Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El receptor de ryanodina tipo 2 (RyR2) desempeña un papel crucial en el corazón ya que permite la salida de calcio desde el retículo sarcoplasmático para activar la contracción, por tanto la regulación de sus niveles es vital para el buen funcionamiento del cardiomiocito. El RyR2 cardiaco se degrada en patologías como la isquemia/reperfusión (I/R), por tanto el balance entre los diferentes sistemas de degradación de proteínas puede ser trascendental en su homeostasis. Para determinar si el lisosoma, a través de la autofagia mediada por chaperonas (AMC) participa en la degradación del RyR2 se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas estimuladas con geldanamicina (GA). Esta droga es un clásico inductor de esta vía degradativa. En presencia de GA, el contenido del RyR2 disminuye 50% respecto al control. La prevención del aumento de especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas por GA evitó la degradación del RyR2. Sin embargo, esta inhibición de EROs no impidió la activación de la AMC observados previamente en presencia de GA. Por otra parte, la presencia de GA aumentó la aparición de fragmentos del RyR2 en el citosol, lo cual no se observó al inhibir la generación de EROs. A diferencia de lo observado en el modelo de I/R, las calpaínas no estarían implicadas en la proteólisis del RyR2, dado que no se observó aumento en su activación en presencia de GA. Sin embargo, se determinó la participación de las presenilinas en la proteólisis del RyR2 durante el estímulo con GA. El conjunto de estos datos sugieren que el aumento de las EROs podrían mediar la oxidación de RyR2. Las presenilinas podrían estar implicadas en la proteólisis intramembrana que permitiría la salida de los fragmentos de RyR2 al citosol para su posterior degradación a través de la autofagia mediada por chaperonas. / Ryanodine receptor type 2 (RyR2) has a key role in the heart, releasing calcium from the sarcoplasmic reticulum to activate myocardial contraction. Therefore, RyR2 level and activity are required for the proper cardiomyocyte function and an adequate balance between its synthesis and degradation is important in calcium homeostasis. Our aim was to determine the involvement of chaperone-mediated autophagy (CMA) on RyR2 degradation. To test this, primary cultured cardiomyocytes were exposed to geldanamycin (GA) to induce CMA. Our results show that GA decreased in 50% RyR2 level as compared to control. The antioxidant n-acetyl cisteine also prevented RyR2 degradation but no increase in LAMP-2A levels were observed. ROS inhibition also induced a decrease in cytosolic fragments of RyR2. No increase in calpain activity was detected using α-spectrin as specific substrate. However, the role of presenilin on RyR2 degradation was evidenced using the specific inhibitor compound E. Taken together, these data suggest that ROS increase could mediate RyR2 oxidation and presenilins could be implicated in RyR2 intramembrane proteolysis which allowed the release of RyR2 fragments to the cytosol and to induce its degradation through CMA. / FONDAP; FONDECYT

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de memoria. Los oligómeros solubles sinaptotóxicos del péptido β-amiloide (AβOs) son reconocidos como los agentes causantes de la EA. Los AβOs se unen a las neuronas hipocampales e inducen la generación de señales de Ca2+intracelulares persistentes, que se deben a su entrada por el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) y la subsecuente amplificación a través dela activación de los receptores de ryanodina (RyR). Los RyR residen en el retículo endoplasmático (RE) y son activados por Ca2+, liberando Ca2+ desde el lumen de este compartimiento al citoplasma. Las señales de Ca2+ persistentes y de baja intensidad generadas por los AβOs y mediadas por los RyR inducen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares por un mecanismo no del todo dilucidado. Por su parte, los ROS disminuyen el umbral de activación de los RyR por Ca2+, debido a que la actividad de estos receptores está estrechamente regulada por su estado redox. Antecedentes del laboratorio muestran que los AβOs, adicionados en concentraciones subletales a cultivos primarios de neuronas de hipocampo, causan la fragmentación de la red mitocondrial y la disminución de los niveles transcripcionales de la isoforma 2 del RyR (RyR2). Adicionalmente, la incubación previa de las neuronas con el antioxidante general N-acetil-cisteína (NAC) previene la generación de señales de Ca2+ aberrantes y la fragmentación de la red mitocondrial inducida por los AβOs. En la presente tesis, se estudiaron los efectos delos antioxidantes NAC y EUK-134 sobre la disfunción mitocondrial y la disminución