Tese de mestrado. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 1998

Doctorado en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / El estudio de péptidos como moléculas terapéuticas ha generado gran interés en la industria farmacéutica debido a sus características de alta especificidad y actividad biológica y baja toxicidad. Igualmente, la exploración de nuevos blancos terapéuticos al interior de la célula es bastante atractiva ya que, posibilita la modulación e intervención de procesos intracelulares. En este contexto, disponer de un sistema de expresión recombinante de péptidos en un huésped como Escherichia coli, permitirá potenciar el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos, especialmente en el estudio de péptidos terapéuticos con actividad biológica intracelular y que requieran unión a péptidos de penetración celular como transportador, ya que el tamaño del péptido a sintetizar podría no ser adecuado para su síntesis química en forma eficiente y sustentable. El trabajo realizado consiste en el diseño de un sistema de expresión bacteriana de péptidos potencialmente terapéuticos, con blanco intracelular y que utilicen al péptido de penetración celular Penetratin como transportador, que permita la producción de diversos péptidos con el fin de estudiar su potencial terapéutico. El sistema fue evaluado mediante la expresión de los péptidos p53pAnt y PNC27, los cuales han mostrado tener actividad biológica antitumoral in vitro. Se diseñó el vector pET31HT que permite la expresión de los péptidos fusionados a la proteína cetoesteroide isomerasa (KSI) en una forma tal que puedan ser posteriormente separados y obtenidos con su secuencia original mediante corte con Trombina. Utilizando técnicas de ingeniería genética se construyó el vector de expresión diseñado. Para la implementación del sistema, se clonó las secuencias nucleotídicas correspondientes a los péptidos p53pAnt y PNC27 en el vector pET31HT. Se logró la producción de los péptidos fusionados en células transformadas con las construcciones pET31HT-p53pAnt y pET31HT-PNC27. La expresión se obtuvo en forma de cuerpos de inclusión y se determinó que los niveles de expresión de proteína recombinante se mantienen constantes y alrededor del 20% del peso seco celular, para distintas condiciones de inducción. Los péptidos fusionados fueron purificados desde la fracción de proteína insoluble por cromatografía de afinidad en condiciones desnaturantes. Mediante una estrategia que incluye precipitación por dilución y solubilización de las muestras en un buffer específico, se logró la separación del péptido p53pAnt de la proteína KSI en un proceso de proteólisis altamente eficiente. Sin embargo, no se logró separar al péptido PNC27 desde la proteína de fusión probablemente debido a la rigidez impuesta por sus aminoácidos iniciales a la región de reconocimiento de la proteasa. El péptido p53pAnt fue purificado desde el producto de digestión, según la estrategia diseñada, obteniéndose un péptido altamente puro. Las características del sistema, en conjunto con el proceso de purificación desarrollado, permiten la síntesis biológica de péptidos con una productividad mayor a 30 mg/g de peso seco celular y con una pureza de al menos un 95%. Con esto, el sistema diseñado es apropiado para su uso en la producción de péptidos para investigación científica.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química. Ingeniera Civil en Biotecnología / El estudios de Streptomyces, bacterias Gram positivas del filo Actinobacteria y cosmopolitas (encontradas en diferentes tipos de ambientes), ha llevado al descubrimiento de un gran número de metabolitos secundarios con potencial terapéutico. Uno de los nuevos tipos de moléculas producidas por estas bacterias son los lazo péptidos. Estos se caracterizan por formar un lazo dentro de su estructura y por presentar actividad antimicrobiana, citotóxica contra diferentes líneas celulares de cáncer y actividad inhibitoria de la replicación de ciertos virus, entre otras. Nuevos estudios han hallado cepas de Streptomyces en ambientes extremos. Una de ellas es la cepa Streptomyces sp. HST28 aislada desde el Salar de Huasco en el norte chileno. Análisis de actividad realizados a este organismo arrojaron potencial antibiótico, antifúngico y citotóxico, además su genoma fue secuenciado dando paso a la realización de minería de genomas sobre su secuencia. El presente trabajo se enfocó en la identificación de los lazo péptidos presentes en