The present study focuses on the initiation phase of protein synthesis and the generation of aptamers as candidates to reduce the physiological function of the isolated N terminal domain (NTD) of initiation factor 3 (IF-3). Through molecular biology techniques, the correct cloning of the gene coding for IF-3 NTD in plasmid pET24a was verified. This plasmid was used to transform the bacterial model organism Escherichia coli BL21 and thus the massive production of the IF-3 NTD was assessed. Using affinity chromatography techniques, the NTD of the IF-3 was isolated, obtaining high purity degrees and production yields. The purified NTD was used to generate aptamers with the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Five molecules with binding potential to the NTD of IF-3 were found. The present investigation provides the bases to study the interaction of the NTD of IF-3 with the aptamers in cell-free system and thus to evaluate their inhibitory potential. It is expected that these molecules behave as potential new drugs, and therefore they might contribute to cope for the need of new antibiotics. / Tesis

Obtiene fracciones peptídicas con actividad antioxidante y quelante de metales a partir de las semillas de Erythrina edulis utilizando un modelo de digestión gastrointestinal In Vitro. Las fracciones proteicas se obtuvieron a partir de la harina de las semillas de pajuro. La hidrólisis proteica de cada fracción se realizó utilizando el modelo de digestión gastrointestinal utilizando las enzimas digestivas pepsina 0.7 FIP (HP) y pancreatina 350 FIP- U/g (HPP) a una proporción enzima-sustrato 1/50 p/p adicionalmente se utilizó la enzima alcalasa 2.4 U/g proteína (HPPA). La capacidad antioxidante se determinó mediante el método de neutralización de radicales de oxígeno (ORAC-FL). Además, se determinó la actividad quelante de hierro y cobre. Se obtuvieron cuatro fracciones proteicas, siendo en función de abundancia las siguientes: albúmina, glutelina, globulina y prolamina, cada una de las fracciones mostró un perfil electroforético diferente. Los hidrolizados obtenidos después de la actividad de las tres enzimas sobre las albúminas y globulinas fueron las que presentaron una mayor actividad antioxidante, con valores de ORAC-FL de 4957.2 ± 35.1 y 5177.2 ± 23.0 µmol de equivalente de Trólox (ET)/mg de proteína, respectivamente. Además ambos hidrolizados mostraron más del 50% de capacidad quelante de hierro a la concentración de 360 µg/mL. En el caso de la actividad quelante de cobre, los hidrolizados obtenidos con las tres fracciones proteicas mostraron porcentajes superiores al 70% de quelación a 180 µg/mL. Concluye que las albúminas y globulinas del pajuro presentan un importante potencial como fuente de péptidos antioxidantes y quelante de metales después del modelo de digestión gastrointestinal con enzimas digestivas y alcalasa. / Tesis

Esta memoria de título se inscribe en el marco del proyecto del desarrollo de la estrategia terapéutica basada en conjugados entre péptidos y nanopartículas metálicas como herramientas de diagnóstico y tratamiento para la enfermedad de Alzheimer. La estructura que adoptan estos péptidos una vez anclados a las nanopartículas es importante para el reconocimiento molecular de agregados tóxicos de la proteína amiloide beta involucrados en la enfermedad de Alzheimer. En el presente trabajo se realizaron análisis mediante diversas técnicas altamente especializadas como espectroscopia de fuerza a través de microscopía de fuerza atómica y dispersión Raman aumentada por superficie, para arrojar luces sobre la estructura del péptido adsorbido a la superficie de la nanopartícula de oro. En este sentido, uno de los detalles más significativos es el residuo de ácido aspártico; por esto, se emplearon péptidos isómeros: CLPFFD, CDLPFF y CLPDFF, estudiando el efecto de la secuencia en la carga y dispersión Raman. Se obtuvieron resultados consistentes con los reportados en estudios previos de nuestro grupo, observando mayor carga en el péptido CLPFFD, semejanteen el péptido CLPDFF, y menor en el péptido CDLPFF. Asimismo, se observó mayor aumento de la señal Raman en CDLPFF e CLPDFF. Esto hace probable que el péptido CLPFFD se disponga con su esqueleto peptídico de forma vertical con respecto a la superficie de la nanopartícula, en tanto que los isómeros se disponen en ángulos más cerrados. Estos resultados permiten explicar la mayor interacción del conjugado CLPFFD con agregados tóxicos de la proteína amiloide beta.

