Ciclodextrina CyD26; todos, los fragmentos de la proteína Id1 podrían ser potenciales inhibidores de la proteína MyoD. Estas moléculas serán probadas en trabajos posteriores. Desde el punto de vista de la ciencia básica esperamos con esta tesis contribuir al avance en el desarrollo de estrategias de diseño, síntesis química y de reconociendo molecular con el objetivo final de obtener miniproteínas controlables a través de estímulos externos. / The mechanism by which biological systems respond to an external stimulus is a fundamental problem of modern biology. In the particular case of transcription factors (FT) an extracellular signal leads to the activation of the expression of a given gene. The motivation of this thesis arises from the enormous importance of these regulatory proteins in the cellular behavior so it is evident the importance of understanding the molecular basis governing their interactions with the ultimate goal of designing rational strategies to programmatically and selectively alter the expression of certain genes. In this context and through the combination of organic synthesis, supramolecular and biosupramolecular chemistry in increasing order of complexity, we propose to obtain mimetic systems of FTs that interact specifically with their ds DNA consensus in vitro. As a general objective of this thesis, we are interested to advance in the understanding of the process of molecular recognition of simple systems in aqueous medium, to finally transfer this knowledge in the design of FTs mimetics. As specific objectives, we aimed to promote the formation of non-covalent homodimers mediated by an external ligand and its interaction with ds DNA consensus sequences. But we are also interested in taking the initial steps towards the heterodimerization of two protein fragments through the complexation between cyclodextrins and azobenzenes, as well as cyclodextrin and adamantane. In Chapter 3, we investigated a non-covalent dimerization strategy of miniprotein homodimers of transcription factor-mediated GCN4 by the addition of an allosteric receptor and evaluated the interaction with different ds DNA. Initially, for this purpose a photomodulable dimer of azo ß-cyclodextrin (4) has been synthesized and characterized. It is found in two photostates, the first thermodynamically stable with an E: Z isomer ratio of 95: 5 (azoCyD (E)) and a second obtained after irradiating with ultraviolet light, E: Z ratio 60:40 (azoCyD (Z)). Dimer 4 was used to promote the dimerization of two monomers of the GCN4 base region bearing an adamantane group at the C-terminus, called Ad26 and Ad30, as they differ only in 4 a.a (Chapter 5). While the Ad26 peptide does not exhibit binding to any sequence, in the absence or presence of 4; the Ad30 peptide, is capable of binding consensus DNAs following the addition of azoCyD (E) to the concentration of 200 nM monomer. Both Emsa experiments and circular dichroism experiments show that the Ad30-azoCyD (E) -Ad30 system specifically recognizes the consensus sequence 2 / 2C (CRE, 5'-ATGAcgTCAT-3 '), while the Ad30- AzoCyD (Z) -Ad30 is not capable of doing so. In the case of Ad30, it is possible to establish a sequential recognition to the ds CRE, where dimer azoCyD (4) in E configuration improves the binding promoting dimerization and thus increasing the recognition affinity. Although the observed affinity is moderate, it is the first example of a GCN4 mimetic which forms a tetra-component system in the interaction with its ds DNA consensus. As for the non-covalent heterodimerization strategy, we hypothesized that the azobenzene group could be used as a host in the complexation of the cyclodextrin cavity and thus take advantage of the difference in affinity of both isomers E and Z through the cavity to promote a differential DNA binding. However, it is not only necessary to control the organization of the FT in time and space and in a reversible way; but the interaction must have a high affinity. For this porpoise, we first worked with model systems. For this, we evaluated the formation of α- and β-cyclodextrin complexes with differently functionalized derivatives at the 4 and / or 4 'positions of azobenzenes, 14,15,16,17,18 by NMR. This technique allowed us to determine not only the affinity constants but also the geometry of the complexes by Off-ROESY experiments, as described in Chapter 4. Thus, we determined that the -NH2COCH3 group has a suitable affinity (Ka of 3000 M -1) by the cavity of β-cyclodextrin, and it has possible efficient photoisomerization in water, too. With this information in Chapter 6, we have synthesized a new photomodulable mimetic of GCN4 with an azobenzene group substituted with an -NH2COCH3 group, AZO26. Finally, and in order to extend the chemistry of Ft mimetics, we have synthesized in solid phase two fragments of the Id1 protein, which is transcriptional inhibitor of FT MyOD. After cutting the resin and following laborious purification we obtained two fragments of the pure Id1, H1 (N-terminal) and H2 (C-terminal) fragments. We have attempted to couple to these fragments different molecules with potential use as β-cyclodextrin, azobenzene or adamantane, but we have only been successful in the synthesis and isolation of peptide H2Ad, which is a mutated miniprotein of H2 at the N-terminal end with the adamantane group. Whereas AZO26 is an improved candidate for forming heterodimers with another GCN4 monomer with a β-Cyclodextrin CyD26 group; all new fragments of the Id1 protein could be potential inhibitors of the MyoD FT. These molecules will be tested in later works. From the point of view of basic science with this thesis we hope to contribute to the advancement in the development of strategies of design, chemical synthesis and molecular recognition with the goal of obtaining miniproteins controllable through external stimuli.