Streptomyces sp. HST28 y su caracterización. Para esto se utilizó la estrategia de minería de genomas ubicando los clústers de genes de estos péptidos, luego estos clústers fueron reconstruidos de manera bioinformática. Como segunda etapa se realizó la expresión heteróloga de cada lazo péptido empleando como huésped Streptomyces coelicolor M1152 y M1154. Una vez clonados se detectó el péptido a través de espectrometría de masa y se evaluó su la actividad. Paralelamente al estudio de laboratorio se realizó una investigación in silico de cada lazo péptido creando modelos por homología de secuencia y estructurales, usando como plantilla o molde lazo péptidos ya descritos y caracterizados estructuralmente, buscando similitudes en campos electrostáticos, distribuciones de hidrofobicidad y espaciales. Se encontraron cuatro clústers de genes de lazo péptidos en el genoma de Streptomyces sp. HST28, nombrados como LP1, LP2, LP3 y LP4. Tres de estos lazo péptidos fueron clasificados como clase II y uno de clase I (LP1). La organización de sus clústers es acorde a lo encontrado en bibliografía a excepción del de LP3. Las secuencias codificantes para los cuatro péptidos se clonaron en el vector pIJ10257, que posee el promotor constitutivo ermE*. Solo LP1 y LP3 fueron clonados exitosamente en S. colelicolor M1152, el producto predicho para LP1 no fue encontrado en los clones analizados por espectrometría de masa. En la investigación in silico se logró modelar los cuatro lazo péptidos y se realizó una comparación preliminar con otras estructuras, deduciendo que es posible implementar esta metodología para tener una aproximación del comportamiento de estas moléculas.

[ES] Esta tesis doctoral titulada "Evaluación preclínica de estrategias basadas en la senescencia para mejorar la terapia contra el cáncer" se centra en explotar la senescencia como opción terapéutica en los tratamientos contra el cáncer mediante el diseño, la síntesis y la evaluación in vitro e in vivo de varios nanodispositivos y profármacos, así como la identificación de un nuevo fármaco senolítico. En el primer capítulo experimental evaluamos el efecto negativo de la senescencia endotelial en el contexto tumoral y la consecuencia de su eliminación mediante el uso del senolítico navitoclax. Comprobamos que el tratamiento sistémico con palbociclib en un modelo ortotópico de cáncer de mama en ratones induce senescencia en las células endoteliales vasculares, generando un endotelio alterado funcionalmente que favorece la migración de células cancerosas. La recuperación de la funcionalidad endotelial se consigue con una estrategia terapéutica que, tras la inducción de senescencia con palbociclib, elimina las células senescentes (senólisis) con la nanopartícula (NP(nav)-Gal). En el modelo preclínico, el tratamiento combinado de palbociclib con NP(nav)-Gal disminuyó la senescencia endotelial en venas, así como los nódulos metastásicos en los pulmones. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, el capítulo dos se describe una estrategia terapéutica en dos pasos similar a la anterior para cáncer de mama triple negativo. En este caso se emplea un modelo de ratón implantado con xenoinjertos humanos de este tipo de cáncer para evaluar el efecto de la terapia combinada de palbociclib y navitoclax. Para superar los efectos secundarios del tratamiento con navitoclax (principalmente trombocitopenia), evaluamos el efecto del profármaco nav-Gal. La senescencia inducida por la terapia con palbociclib, seguida de una terapia adyuvante con navitoclax o nav-Gal, provoca la eliminación sinérgica de las células senescentes tumorales y la reducción del crecimiento tumoral y de la metástasis pulmonar en el modelo utilizado de ratones con xenoinjertos de cáncer de mama humano agresivo. El capítulo tres se centra en el diseño y el desarrollo de un nuevo sistema de comunicación de nanopartículas por estigmergía para mejorar la terapia tumoral en el cáncer de mama. La comunicación de nanopartículas por estigmergía consiste en un sistema secuencial de dos nanopartículas en la que la primera modifica el entorno permitiendo que la segunda nanopartícula pueda actuar. Para ello, nos basamos de nuevo en una terapia en dos pasos, siendo el primer paso la inducción de senescencia con palbociclib en las células tumores y el segundo su posterior eliminación con navitoclax. Con este objetivo, se prepararon dos nanodispositivos: el primer nanodispositivo (NP(palbo)PEG-MUC1) se cargó con palbociclib y se funcionalizó