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Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología / Una de las propiedades de los taninos es su capacidad de precipitar proteínas, fenómeno que ha sido asociado a su capacidad de producir astringencia. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la interacción de dos taninos enológicos comerciales de distinta naturaleza (hidrolizable y condensado) con proteínas de saliva humana. Se caracterizaron 10 taninos enológicos comerciales (TECs) mediante análisis espectrofotométricos de fenoles totales, taninos totales e índice de gelatina. A continuación se seleccionó un tanino condensado y otro hidrolizable, con los cuales se realizaron los ensayos de interacción tanino-proteínas de la saliva humana. Estos correspondieron a ensayos de difusión y precipitación sobre láminas de celulosa, empleando saliva humana como fuente de proteínas. Los ensayos consistieron básicamente en determinar la magnitud de la interacción entre taninos y proteínas tras mezclar concentraciones crecientes de cada uno de los dos TECs con una cantidad fija de saliva. Alícuotas de la mezcla (antes y después de centrifugación de la misma) fueron depositadas sobre láminas de celulosa, secadas, fijadas y teñidas para la detección de la distribución del material proteico. Las concentraciones de fenoles totales observadas en los taninos seleccionados promediaron 437 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/g TEC, valores ampliamente superiores a lo encontrado por diversos autores en extractos de semillas y hollejos (10-30 mg EAG/g y 5-15 mg EAG/g, respectivamente). El contenido de taninos totales en los TECs seleccionados promedió 18,2 mg equivalentes de cianidina (EC) /g TEC, valor que se encuentra dentro del rango de concentraciones de taninos totales observado por otros autores en extractos de semillas y hollejos (10-60 y 5-20 mg EC/g, respectivamente). No se observó relación entre el contenido de fenoles totales y el de taninos totales, pues un alto contenido de taninos totales no implicó necesariamente un alto contenido de fenoles totales y viceversa. En los ensayos de interacción tanino-proteína correspondientes a los ensayos de difusión y precipitación sobre láminas de celulosa, se observaron diferencias notorias en la difusión y precipitación entre ambos tipos de TECs. Además ninguno de los dos TECs logro provocar el 100% de la precipitación de las proteínas salivales, formando además complejos solubles entre los taninos y las proteínas salivales. A partir de los resultados de este estudio, se puede concluir que dos TECs distintos (hidrolizables y condensados) interactúan diferencialmente con las proteínas salivales y que la metodología aplicada permite la evaluación independiente, expedita y objetiva de las interacciones entre proteínas salivales y extractos de TECs. / One of the main properties of tannins is its ability to precipitate proteins, a phenomenon that has been associated with its capacity to produce astringency. The aim of this study was to evaluate the interaction of two different commercial enological tannins (hydrolysable and condensed) with human salivary proteins. 10 commercial enological tannins (TECs) were characterized by total phenols, total tannins and gelatin index. Afterwards, one condensed and one hydrolysable tannin were selected, with which the interaction tannin-human salivary protein tests were conducted. These tests were the diffusion and precipitation assays over cellulose sheets using human saliva as proteins source. These assays determined the magnitude of the interaction between tannins and proteins after a mix of an increasing concentration of each one of the two TECs with a constant quantity of saliva. Aliquots of the mix (before and after centrifugation) were spotted onto cellulose membranes, dried, fixed and stained for the detection of the protein material distribution. The average total phenol concentration observed in the tannins was 437 mg EAG/g TEC, exceeding the values found in seeds and skins by several authors (10-30 mg EAG/g and 5-15 mg EAG/g, respectively). The total tannin concentration averaged 18,2 mg EC/g TEC, value within the range of total tannin concentration found by other authors in seeds and skins extracts (10-60 and 5-20 mg EC/g, respectively). A relation between the total phenol and the total tannin content was not observed, because a high total tannin content did not necessarily imply a high content of total phenols and vice versa. In the tests of tannin-protein interaction corresponding to the assays of diffusion and precipitation on sheets of cellulose, there were marked differences in the diffusion and precipitation between the two types of TECs. Furthermore neither induces a 100% of the precipitation of salivary proteins; however they did form soluble complexes between tannins and salivary proteins. From the results of this study, it is concluded that two different TECs (hydrolyzable and condensed) interact differentially with salivary proteins and that the methodology allows an expedite and objective independent evaluation of the interactions between salivary proteins and extracts from TECs.