El objetivo general de este trabajo fue generar conocimientos que sirvan de base para desarrollar ingredientes biológicamente activos derivados de proteínas de amaranto mediante hidrólisis con microorganismos proteolíticos. Se proponen estudiar dos actividades biológicas: actividad antitrombótica y actividad antimicrobiana.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Ciencias Farmacéuticas / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Para probar este concepto, se sintetizaron en fase sólida tres nuevos análogos del GLP-1, los cuales fueron caracterizados por cromatografía líquida y espectrometría de masas. Adicionalmente, a los péptidos se les evaluó su estructura secundaria por dicroísmo circular y su actividad insulinotrópica in vitro en la línea celular de páncreas Beta-TC-6. Posteriormente se prepararon y caracterizaron fisicoquímicamente los conjugados obtenidos; para ello se utilizaron técnicas de espectrofotometría UV-visible, microscopía electrónica de transmisión, potencial zeta y dispersión dinámica de la luz. Finalmente se evaluó la estabilidad de los conjugados, se estudió su permeabilidad intestinal, utilizando un sistema in vitro basado en un cocultivo de células de adenocarcinoma de colon humano y mucosecretoras (Caco-2/goblet), y además se determinó la actividad hipoglicemiante in vivo de uno de los péptidos y su respectivo conjugado a AuNP, después de una administración intraperitoneal en ratas. Los resultados obtenidos revelaron que los tres péptidos sintetizados: GLP-1(7- 37)-Lys(Acet), GLP-1(7-37)-Lys(Cys) y GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), tienen una conformación de tipo α hélice en disolución acuosa y presentan una actividad insulinotrópica similar a la de la incretina endógena GLP-1. Sin embargo, generan conjugados que difieren en estabilidad y capacidad de penetrar el epitelio intestinal, probablemente debido al tipo de interacción que generan con las AuNP. De esta forma, los conjugados de los péptidos que contienen cisteína (péptidos tiolados) resultaron ser más estables que el del péptido sin cisteína, frente al pH gástrico e intestinal, pues generan una interacción de tipo Au-S que le otorga una mayor estabilidad estérica al sistema coloidal. Por otra parte, el conjugado de AuNP al péptido GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) fue el que penetró en mayor medida la monocapa de células, encontrándose aproximadamente un 0.016 % de oro después de 4 h de incubación, mientras que con los otros conjugados el nivel de oro no superó el 0.008 %. Además los péptidos y sus conjugados a AuNP no presentaron toxicidad en los sistemas celulares empleados (Beta-TC-6 y Caco-2/goblet, respectivamente). Finalmente, de la evaluación de la actividad hipoglicemiante in vivo se obtuvo que la eficacia hipoglicémica para el análogo GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) y su conjugado a AuNP fue similar a la de la incretina endógena (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 % y 22.1 ± 8.26 %, respectivamente), revelando que tanto la modificación realizada en el extremo C- terminal de GLP-1, como la presencia de la AuNP, no afectan su bioactividad. De esta forma, el sistema de entrega desarrollado en esta Tesis demostró penetrar las células intestinales en diferentes grados, y disminuir los niveles de glicemia in vivo de una manera similar al péptido endógeno después de su administración intraperitoenal, revelando que este tipo de sistemas es capaz de atravesar barreras biológicas y que la conjugación al nanomaterial no afecta la actividad de la biomolécula, por lo que podría convertirse en una estrategia para la entrega de biomacromoléculas con aplicación en diabetes / Generally, the therapeutic potential of peptides and proteins is hampered by their physicochemical characteristics, which prevent their successful delivery. In this regard, GLP-1 is a peptide incretin that has