con un aptámero dirigido a la proteína de superficie MUC1, frecuentemente sobreexpresada en las células tumorales de mama; para el segundo nanodispositivo se empleó la nanopartícula senolítica NP(nav)-Gal. Cuando ambas nanopartículas se administraron secuencialmente se consiguió un efecto aumentado, retrasando el crecimiento tumoral y reduciendo las metástasis en pulmón en el modelo descrito previamente de ratones con xenoinjerto hTNBC. En el último capítulo identificamos un nuevo agente senolítico (H14) que puede eliminar a las células tumorales senescentes de melanoma con una eficacia y seguridad óptima in vivo. Para ello, se realizó un cribado de una biblioteca combinatoria de hexapéptidos de D-aminoácidos en células senescentes de melanoma SK-Mel-103, en las que la inducción de la senescencia se había producido mediante el tratamiento con palbociclib. El tratamiento combinado de palbociclib y el hexapéptido H14 logró una mejora en la eliminación de células tumorales senescentes in vivo, así como en la reducción del crecimiento tumoral, alcanzando efectos similares al tratamiento combinado de palbociclib con navitoclax. / [CA] Aquesta tesi doctoral titulada "Avaluació preclínica d'estratègies basades en la senescència per millorar la teràpia contra el càncer" se centra a explotar la senescència com a opció terapèutica en els tractaments contra el càncer mitjançant el disseny, la síntesi i l'avaluació in vitro i in vivo diversos nanodispositius i profàrmacs, així com la identificació d'un nou fàrmac senolític. Al primer capítol experimental avaluem l'efecte negatiu de la senescència endotelial en el context tumoral i la conseqüència de la seva eliminació mitjançant l'ús del senolític navitoclax. Comprovem que el tractament sistèmic amb palbociclib en un model ortotòpic de càncer de mama en ratolins indueix senescència a les cèl·lules endotelials vasculars, generant un endoteli alterat funcionalment que afavoreix la migració de cèl·lules canceroses. La recuperació de la funcionalitat endotelial s'aconsegueix amb una estratègia terapèutica que, després de la inducció de senescència amb palbociclib, elimina les cèl·lules senescents (senòlisi) amb la nanopartícula (NP(nav)-Gal). En el model preclínic, el tractament combinat de palbociclib amb NP(nav)-Gal va disminuir la senescència endotelial en venes, així com els nòduls metastàsics als pulmons. Tenint en compte els resultats obtinguts, el capítol dos es descriu una estratègia terapèutica en dos passos similar a l'anterior per al càncer de mama triple negatiu. En aquest cas es fa servir un model de ratolí implantat amb xenoempelts humans d'aquest tipus de càncer per avaluar l'efecte de la teràpia combinada de palbociclib i navitoclax. Per superar els efectes secundaris del tractament amb navitoclax (principalment trombocitopènia), avaluem l'efecte del profàrmac nav-Gal. La senescència induïda per la teràpia amb palbociclib, seguida d'una teràpia adjuvant amb navitoclax o nav-Gal, provoca l'eliminació sinèrgica de les cèl·lules senescents tumorals i la reducció del creixement tumoral i de la metàstasi pulmonar en el model utilitzat de ratolins amb xenoempelts de càncer de mama humà agressiu. El capítol tres se centra en el disseny i desenvolupament d'un nou sistema de comunicació de nanopartícules per estigmergia per millorar la teràpia tumoral al càncer de mama. La comunicació de nanopartícules per estigmergia consisteix en un sistema seqüencial de dues nanopartícules on la primera modifica l'entorn permetent que la segona nanopartícula pugui actuar. Per això, ens basem de nou en una teràpia en dos passos, sent el primer pas la inducció de senescència amb palbociclib a les cèl·lules tumors i el segon la posterior eliminació amb navitoclax. Amb aquest objectiu, es van preparar dos nanodispositius: el primer nanodispositiu (NP(palbo)PEG-MUC1) es va carregar amb palbociclib i es va funcionalitzar amb un aptàmer dirigit a la proteïna de superfície MUC1, freqüentment sobreexpressada a les cèl·lules tumorals de mama; per al segon nanodispositiu es va emprar la nanopartícula senolítica NP(nav)-Gal. Quan ambdues nanopartícules es van administrar seqüencialment es va aconseguir un efecte augmentat, endarrerint el creixement tumoral i reduint les metàstasis en pulmó en el model descrit prèviament de ratolins amb xenoempelt hTNBC. A l'últim capítol identifiquem un nou agent senolític (H14) que pot eliminar les cèl·lules tumorals senescents de melanoma amb una eficàcia i seguretat òptima