Memoria para optar al titulo de Bioquímico / La nanotecnología, en la biomedicina, trabaja desarrollando herramientas, tanto de diagnóstico, como estrategias terapéuticas, menos invasivas y más eficientes que las actualmente en uso. Entre estas herramientas, se encuentran el uso de las nanopartículas metálicas (NPM), las cuales, siendo tan pequeñas tienen la propiedad de poder difundir a través de barreras biológicas, siendo capaces de llegar al sitio de interés terapéutico. Las nanopartículas de oro (AuNP) poseen potenciales aplicaciones en el campo de la biomedicina, siendo una de ellas el diagnóstico y la terapia de la enfermedad de Alzheimer (EA). Recientemente, en nuestro laboratorio se demostró que es posible producir la desagregación de agregados tóxicos (AT) de la proteína β-amiloide (Aβ) involucrada en la EA mediante el uso de AuNP y la aplicación de campos magnéticos oscilantes. Para unir las AuNP a los AT de Aβ, las mismas se conjugaron al péptido CLPFFD-NH2, que presenta afinidad por Aβ, obteniendo los conjugados AuNP-CLPFFD-NH2 (AuNP-Pep) . En este trabajo de memoria se evaluó su neurotoxicidad. Para ello se realizaron ensayos de viabilidad, frente a cultivos de neuronas hipocampales extraídas de embriones de rata (E18) y Neuroblastoma SH-SY5Y. Para el caso de las AuNP se encontró una leve disminución de la viabilidad respecto de los controles. Contrariamente, para AuNP-Pep, existe un aumento de la viabilidad celular que implica neuroprotección. Asimismo se evaluaron los efectos de los tratamientos en los mecanismos de muerte celular. Por otra parte, se determinaron los niveles de ROS producidos por las AuNP y las AuNP-Pep observándose que estas últimas presentan a tiempos tempranos de incubación un aumento de estas especies. También se estudió la producción de proteínas, en cultivos de neuronas, y se encontró un aumento en ciertas proteínas que, darían cuenta, de un efecto de “preacondicionamiento”, que contribuye a activar mecanismos de defensa que convierten a las neuronas en más resistentes / The nanotecnology, in biomedicine, works in pursuit to develop diagnosis as therapeutic tools, with strategies less invasive and more efficient than nowadays in use. We can find the use of the metallic nanoparticles (MNP), which, being so small have the property of being able to spread across biological barriers, being capable of coming to the place of therapeutic interest. The gold nanoparticles (AuNP) possess potential applications in the field of biomedicine, being one of them, the diagnosis and the therapy of Alzheimer's disease (AD). Recently, in our laboratory there was demonstrated that it is possible to produce the disaggregation of toxic attachés (TA) of the protein β-amyloid (Aβ) involved in the AD using AuNP and the application of magnetic oscillating fields. To join the AuNP to this TA of Aβ, the same ones were conjugated to the peptide CLPFFD-NH2, which presents affinity for Aβ. Obtaining the conjugate AuNP-CLPFFD-NH2 (AuNP-Pep). In this report, there neurotoxicity was evaluated. For this assays of viability were realized, cultures of hippocampal neurons extracted from embryos of mice (E18) and Neuroblastome SH-SY5Y. For the case of the AuNP a slight decrease of the viability was reported, respect of the controls. Opposited of that, for AuNP-Pep, there exists an increase of the cellular viability that it implies neuroprotección. Likewise the effects of this treatments were evaluated in the mechanisms of cellular death. On the other hand, ROS levels produced by the AuNP and the AuNP-Pep were determined, being observed an increase of these species at early times of incubation Also the synthesis of proteins, in cultures of neurons, was studied and one found an increase in certain proteins that, they would realize, of an effect of "preaconditioning", that helps to activate mechanisms of defence that it will make the neurons in more resistant to injurys

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de memoria. Los oligómeros solubles sinaptotóxicos del péptido β-amiloide (AβOs) son reconocidos como los agentes causantes de la EA. Los AβOs se unen a las neuronas hipocampales e inducen la generación de señales de Ca2+intracelulares persistentes, que se deben a su entrada por el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) y la subsecuente amplificación a través dela activación de los receptores de ryanodina (RyR). Los RyR residen en el retículo endoplasmático (RE) y son activados por Ca2+, liberando Ca2+ desde el lumen de este compartimiento al citoplasma. Las señales de Ca2+ persistentes y de baja intensidad generadas por los AβOs y mediadas por los RyR inducen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares por un mecanismo no del todo dilucidado. Por su parte, los ROS disminuyen el umbral de activación