great therapeutic usefulness due to their interesting action on glucose metabolism, so it is currently an excellent candidate option for the treatment of the type 2 Diabetes Mellitus. However, as a peptidic macromolecule, GLP- 1 has a poor permeability across the intestinal epithelium and is very susceptible to the enzymatic degradation. To overcome these drawbacks some efforts have been made to improve its therapeutic efficacy, such as development of metabolically stable analogs, but very few studies have been focused on the study of the delivery systems to prolong their action and improve its bioavailability. In this Thesis the study of a potential delivery system based on the use of gold nanoparticles (AuNP) for biomacromolecules, such as GLP-1, is presented. This system searches for to increase the permeability of peptides across the intestinal epithelium and enhance its bioavailability while retaining the biological activity of the biomolecules. Thus, a nanoscale delivery system was developed, wherein GLP-1 analogues were conjugated to the surface of AuNP. To probe this concept, three new analogs of GLP-1 on solid phase were synthesized; the peptides were characterized by liquid chromatography and mass spectrometry and additionally their secondary structure and in vitro insulinotropic activity, using Beta-TC-6 pancreatic cells, were evaluated. Subsequently, the conjugates were physicochemically characterized by UVvisible spectrophotometry, transmission electron microscopy, zeta potential and dynamic light scattering. Finally, the stability of the conjugates and their intestinal permeability, using a mucosecretory in vitro system based on human colon adenocarcinoma cells (Caco-2) and goblet cells were studied. Additionally, the in vivo hypoglycemic activity after intraperitoneal administration en rats of one of the peptides and its conjugate was also determinate. The results revealed that all three peptides synthesized: GLP-1(7-37)-Lys(Acet), GLP-1(7-37)-Lys(Cys) and GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), have an α helix conformation in solution, and equal insulinotropic activity than the endogenous incretin GLP-1. However, their conjugates differ in stability and ability to penetrate the intestinal epithelium, probably due to the difference in the interaction with the AuNP. In this way, the conjugates of the peptides containing cysteine (thiolated peptides) were more stable, to the gastric and intestinal pH, than the peptide without cysteine because generate an interaction of Au-S that gives a greater steric stability to the colloidal system. Moreover, the conjugate of GLP-1(7-37)-Lys (PegCys) to AuNP penetrated the cell monolayer in a greater extent than the others, being found about 0.016 % gold after 4 h of incubation, while with the other conjugated the gold level did not exceed 0.008 %. In addition, peptides and their conjugates to AuNP did not show toxicity at cell systems used (Beta-TC-6 and Caco-2/goblet, respectively). Finally, the evaluation of the in vivo hypoglycemic activity showed that the hypoglycemic efficacy for the GLP-1(7-37)-Lys (PegCys) analogue and its AuNP conjugate were similar to the endogenous incretin (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 % and 22.1 ± 8.26 %, respectively), revealing that the modification in the C-terminal of the GLP-1 molecule and the presence of the AuNP, do not affect its bioactivity. Thereby, the delivery system developed in this Thesis showed penetrate the intestinal cells in different degrees, and decrease blood glucose levels in vivo in a similar way to the endogenous peptide after intraperitoenal administration, revealing that this type of system is capable of cross biological barriers and that the conjugation to the nanomaterial does not affect the activity of the biomolecule, so it could become a strategy for the delivery of biomacromolecules with application in diabetes