de la expresión de RyR2 inducidos por los AβOs. Para cumplir con este objetivo, se trataron cultivos hipocampales de ratas con 0,5 μM AβOs y se evaluó: 1) la generación de ROS en la mitocondria utilizando la sonda MitoSox (que detecta superóxido - O2−·) o la transfección de las neuronas con HyPerMito (que detecta peróxido de hidrógeno -H2O2) por microscopia confocal; 2) la morfología de la red mitocondrial en neuronas cargadas con el marcador mitocondrial MitoTracker, por microscopía confocal; y 3) los niveles transcripcionales de RyR2, por PCR en tiempo real. Los resultados muestran que la incubación de las neuronas con 0,5 μM AβOs generó un aumento lento pero progresivo de la concentración de O2−· y deH2O2mitocondrial. El tratamiento previo con NAC o con EUK-134 previno tanto el aumento de los niveles de O2−· como deH2O2 inducidos por los AβOs. De forma interesante, el tratamiento con ryanodina, un inhibidor de los RyR, también previno el aumento en los niveles de O2−· yH2O2 inducidos por los AβOs, sugiriendo que este efecto es mediado por los RyR. Además, la incubación previa de las neuronas con EUK-134 previno la fragmentación de la red mitocondrial inducida por los AβOs, tal como se demostró con NAC. Por último, la incubación con NAC también previno de forma significativa la disminución de la expresión de RyR2 inducida por los AβOs, sugiriendo que los ROS podrían modular la transcripción de RyR2. Como conclusión, los datos obtenidos en esta tesis apoyan la idea de que los efectos deletéreos de los AβOs sobre la mitocondria y sobre los niveles transcripcionales de RyR2 son mediados por el RyR, cuya actividad es, a su vez, modulada por los ROS. Estos efectos deletéreos de los AβOs son prevenidos farmacológicamente por el uso de antioxidantes como el NAC y el EUK-134 / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive memory loss. Synaptotoxic soluble oligomers of the β-amyloid peptide (AβOs) are recognized as the causative agents of the disease. AβOs bind to hippocampal neurons and elicit persistent intracellular Ca2+ signals, which are due to its entry by the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor and subsequent amplification by the activation of ryanodine receptors (RyR). RyRare resident in endoplasmic reticulum (ER) and are activated by Ca2+, releasing Ca2+ from the lumen of this organelle to the cytoplasm. The persisted RyR-mediated Ca2+ signals generated in neurons in response to AβOs induce the production of reactive oxygen species (ROS), by a mechanism not yet fully elucidated. In turn, ROS decrease the threshold of RyR activation by Ca2+, since RyR activity is tightly regulated by its redox state. Previous works from the laboratory showed that AβOs, added at sublethal concentration to primary cultures of hippocampal neurons, induces mitochondrial network fragmentation, increases the concentration of reactive oxygen species (ROS) and causes deregulation of transcriptional levels of RyR2.Interestingly, previous incubation of neurons with the general antioxidant NAC prevented the generation of aberrant Ca2+ signals and mitochondrial fragmentation induced by AβOs. In this thesis, we studied the protective effects of the antioxidants N-acetyl-cysteine (NAC) and EUK-134 on the mitochondrial dysfunction and the decrease in RyR2 expression induced by AβOs. To this, rat hipocampal neurons were treated with 0,5 μM AβOs to evaluate: 1) Mitochondrial ROS generation, using the MitoSox dye (detects superoxide - O2−·) or the transfection of the neurons with HyPerMito (detects hydrogen peroxide -H2O2) by confocal microscopy; 2) Mitochondrial morphology in neurons loaded with the dye MitoTracker, by confocal microscopy; and 3) RyR2 trascriptional levels, by real time PCR. The results showed that the incubation of neurons with 0.5 μM AβOs generated a slow but progressive increase in the mitochondrial concentration of both O2−· and H2O2. Pretreatment with NAC or EUK-134 prevented this effect. Interestingly, treatment with ryanodine, a RyR inhibitor, also prevented the increase in H2O2 andO2−·in response to AβOs, indicating that RyR mediates this effect. Moreover, preincubation of the neurons with EUK-134 prevented mitochondrial network fragmentation induced AβOs, as previously shown with NAC. Finally, the incubation with NAC also significantly prevented the decrease in RyR2 expression induced by AβOs, indicating that ROS might modulate RyR2 transcription. In conclusion, the data obtained in this study support the idea that the deleterious effects of AβOs on mitochondrial morphology and function and on RyR2expression are mediated by RyR, whose activity is modulated by ROS. These deleterious effects of AβOs are prevented pharmacologically by using antioxidants like NAC and EUK-134