de los RyR por Ca2+, debido a que la actividad de estos receptores está estrechamente regulada por su estado redox. Antecedentes del laboratorio muestran que los AβOs, adicionados en concentraciones subletales a cultivos primarios de neuronas de hipocampo, causan la fragmentación de la red mitocondrial y la disminución de los niveles transcripcionales de la isoforma 2 del RyR (RyR2). Adicionalmente, la incubación previa de las neuronas con el antioxidante general N-acetil-cisteína (NAC) previene la generación de señales de Ca2+ aberrantes y la fragmentación de la red mitocondrial inducida por los AβOs. En la presente tesis, se estudiaron los efectos delos antioxidantes NAC y EUK-134 sobre la disfunción mitocondrial y la disminución de la expresión de RyR2 inducidos por los AβOs. Para cumplir con este objetivo, se trataron cultivos hipocampales de ratas con 0,5 μM AβOs y se evaluó: 1) la generación de ROS en la mitocondria utilizando la sonda MitoSox (que detecta superóxido - O2−·) o la transfección de las neuronas con HyPerMito (que detecta peróxido de hidrógeno -H2O2) por microscopia confocal; 2) la morfología de la red mitocondrial en neuronas cargadas con el marcador mitocondrial MitoTracker, por microscopía confocal; y 3) los niveles transcripcionales de RyR2, por PCR en tiempo real. Los resultados muestran que la incubación de las neuronas con 0,5 μM AβOs generó un aumento lento pero progresivo de la concentración de O2−· y deH2O2mitocondrial. El tratamiento previo con NAC o con EUK-134 previno tanto el aumento de los niveles de O2−· como deH2O2 inducidos por los AβOs. De forma interesante, el tratamiento con ryanodina, un inhibidor de los RyR, también previno el aumento en los niveles de O2−· yH2O2 inducidos por los AβOs, sugiriendo que este efecto es mediado por los RyR. Además, la incubación previa de las neuronas con EUK-134 previno la fragmentación de la red mitocondrial inducida por los AβOs, tal como se demostró con NAC. Por último, la incubación con NAC también previno de forma significativa la disminución de la expresión de RyR2 inducida por los AβOs, sugiriendo que los ROS podrían modular la transcripción de RyR2. Como conclusión, los datos obtenidos en esta tesis apoyan la idea de que los efectos deletéreos de los AβOs sobre la mitocondria y sobre los niveles transcripcionales de RyR2 son mediados por el RyR, cuya actividad es, a su vez, modulada por los ROS. Estos efectos deletéreos de los AβOs son prevenidos farmacológicamente por el uso de antioxidantes como el NAC y el EUK-134 / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive memory loss. Synaptotoxic soluble oligomers of the β-amyloid peptide (AβOs) are recognized as the causative agents of the disease. AβOs bind to hippocampal neurons and elicit persistent intracellular Ca2+ signals, which are due to its entry by the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor and subsequent amplification by the activation of ryanodine receptors (RyR). RyRare resident in endoplasmic reticulum (ER) and are activated by Ca2+, releasing Ca2+ from the lumen of this organelle to the cytoplasm. The persisted RyR-mediated Ca2+ signals generated in neurons in response to AβOs induce the production of reactive oxygen species (ROS), by a mechanism not yet fully elucidated. In turn, ROS decrease the threshold of RyR activation by Ca2+, since RyR activity is tightly regulated by its redox state. Previous works from the laboratory showed that AβOs, added at sublethal concentration to primary cultures of hippocampal neurons, induces mitochondrial network fragmentation, increases the concentration of reactive oxygen species (ROS) and causes deregulation of transcriptional levels of RyR2.Interestingly, previous incubation of neurons with the general antioxidant NAC prevented the generation of aberrant Ca2+ signals and mitochondrial fragmentation induced by AβOs. In this thesis, we studied the protective effects of the antioxidants N-acetyl-cysteine (NAC) and EUK-134 on the mitochondrial dysfunction and the decrease in RyR2 expression induced by AβOs. To this, rat hipocampal neurons were treated with 0,5 μM AβOs to evaluate: 1) Mitochondrial ROS generation, using the MitoSox dye (detects superoxide - O2−·) or the transfection of the neurons with HyPerMito (detects hydrogen peroxide -H2O2) by confocal microscopy; 2) Mitochondrial morphology in neurons loaded with the dye MitoTracker, by confocal microscopy; and 3) RyR2 trascriptional levels, by real time PCR. The results showed that the incubation of neurons with 0.5 μM AβOs generated a slow but progressive increase in the mitochondrial concentration of both O2−· and H2O2. Pretreatment with NAC or EUK-134 prevented this effect. Interestingly, treatment with ryanodine, a RyR inhibitor, also prevented the increase in H2O2 andO2−·in response to AβOs, indicating that RyR mediates this effect. Moreover, preincubation of the neurons with EUK-134 prevented mitochondrial network fragmentation induced AβOs, as previously shown with NAC. Finally, the incubation with NAC also significantly prevented the decrease in RyR2 expression induced by AβOs, indicating that ROS might modulate RyR2 transcription. In conclusion, the data obtained in this study support the idea that the deleterious effects of AβOs on mitochondrial morphology and function and on RyR2expression are mediated by RyR, whose activity is modulated by ROS. These deleterious effects of AβOs are prevented pharmacologically by using antioxidants like NAC and EUK-134