in vivo. Per fer-ho, es va realitzar un cribratge d'una biblioteca combinatòria d'hexapèptids de D-aminoàcids en cèl·lules senescents de melanoma SK-Mel-103, on la inducció de la senescència s'havia produït mitjançant el tractament amb palbociclib. El tractament combinat de palbociclib i l'hexapèptid H14 va aconseguir una millora en l'eliminació de cèl·lules tumorals senescents in vivo, així com en la reducció del creixement tumoral, aconseguint efectes similars al tractament combinat de palbociclib amb navitoclax. / [EN] This PhD thesis entitled "Preclinical evaluation of senescence-based strategies to improve cancer therapy" focuses on exploiting senescence as a therapeutic option in cancer treatments through design, synthesis and in vitro and in vivo evaluation. of several nanodevices and prodrugs, as well as the identification of a new senolytic drug. In the first experimental chapter we evaluated the negative effect of endothelial senescence in the tumor context and the consequence of its elimination through the use of the senolytic navitoclax. We found that systemic treatment with palbociclib in an orthotopic model of breast cancer in mice induces senescence in vascular endothelial cells, generating a altered endothelium that favors the migration of cancer cells. Recovery of endothelial functionality was achieved, after palbociclib-senescence induction, by removal of senescent cells (senolysis) with navitoclax-loaded nanoparticles (NP(nav)-Gal). In a preclinical model, the combined treatment of palbociclib with NP(nav)-Gal decreased endothelial senescence in veins as well as in metastatic nodules in the lungs. Taking into account the results obtained, chapter two describes a similar therapeutic strategy for triple-negative breast cancer. In this case, a human xenograft mice model was employed to evaluate the effect of combined therapy of palbociclib plus navitoclax. To overcome the side effects of navitoclax treatment (mainly thrombocytopenia), we evaluated the effect of the prodrug nav-Gal. Palbociclib therapy-induced senescence, followed by adjuvant navitoclax or nav-Gal therapy, resulted in synergistic clearance of senescent tumor cells and reduction of tumor growth and lung metastasis in the xenograft mice model of aggressive human TNBC. Chapter three focuses on the design and development of a new stigmergy nanoparticle communication system to improve tumor therapy in breast cancer. The communication of nanoparticles by stigmergy consists of a sequential system of two nanoparticles in which the first modifies the environment allowing the second nanoparticle to act. To do this, we again rely on a two-step therapy, the first step being the induction of senescence with palbociclib in tumor cells and the second its subsequent elimination with navitoclax. To this end, two nanodevices were prepared: the first nanodevice (NP(palbo)PEG-MUC1) was loaded with palbociclib and functionalized with an aptamer targeting the surface protein MUC1, frequently overexpressed in breast tumor cells; for the second nanodevice, the senolytic nanoparticle NP(nav)-Gal was used. When both nanoparticles were administered sequentially, an increased effect was achieved, delaying tumor growth and reducing lung metastases in the previously described model of hTNBC xenograft mice. In the last chapter we identified a new senolytic agent (H14) that can kill senescent melanoma tumor cells with optimal efficacy and safety in vivo. For this, a combinatorial library of D-amino acid hexapeptides was screened in senescent SK-Mel-103 melanoma cells, in which senescence induction had occurred by treatment with palbociclib. The combined treatment of palbociclib and H14 hexapeptide achieved an improvement in the elimination of senescent tumor cells in vivo, as well as in the reduction of tumor growth, reaching similar effects to the combined treatment of palbociclib and navitoclax. Future breakthroughs in the field of cellular senescence treatment are expected. We hope that the results achieved in this PhD thesis will open new research opportunities and inspire the development of advanced strategies with smart nanodevices and prodrugs for their application in the field of cellular senescence and other different biomedical areas and in sensing and communication technologies to solve patient needs. / Estepa Fernández, A. (2022). Preclinical evaluation of senescence-based strategies to improve cancer therapy [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/188845