El desafío que plantea el tratamiento de patologías producidas por el plegamiento incorrecto y la agregación de proteínas que dan origen a especies tóxicas, ha llevado a nuestro grupo de investigación al desarrollo de una nueva estrategia terapéutica basada en el empleo de nuevos nanobiomateriales. Nanopartículas de oro (AuNP) conjugadas a péptidos con afinidad por los agregados proteicos tóxicos que desencadenan estas enfermedades, podrían ser dirigidas específicamente a éstos y efectuar localmente una suerte de “cirugía molecular” al ceder la energía que se les puede entregar a través de campos magnéticos oscilantes, convirtiéndolos de esta manera en especies menos tóxicas. Así, esta tesis se enmarca dentro de la primera etapa de este proyecto y pretende obtener conjugados AuNP-Péptidos estables y capaces de unirse selectivamente a los agregados tóxicos de la proteína -amiloide (A) involucrada en la enfermedad de Alzheimer. En consecuencia, se sintetizaron AuNP a través de la reducción de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) con citrato de sodio dihidratado en presencia y ausencia de -ciclodextrinas,se conjugaron al péptido CLPFFDNH2 (INH), péptido modificado a partir del péptido disruptor de láminas  LPFFDNH2 que posee afinidad por los agregados tóxicos de A, y a dos de los isómeros de INH para evaluar si el grado de interacción con los agregados de A es secuencia dependiente. Finalmente, se evaluó la estabilidad de los conjugados obtenidos en diferentes condiciones de pH, temperatura, y fuerza iónica, teniendo en cuenta realidades cercanas a las fisiológicas. Se obtuvieron AuNP con tamaños promedio de 6 y 10 nm, y conjugados AuNP-Péptido que mostraron afinidad por A y ser estables a pHs que se aproximan a los fisiológicos y concentraciones cercanas a 100 mM de NaCl, lo que traza un camino prometedor hacia el desarrollo de esta nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades conformacionales.

Uno de los avances de la nanotecnología es la aplicación de nanopartículas metálicas (NPs) en el campo de la biomedicina. Estas NPs en presencia de campos magnéticos oscilantes (CMO) pueden absorber energía en forma eficaz y disiparla localmente efectuando una especie de cirugía molecular, produciendo la desagregación de agregados proteicos tóxicos o la muerte de células tumorales. La clave para el uso de NPs metálicas es que las mismas puedan dirigirse específicamente al sitio de acción. Mediante el uso de péptidos es posible dirigir selectivamente NPs a agregados tóxicos de la proteína b-amiloide (A ), presentes en cerebro de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer (EA) o a células tumorales en el caso de cáncer. Con este fin, se sintetizaron NPs de oro (AuNPs) y NPs de óxido de hierro (NPs de g−Fe2O3), las cuales se conjugaron a los péptidos BN y RAF que son capaces de reconocer células tumorales y a los péptidos INH, i1 e i2 con capacidad de unirse a los agregados tóxicos de A . Asimismo, para evaluar el grado de toxicidad que presentan estos conjugados, se realizaron ensayos de citotoxicidad en diferentes líneas celulares, mientras que para determinar si los péptidos INH, i1 e i2 conjugados a las NPs mantienen su actividad biológica, se estudió la interacción in vitro de los conjugados con agregados de A . De esta manera, se obtuvieron AuNPs de 12 nm y NPs de g−Fe2O3 de 8 nm conjugadas a los péptidos de interés. Los conjugados de los péptidos INH, i1 e i2 a las AuNPs presentaron un bajo grado de toxicidad in vitro, manteniendo su capacidad de unirse a los agregados tóxicos de Ab. Por otra parte, los mismos péptidos conjugados a NPs de g−Fe2O3 presentaron la toxicidad inherente a las NPs, mientras que las NPs de g−Fe2O3 conjugadas al péptido BN presentaron, de la misma manera, el efecto tóxico propio de las NPs, no incrementándose dicho efecto por la presencia del péptido en cuestión. La conjugación de NPs de g−Fe2O3 con el péptido RAF produjo una disminución de la toxicidad dosis dependiente, posiblemente por un efecto biocompatibilizador del péptido.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Ciencias Farmacéuticas